孫 毅，向代軍#，葉 波，王成彬△

(1.中國人民解放軍總醫(yī)院，北京 100853；2.深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司，廣東深圳 518027)

血細(xì)胞分析儀是目前醫(yī)學(xué)實驗室最常用的儀器之一，血細(xì)胞分析儀經(jīng)過不斷發(fā)展，從對白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板、血紅蛋白等的單項目檢測，發(fā)展為具有同時進(jìn)行多項目聯(lián)合檢測功能的兩分群、三分群和五分類血細(xì)胞分析儀[1]。血細(xì)胞分析儀采用的分類技術(shù)也由單一的通過庫爾特原理(阻抗法)，發(fā)展為整合阻抗法、流式細(xì)胞、射頻、細(xì)胞化學(xué)染色等技術(shù)對細(xì)胞體積、細(xì)胞內(nèi)顆粒復(fù)雜度、核酸物質(zhì)含量等進(jìn)行檢測，大大提高了對異常細(xì)胞的分類和識別能力[2-3]。目前，我國血細(xì)胞分析儀研發(fā)和生產(chǎn)取得了很大成就，以深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司為例，其研發(fā)的BC-6800型血細(xì)胞分析儀采用了激光散射結(jié)合熒光染色多維分析技術(shù)(SF-Cube)。在SF-Cube技術(shù)中，細(xì)胞體積大小差異通過低角度散射光信號(FS)表征，細(xì)胞內(nèi)部顆粒復(fù)雜程度差異通過高角度散射光信號(SS)表征，熒光信號(FL)強度則反映了細(xì)胞內(nèi)核酸物質(zhì)被染色的程度。儀器通過識別試劑處理過細(xì)胞的這三個信號，在三維空間(Cube)中實現(xiàn)了主要白細(xì)胞亞群(淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞)、網(wǎng)織紅細(xì)胞、有核紅細(xì)胞的區(qū)分，并就幼稚粒細(xì)胞、異常淋巴細(xì)胞、原始細(xì)胞、異型淋巴細(xì)胞等異常細(xì)胞，以及紅細(xì)胞碎片、脂質(zhì)顆粒等進(jìn)行識別和報警[4-5]。2017年，第二代激光散射結(jié)合熒光染色多維分析技術(shù)(SF-Cube 2.0)問世，并應(yīng)用于新一代BC-6X系列血細(xì)胞分析儀上。和第一代SF-Cube相比，SF-Cube 2.0在貧血患者樣本的診斷和鑒別診斷、識別高有核紅細(xì)胞樣本、提高原始細(xì)胞和幼稚細(xì)胞報警準(zhǔn)確性和靈敏度、低值白細(xì)胞和低值血小板的計數(shù)、避免紅細(xì)胞和白細(xì)胞碎片對血小板計數(shù)的干擾等方面，呈現(xiàn)出優(yōu)異的特性[6]。

本文就SF-Cube 2.0技術(shù)要點在臨床樣本檢測中的運用進(jìn)行介紹。

1 WNB通道白細(xì)胞分類原理

在SF-Cube 2.0中，邁瑞采用了全新的WNB通道，在一個通道里面同時檢測嗜堿性粒細(xì)胞和有核紅細(xì)胞，有核紅細(xì)胞因此變?yōu)檠Ｒ?guī)的常規(guī)報告參數(shù)，而不增加額外的試劑消耗。

WNB通道具有很強的抗干擾性能，能有效避免由于高熒光大細(xì)胞和脂質(zhì)顆粒導(dǎo)致嗜堿性粒細(xì)胞出現(xiàn)假陽性結(jié)果[7]。

