李　波，王遠(yuǎn)萍，段浩博，劉可可，唐思嘉，周　樂，孫宏晨

(吉林大學(xué)口腔醫(yī)院實驗教學(xué)中心，吉林 長春 130021)

微流控是一種以微組裝結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)并在顯微尺度處理流體的操作技術(shù)，其具體操作是處理低體積流體以實現(xiàn)自動化和高通量篩選，通常在亞毫米的規(guī)模對流體實施精確的控制和操縱，流體被移動、混合、分離或以其他方式處理。近年來,微流控技術(shù)在醫(yī)學(xué)的應(yīng)用日漸展現(xiàn)其獨特貢獻(xiàn)，電穿孔、熱偏差與流體剪切應(yīng)力相繼應(yīng)用于微流控系統(tǒng)設(shè)計。微流控技術(shù)與傳統(tǒng)膜中斷技術(shù)結(jié)合為新一代細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的建立提供了新思路。本文作者以細(xì)胞的體外轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)為例，綜合闡述微流控技術(shù)與傳統(tǒng)膜中斷技術(shù)結(jié)合的具體機(jī)制，歸納研究現(xiàn)狀及尚未解決問題，為微流控體外細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)提供一個較為全面和詳細(xì)的框架。

1　微流控技術(shù)

20世紀(jì)60年代初集成電路的發(fā)明實現(xiàn)了小型化、微電子的影響潮流，集成電路的微加工技術(shù)縮減了流體系統(tǒng)形成第1代系統(tǒng)——氣相色譜法(gas chromatography，GC)[1]。20世紀(jì)80年代初形成微流體學(xué)，用于噴墨打印頭、DNA芯片、芯片實驗室技術(shù)、微推進(jìn)和微熱技術(shù)的開發(fā)。20世紀(jì)90年代，微型機(jī)械系統(tǒng)開始應(yīng)用于微流體學(xué)[2]。源于半導(dǎo)體工業(yè)的微流控技術(shù)，吸納微機(jī)電系統(tǒng)(MEMS)自成一體，經(jīng)常被稱為微型全分析系統(tǒng)(μTAS)或芯片實驗室裝置[3]。微流控是一種以微組裝結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)在顯微尺度處理流體的操作技術(shù)[4]。微流控裝置的核心元素為微孔道、室和閥門，用以完成嚴(yán)格復(fù)雜的操作[4]，其原理包括微量流體層流、低擴(kuò)散率、流體表面效應(yīng)以及電動力學(xué)[1]。由于樣品處理快、用量小、流體分析時控制精確，大幅度減少了樣品和試劑的損耗量，微流控技術(shù)迅速取代了傳統(tǒng)的實驗操作[3]，成為備受矚目的新技術(shù)。微流控應(yīng)用于化學(xué)、工程、生物和藥品等眾多領(lǐng)域。微流控在生物醫(yī)學(xué)的應(yīng)用主要包括以下幾個方面[4]：分子水平的核酸、蛋白質(zhì)分析；細(xì)胞水平研究細(xì)胞力學(xué)、細(xì)胞遷移、細(xì)胞分離、細(xì)胞分類還有單個細(xì)胞分析；材料轉(zhuǎn)運(yùn)；仿生設(shè)計的材料轉(zhuǎn)運(yùn)和藥物投遞芯片。

2　體外細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)

2.1傳統(tǒng)的膜中斷技術(shù)除了載體介導(dǎo)的核酸轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)[5]，基于膜中斷技術(shù)的體外轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)也備受關(guān)注[6]。膜中斷技術(shù)主要應(yīng)用物理方法例如機(jī)械、電擊、熱力、光學(xué)和化學(xué)因素使細(xì)胞膜形成暫時的斷裂[6]，使轉(zhuǎn)運(yùn)物質(zhì)直接穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞。以下為幾種傳統(tǒng)的膜中斷方法：化學(xué)方法包括膜活性肽、洗滌劑和穿孔毒素[7]；機(jī)械中斷方法如高速粒子穿透作用、流體剪切應(yīng)力作用[8]和靜水壓/滲透壓的壓力作用[9]；顯微注射法[10]；熱偏差法[6]；電穿孔等。傳統(tǒng)的膜中斷技術(shù)有3個明顯不足[6]：①傳統(tǒng)的膜中斷技術(shù)會造成細(xì)胞膜不同程度的損傷，損傷程度小阻礙納米顆粒的有效投遞，損傷程度大導(dǎo)致細(xì)胞損傷；②吞吐量和可伸縮性(如顯微注射)差；③細(xì)胞恢復(fù)不充分，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。例如熱擊和電擊將導(dǎo)致蛋白質(zhì)失活和細(xì)胞損傷。而近年來，通過微流控操作劑微流控平板或微流控芯片實現(xiàn)的膜中斷技術(shù)有效地彌補(bǔ)了傳統(tǒng)膜中斷技術(shù)的不足。細(xì)胞的材料轉(zhuǎn)運(yùn)尤其強(qiáng)調(diào)基于膜中斷技術(shù)的投遞方法以及納米技術(shù)、微流控和實驗室芯片技術(shù)在該領(lǐng)域的應(yīng)用。

