張曦，陳文俊，黃選章，吳聰聰，林瑞芳，吳劍

肺癌是我國最為高發(fā)的惡性腫瘤，其中非小細(xì)胞肺癌占肺癌的 80%～90%，患者確診后多為中晚期，而造成80%以上非小細(xì)胞肺癌患者死亡的原因是發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[1]。微小RNA（miRNA）是由內(nèi)源性基因編碼的單鏈非編碼RNA分子，在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)功能，在人體的不同組織中miRNAs的表達(dá)水平存在顯著差異[2]。miR-370是一種最早于人體胚胎干細(xì)胞中被克隆出的miRNA，目前發(fā)現(xiàn)其在多種惡性腫瘤中存在表達(dá)，參與了對腫瘤發(fā)生和進(jìn)展的調(diào)控作用[3]，但其在非小細(xì)胞肺癌中的研究目前鮮有報(bào)道。本研究通過檢測非小細(xì)胞肺癌組織和細(xì)胞系中miR-370的表達(dá)水平，研究其對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響，并探討其可能的作用靶點(diǎn)，為研究非小細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制提供理論參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取 2015年 9月至2016年11月來溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院就診的非小細(xì)胞肺癌患者58例，其中男 37例，女 21例；平均年齡（48.2±4.1）歲；術(shù)前均未進(jìn)行任何腫瘤相關(guān)治療。取非小細(xì)胞肺癌組織和正常肺上皮組織新鮮標(biāo)本，標(biāo)本均經(jīng)組織病理學(xué)確診。肺癌細(xì)胞A549、SPC-A1、H460、GLC082和 PC-9及正常肺上皮細(xì)胞EBAS-2B均購自于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR法檢測miR-370的表達(dá)采用總RNA提取試劑盒（日本Takara公司）提取新鮮肺組織和肺癌細(xì)胞株中總RNA，反轉(zhuǎn)錄方法合成cDNA，并采取熒光定量PCR試劑盒（日本Takara公司）進(jìn)行PCR反應(yīng)，操作過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。PCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃10 s，一共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。所有反應(yīng)設(shè)3個(gè)重復(fù)。RT-PCR 分析采用 2－△△Ct法，△Ct為目的基因與內(nèi)參基因的CT值比較后再將實(shí)驗(yàn)組與空白對照組進(jìn)行比較，即△△Ct=△CtmiR-370－△CtGAPDH。

1.2.2 CCK-8法檢測miR-370對肺癌細(xì)胞增殖的影響 將肺癌細(xì)胞A549分為3組，分別轉(zhuǎn)染 miR-370 mimics（miR-370模擬物組）、miR-370 inhibitor（miR-370抑制劑組）及無關(guān)序列（空白對照組），用胰酶將細(xì)胞消化5 min，按104個(gè)/孔將細(xì)胞接種于96孔板中，并置于37℃、5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng) 4 h。取不同時(shí)間點(diǎn)（24、48、72、96 h）采用CCK-8法對肺癌細(xì)胞A549的增殖能力進(jìn)行檢測，每組細(xì)胞設(shè)3個(gè)復(fù)孔并重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測肺癌細(xì)胞凋亡用不含EDTA的胰酶消化肺癌細(xì)胞，將消化好的細(xì)胞進(jìn)行離心10 min，離心條件為500 r/min，4℃；取出離心管后棄上清，加入標(biāo)記緩沖液懸浮細(xì)胞；往細(xì)胞液中加入Annexin V-FITC（南京凱基生物公司），置于室溫孵育15 min，避光。采用流式細(xì)胞儀檢測肺癌細(xì)胞A549的細(xì)胞凋亡情況，每組重復(fù)3次。

1.2.4 雙熒光素酶檢測 將處于對數(shù)生長期的肺癌細(xì)胞 A549接種于96孔板中，每孔體積為100 l，置于二氧化碳培養(yǎng)箱進(jìn)行孵育24 h，按照Lipofectamin 2000（美國Invitrogen公司）說明書進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。48 h后取出細(xì)胞并更換培養(yǎng)基，震蕩10 min后進(jìn)行雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)，采用熒光計(jì)測定熒光值。