在WNB通道中，試劑對白細(xì)胞的處理效果較同類產(chǎn)品更加中性化，使白細(xì)胞各粒子群發(fā)生一定程度的皺縮，白細(xì)胞仍保持一定的體積大小而非“裸核化狀態(tài)”。嗜堿性粒細(xì)胞位于WNB散點圖的中部偏左上，體積比幼稚細(xì)胞和大的異淋細(xì)胞小，在FS方向上散射光信號強度弱，在FL方向上熒光強度略小，因此在FS-FL散點圖上與幼稚細(xì)胞、大的異淋細(xì)胞徹底分離，從而避免了高熒光強度的大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞之間的干擾，避免了嗜堿性粒細(xì)胞出現(xiàn)假陽性結(jié)果，見圖1、2(見插頁Ⅰ)。

由于白細(xì)胞不是“裸核化狀態(tài)”，保持了一定的體積大小，使得脂質(zhì)顆粒和白細(xì)胞體積大小有顯著的差異，因此在FS方向上嗜堿性粒細(xì)胞與脂質(zhì)顆粒徹底分離，也避免了嗜堿性粒細(xì)胞出現(xiàn)假陽性結(jié)果[8]，見圖1、3(見插頁Ⅰ)。

WNB通道采用粒子群動態(tài)捕捉算法識別高有核紅細(xì)胞樣本，避免出現(xiàn)有核紅細(xì)胞假陰性的結(jié)果[9]。熒光染料對有核紅細(xì)胞的RNA染色，但有核紅細(xì)胞的熒光強度顯著弱于其他白細(xì)胞，使有核紅細(xì)胞和白細(xì)胞在FL方向上通過熒光信號區(qū)分開，見圖4(見插頁Ⅰ)。

絕大部分的五分類血細(xì)胞分析儀采用的是與細(xì)胞主團位置相關(guān)的半浮動算法，先要確定白細(xì)胞主團的位置，才能確定有核紅細(xì)胞的空間位置[10]。而白細(xì)胞的數(shù)量往往遠(yuǎn)多于有核紅細(xì)胞，因此對于有核紅細(xì)胞增高的樣本來說，容易將此類樣本的大團的有核紅細(xì)胞識別為白細(xì)胞主團，從而造成有核紅細(xì)胞的假陽性結(jié)果。

SF-Cube 2.0采用了區(qū)別于傳統(tǒng)的半浮動算法的粒子群動態(tài)捕捉算法，不需要通過白細(xì)胞主團位置來定位包括有核紅細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞等在內(nèi)的其他細(xì)胞粒子團，而是先捕捉出散點圖上所有的細(xì)胞粒子團，通過細(xì)胞粒子團的相對空間位置來進(jìn)行動態(tài)劃分和動態(tài)識別，即使在有核紅細(xì)胞粒子團占絕對優(yōu)勢的高有核紅細(xì)胞樣本上，也依然能夠準(zhǔn)確劃分有核紅細(xì)胞和其他細(xì)胞。

2 紅細(xì)胞的檢測技術(shù)

在SF-Cube 2.0中，傳統(tǒng)的RET通道和PLT-O/F通道融合為ERP通道，即紅細(xì)胞、網(wǎng)織紅細(xì)胞、血小板檢測通道。對紅細(xì)胞、血小板和網(wǎng)織紅細(xì)胞的檢測是由能夠染色RNA的熒光染色液和具有球形化、促染功能的稀釋液共同實現(xiàn)[11]。