2.2新一代體外轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)新一代轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的建立對基于細(xì)胞治療和基因編輯的再生醫(yī)學(xué)和基礎(chǔ)生物學(xué)十分必要[6]，臨床試驗中基于體外細(xì)胞治療的有效案例主要包括造血干細(xì)胞[11]和T細(xì)胞的免疫治療[12]。基因編輯可應(yīng)用于抗腫瘤免疫治療[13]。向多種細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)多種不同材料是新一代轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)面臨的主要挑戰(zhàn)[6]。相對于傳統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，新一代轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)主要有4個特點：①改進(jìn)了傳統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，細(xì)胞損傷??；②極大地提高了轉(zhuǎn)運(yùn)效率和吞吐量；③為細(xì)胞靶向物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)提供了新思路；④安全性高，體外物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)對臨床應(yīng)用具有借鑒意義。

3　微流控在基于膜中斷技術(shù)的體外轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)中的應(yīng)用

3.1 微流控與電穿孔結(jié)合與傳統(tǒng)的整體電穿孔不同，通過微流控裝置實現(xiàn)的電穿孔技術(shù)根據(jù)細(xì)胞的規(guī)模定位電擊領(lǐng)域，進(jìn)而降低電壓(傳統(tǒng)方法所需為100 V)、提高熱量耗散速率[14]，降低對細(xì)胞的損傷并且極大地提高了轉(zhuǎn)運(yùn)效率[15]。恒定直流電壓可以造成水流中細(xì)胞電穿孔，Geng等[16]進(jìn)行如下設(shè)計使恒定電壓的強(qiáng)度和頻率根據(jù)細(xì)胞流動時收縮程度變化，主通道設(shè)置一部分收縮部，脈沖強(qiáng)度由主通道和收縮部之間的橫截面比決定，而頻率有細(xì)胞流過的速度決定。根據(jù)不同類型細(xì)胞的直徑確定收縮部的管道直徑和水流速度，選擇適合的電壓強(qiáng)度和頻率。Garcia等[17]設(shè)計了一個微流控系統(tǒng)提高了細(xì)菌細(xì)胞電轉(zhuǎn)運(yùn)的效率和吞吐量，微流控裝置非均一收縮的微管道使相對較小的電壓形成了一個高電流區(qū)域。流體動力學(xué)的介入，比之傳統(tǒng)電穿孔方法，轉(zhuǎn)運(yùn)效率提高了4倍，吞吐量提高了100～1 000倍。對比于傳統(tǒng)的操作技術(shù)，微流控技術(shù)的應(yīng)用為新一代細(xì)胞投遞系統(tǒng)提供了新思路。

3.2微流控與熱偏差法結(jié)合傳統(tǒng)的熱偏差法雖然能夠?qū)崿F(xiàn)細(xì)胞內(nèi)的材料投遞，但會嚴(yán)重?fù)p傷細(xì)胞功能。微流控裝置為局域或部分實行熱中斷技術(shù)提供了可能。實際上，熱噴墨打印機(jī)處理的細(xì)胞溶液證明了基因轉(zhuǎn)染的成功，但不清楚細(xì)胞的膜中斷實現(xiàn)是源自噴嘴處的流體剪切效應(yīng)，還是溫度尖峰或兩者均有[18]。由高聚焦超聲熱觸發(fā)的藥物釋放已經(jīng)成為一種重要的藥物投遞方法，這種方法根據(jù)脂質(zhì)對溫度敏感的特點，能夠?qū)⒛芰烤劢褂谝欢▍^(qū)域從而減少對細(xì)胞的損傷。當(dāng)攜帶藥物的脂質(zhì)體隨血液循環(huán)到達(dá)患處，高聚焦超聲熱觸發(fā)使患處細(xì)胞通透性增加，實現(xiàn)靶向給藥[19]。Meng等[19]建立了一個微流控模型探討其機(jī)制，微流控裝置由40對環(huán)形電極組成，鑲嵌在1 mm厚、128°Y旋轉(zhuǎn)和X傳播的LiNbO3基板上，并由單相位單向換能器操控。微流控裝置中央放置一個材料為聚二甲基硅氧烷(PDMS)的微型細(xì)胞培養(yǎng)皿保證溫度不變，小鼠乳腺癌細(xì)胞通過聚-L-賴氨酸黏附在PDMS表面，加入封裝多柔吡星的脂質(zhì)體。該實驗檢測細(xì)胞溫度、應(yīng)力變化并闡明其作用機(jī)制，結(jié)果顯示：低熔點的脂質(zhì)在熱能作用下通透性發(fā)生變化，聲波輻射力使細(xì)胞膜損傷。雖然已有以上研究，但熱偏差法的作用機(jī)制仍未完全解決。