血液經(jīng)稀釋液作用后，使自然狀態(tài)下雙凹盤狀扁平圓形的紅細(xì)胞成為球形并固定，其目的是使紅細(xì)胞無論以何種方位通過測量區(qū)時，獲得的散射光和熒光信息都是相同的，不影響體積、血紅蛋白水平和核酸物質(zhì)含量的檢測；另外使紅細(xì)胞在形態(tài)上趨于球形，增強了體積的均一性，在體積特征上與血小板的區(qū)分度增加；同時試劑中可以染色RNA的陽離子菁類熒光染料對網(wǎng)織紅細(xì)胞中的RNA進(jìn)行標(biāo)記，通過熒光強度的檢測，實現(xiàn)了紅細(xì)胞和網(wǎng)織紅細(xì)胞的區(qū)分。采用SF-Cube 2.0技術(shù)的血細(xì)胞分析儀能夠檢測細(xì)胞粒子的前向散射光、側(cè)向散射光和熒光信號，根據(jù)Mie散射理論，通過對細(xì)胞前向散射光和側(cè)向散射光的分析，便可獲得單個紅細(xì)胞的體積和血紅蛋白濃度[12]。ERP通道可準(zhǔn)確測量網(wǎng)織紅細(xì)胞平均血紅蛋白濃度(MCHr)、網(wǎng)織紅細(xì)胞平均體積(MCVr)、血紅蛋白濃度分布寬度(HDW)、平均血小板顆粒度濃度(MPC)、血小板的平均顆粒物濃度(MPM)、高色素紅細(xì)胞占的百分比(HYPER%)、低色素紅細(xì)胞占的百分比(HYPO%)等其他儀器無法直接或間接測量的結(jié)果，這些參數(shù)對于貧血的診斷、療效觀察非常重要。

在此基礎(chǔ)上可得到紅細(xì)胞散點圖、紅細(xì)胞體積&血紅蛋白水平二維散點圖(紅細(xì)胞二維九分圖)、紅細(xì)胞體積&血紅蛋白水平&核酸熒光強度三維散點圖(紅細(xì)胞三維九分圖)、網(wǎng)織紅細(xì)胞三維散點圖(圖5，見插頁Ⅰ)。而其他儀器在紅細(xì)胞測量中絕大部分都采用阻抗法，即使采用光學(xué)法檢測也是間接測量以上參數(shù)[13-14]。當(dāng)白細(xì)胞嚴(yán)重升高，大血小板、小紅細(xì)胞都會嚴(yán)重影響紅細(xì)胞計數(shù)[15]。

相關(guān)研究表明，紅細(xì)胞九分圖解決了如何區(qū)分缺鐵性貧血和地中海貧血的問題[16-17]。這兩種貧血的血細(xì)胞分析儀檢測結(jié)果均提示為小細(xì)胞低色素性貧血。傳統(tǒng)的鑒別手段是通過檢查鐵代謝和血紅蛋白電泳[13]。但由于缺鐵性貧血的發(fā)生率在中國人群為10%，屬常見疾病，所以在我國，當(dāng)患者的血常規(guī)報告結(jié)果為小細(xì)胞低色素貧血時，一般都會首先以缺鐵性貧血治療。而只有在反復(fù)補鐵，而貧血仍舊無法根治時，才會考慮檢查血紅蛋白電泳和鐵代謝予以區(qū)分[14]。另外，血紅蛋白電泳的出報告周期較長，也影響了它的使用，從而導(dǎo)致地中海貧血的漏檢率非常高，地中海貧血病人延誤了最佳治療時機將存在生命危險。

國內(nèi)外研究表明，根據(jù)紅細(xì)胞九分圖所提供的小紅細(xì)胞和低色素紅細(xì)胞在全部紅細(xì)胞中所占比例，包括小紅細(xì)胞比例(Micro%)和HYPO%，在出現(xiàn)小細(xì)胞低色素貧血時，通過計算Micro%和HYPO%的比值就可以鑒別這兩種貧血[18]。

3 血小板的檢測技術(shù)

在ERP通道中，血小板的檢測靈敏度、準(zhǔn)確性和重復(fù)性均得到大幅提升。新的光學(xué)系統(tǒng)使儀器可以檢測體積更小的血小板，大幅提高了血小板檢測靈敏度[19]，見圖6(見插頁Ⅰ)；新的染料對血小板RNA的特異性更強，去除了紅細(xì)胞碎片、白細(xì)胞碎片對PLT的干擾，未成熟血小板比例的結(jié)果更佳，大幅提高了血小板檢測的準(zhǔn)確性[20]，見圖7(見插頁Ⅱ)；申請專利保護(hù)的低值血小板8倍統(tǒng)計功能，既可以根據(jù)PLT-I結(jié)果自動觸發(fā)(不會因為復(fù)檢增加成本增加成本)，也提供了專用的“PLT-O 8×”檢測模式，大幅提高了血小板檢測的精密度，見圖8(見插頁Ⅱ)。

4 網(wǎng)織紅細(xì)胞的檢測技術(shù)

網(wǎng)織紅細(xì)胞是尚未完全成熟的紅細(xì)胞，它由骨髓釋放到外周血后，成熟過程中，細(xì)胞內(nèi)的RNA水平逐漸減少，直至完全消失。網(wǎng)織紅細(xì)胞內(nèi)RNA的水平體現(xiàn)其成熟程度，由于血小板中也含有RNA物質(zhì)，通過球形化處理的血小板在體積上和網(wǎng)織紅細(xì)胞有較大區(qū)別，從而將兩者加以區(qū)分；同時，F(xiàn)R熒光染料對網(wǎng)織紅細(xì)胞和血小板中的RNA進(jìn)行標(biāo)記，試劑成分中的促染劑對染色作用進(jìn)行了有效的加速，使熒光染料可以快速的與網(wǎng)織紅細(xì)胞內(nèi)的RNA結(jié)合。通過熒光強度的檢測，實現(xiàn)對成熟紅細(xì)胞和網(wǎng)織紅細(xì)胞的區(qū)分，見圖9、10、11(見插頁Ⅱ)。

鐵是人體內(nèi)重要元素之一[21]。由于身體內(nèi)70%的鐵都被用來合成血紅蛋白，而網(wǎng)織紅細(xì)胞作為紅細(xì)胞的未成熟前體，它在外周血內(nèi)只存活1 d即演變?yōu)榧t細(xì)胞，所以它顯示了體內(nèi)最新的造血情況，其血紅蛋白水平則代表身體內(nèi)鐵代謝的最新進(jìn)展，對于體內(nèi)鐵代謝來說，檢測MCHr是一種真正可靠實用的檢查手段[22]。一項研究指出，在診斷鐵缺乏的靈敏度和特異度方面，同常規(guī)鐵代謝指標(biāo)鐵蛋白(60%和50%)和轉(zhuǎn)鐵蛋白(60%和50%)相比，MCHr達(dá)到了100%和80%[23]。使用MCHr來預(yù)測鐵代謝較其他指標(biāo)的優(yōu)點還表現(xiàn)在簡便易行，它的整個測量程序等同于一個血常規(guī)的全部過程，患者很快即可拿到報告。

5 小 結(jié)

綜上所述，SF-Cube 2.0通過新增的WNB通道，實現(xiàn)了在血常規(guī)檢測中除白細(xì)胞五分類外，常規(guī)報告有核紅細(xì)胞參數(shù)，避免了原始細(xì)胞、異淋細(xì)胞等高熒光強度大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞之間的相互干擾。同時采用粒子群動態(tài)捕捉算法識別高有核紅細(xì)胞樣本，大大提升了高有核紅細(xì)胞的識別率。在新的ERP通道中，采用Mie散射的原理，對單個紅細(xì)胞和單個網(wǎng)織紅細(xì)胞的體積和血紅蛋白水平進(jìn)行測量，獲得MCHr的測量值等相關(guān)參數(shù)，并提供紅細(xì)胞二維和三維九分圖，幫助對貧血患者，尤其是小細(xì)胞低色素性貧血患者進(jìn)行診斷和鑒別診斷。同時，通過試劑和算法的改進(jìn)，SF-Cube 2.0在血小板檢測靈敏度、抗白細(xì)胞碎片、紅細(xì)胞碎片干擾，以及低值血小板檢測的重復(fù)性方面都有了進(jìn)一步的提升，呈現(xiàn)出優(yōu)異的特性。