3.3 微流控與納米芽膜結(jié)合納米芽管作為生物分子向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的通道確保持續(xù)的物質(zhì)釋放[20]，Xu等[21]利用納米芽管轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)將功能性探針轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜內(nèi)，Xu等[22]將納米芽膜與微流控結(jié)合建立了一個有趣的細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。在納米芽膜表面形成密度為3 × 107cm-2、直徑為100 nm的顯微孔道，猶如在納米膜表面建立極密的顯微注射針。將納米芽膜襯于微流控平板培養(yǎng)室底，培養(yǎng)室通過納米芽膜與其下100 μm深、0.5 mm寬的流體通道相同，當(dāng)溶有轉(zhuǎn)運(yùn)物質(zhì)的流體快速流經(jīng)顯微孔道時，便可通過納米芽膜的針刺作用完成細(xì)胞的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)。

3.4微流控與機(jī)械力結(jié)合機(jī)械擾動的膜中斷技術(shù)主要包括黏附細(xì)胞的刮擦和珠粒負(fù)載[23]或由小規(guī)格針頭重復(fù)抽吸排出的懸浮液中的細(xì)胞[24]?，F(xiàn)代微流控技術(shù)可以增加機(jī)械力的精確度，例如細(xì)胞擠壓的原理是細(xì)胞在通過細(xì)胞直徑的約一半至三分之一的微流體收縮時快速變形，蛋白質(zhì)、核酸、量子點、碳納米管和其他納米材料已被證明可以通過這種方式遞送[25]。Saung等[26]設(shè)計了一個微流控裝置，在微流控平板的孔道上設(shè)置一個收縮部，根據(jù)不同類型的細(xì)胞直徑確定收縮部的孔道直徑和孔道長度，細(xì)胞通過收縮部時出現(xiàn)暫時的破壞，載體即可進(jìn)入細(xì)胞。

椎板黏度計表面由固體變成液體時可以產(chǎn)生一個確定的剪切應(yīng)力，能夠使單層細(xì)胞頂層細(xì)胞膜瞬時透化[27]。根據(jù)這一現(xiàn)象設(shè)計了微流控裝置，微流控的微孔道為由直徑300 μm漸變?yōu)?0 μm的錐形孔道，可以根據(jù)細(xì)胞流速產(chǎn)生相應(yīng)的剪切應(yīng)力[28]。但是剪切應(yīng)力不易重復(fù)控制，需輔以微米尺寸的空化氣泡[29]，19世紀(jì)80年代引入了一種新的滲透化方法[30]，即聲波作用可以在溶液中產(chǎn)生空化氣泡[31]。然而，最近多個公開的數(shù)據(jù)集分析表明超聲主要對遞送具有大于50%效率或50%活性的體外分子具有較好的成果[31]。這歸因于隨機(jī)和劇烈空化的操作機(jī)制是異質(zhì)的，一些細(xì)胞經(jīng)歷過度損傷，而其他細(xì)胞則不受影響[32-33]。空化氣泡的精確定位為靶向空化提供了良好開端。

4　結(jié)　語

目前，世界各地研究機(jī)構(gòu)和臨床中心使用的細(xì)胞內(nèi)材料遞送方法主要為基于病毒載體、脂質(zhì)體載體和電穿孔等實驗方法，這些已建立的方法具有機(jī)制復(fù)雜、安全性小及其對細(xì)胞行為不可預(yù)測的影響等缺點，明顯地限制了生物實驗的范圍并降低了潛在有希望的細(xì)胞治療概念的功效。因此，安全有效的細(xì)胞投遞系統(tǒng)的建立對細(xì)胞實驗十分重要，并且對細(xì)胞治療和基因治療等臨床應(yīng)用具有推動作用[6]。近年來，微流控技術(shù)在細(xì)胞水平和分子水平的應(yīng)用具有巨大進(jìn)展。微流控為細(xì)胞內(nèi)的材料以及生物大分子的遞送提供了良好平臺，尤其是與基于膜中斷技術(shù)的傳統(tǒng)遞送方法結(jié)合，建立了系統(tǒng)的微流控模型。而且微流控技術(shù)為細(xì)胞的靶向遞送提供了新思路，對于不同類型的細(xì)胞已有相應(yīng)類型的遞送材料或生物分子，微流控裝置和微流控技術(shù)未來極有可能實現(xiàn)向不同系別的細(xì)胞投遞不同分子的商業(yè)化產(chǎn)品。微流控是建立新一代投遞技術(shù)的重要方法，微流控技術(shù)與醫(yī)學(xué)研究的結(jié)合及微流控裝置在醫(yī)學(xué)的應(yīng)用值得不斷地探索研究。

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