1.2.5 Western blot檢測腫瘤壞死因子受體相關(guān)基因4（TRAF-4）蛋白的表達(dá)提取肺癌細(xì)胞株總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度。取50 g蛋白進(jìn)行 SDSPAGE電泳，電泳后濕轉(zhuǎn)移至PVDF膜，并放置封閉液中封閉1h，加TRAF-4兔抗人單克隆抗體（1∶1000），4℃孵育過夜，加入羊抗鼠二抗（1∶5 000），置于室溫下?lián)u床孵育1 h，采取ECL化學(xué)發(fā)光法顯色。采用Image J圖像處理軟件進(jìn)行圖像分析，以TRAF-4/-tubulin灰度比值作為TRAF-4的相對表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用 檢驗(yàn)或方差分析。＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-370在非小細(xì)胞肺癌組織和細(xì)胞中的表達(dá) 非小細(xì)胞肺癌組織中miR-370的平均相對表達(dá)量為（0.366±0.039），而癌旁正常組織中為（1.049±0.171），兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=12.948，P=0.001）。在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞 A549、SPC-A1、H460、GLC082和PC-9中，miR-370的相對表達(dá)量分別為（0.497±0.123）、（0.551±0.161）、（0.513±0.136）、（0.461±0.126） 及（0.378±0.061），與正常肺上皮細(xì)胞差異均有統(tǒng)計(jì)意義（t≥16.148，均P＜0.05）。

2.2 miR-370對肺癌細(xì)胞A594細(xì)胞生長的影響 miR-370在轉(zhuǎn)染了 miR-370 inhibitor后表達(dá)顯著降低，而在轉(zhuǎn)染miR-370mimics后顯著升高，見封二彩圖6。轉(zhuǎn)染第4天后，miR-370mimic肺癌細(xì)胞A549的活力顯著低于空白對照組，轉(zhuǎn)染 miR-370 inhibitor的細(xì)胞生長活力顯著升高，與對照組和空白組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。見封二彩圖7。

2.3 MiR-370對肺癌細(xì)胞凋亡的影響轉(zhuǎn)染miR-370 mimics 72 h后，肺癌細(xì)胞A549的凋亡率從39.0%提高到76.1%，而miR-370 inhibitor組細(xì)胞的凋亡率則為 18.0%，顯著低于空白對照組（=0.000）。見封三彩圖1。

2.4 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測TRAF-4 mRNA 3'-UTR與miR-370有互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，且得分最高。miR-370mimics與野生型 TRAF-4共轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞熒光素酶活性顯著下降（P=0.004），而突變型共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性則無明顯變化。同時(shí)在miR-370 inhibitor組和空白對照組中未觀察到熒光素酶活性變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.112），見封三彩圖2。

2.5 miR-370對TRAF-4蛋白表達(dá)的影響 細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，轉(zhuǎn)染 miR-370 mimics后TRAF-4蛋白的相對表達(dá)量為（0.31±0.05），而 miR-370 inhibitor組的TRAF-4相對表達(dá)量為（2.38±0.33），兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.286，P=0.012）。

3 討論

miR-370是近年來發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中發(fā)揮調(diào)控作用的小分子RNA。研究表明，miRNA與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生、發(fā)展和遷移過程存在緊密聯(lián)系[4]。陳小平[5]發(fā)現(xiàn)，miR-370在乳腺癌組織中表達(dá)水平是癌旁正常組織的近6倍，且其表達(dá)與患者腫瘤大小、臨床分期及浸潤程度呈正相關(guān)。Lo等[6]發(fā)現(xiàn)，miR-370在人胃癌組織中表達(dá)顯著上調(diào)，且其可直接靶向作用于FoxM1基因，上調(diào)miR-370水平可促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力。韓玲[7]發(fā)現(xiàn)，miR-370在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)與細(xì)胞的黏附和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，沉默miR-370的表達(dá)可顯著升高肺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移，且可提高肺癌患者的生存率。TRAF-4是TRAF家族中一員，其主要參與腫瘤壞死因子受體（TNFR）家族的信號傳導(dǎo)[8]。目前多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，TRAF-4在乳腺癌、肺癌和結(jié)直腸癌中高表達(dá)，通過基因載體的方式抑制TRAF-4的表達(dá)可降低腫瘤細(xì)胞的生長、侵襲和遷移能力[9-10]。Wu等[11]采用慢病毒感染的方式對結(jié)直腸癌細(xì)胞中TRAF-4的表達(dá)進(jìn)行沉默，可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞SW620的增殖，同時(shí)對Akt的活化過程也有較強(qiáng)的抑制作用。Zhang等[12]在肺癌細(xì)胞中過表達(dá)TRAF-4，可發(fā)現(xiàn)肺癌細(xì)胞增殖能力顯著增強(qiáng)，同時(shí)可增加S期細(xì)胞比例。

本研究結(jié)果顯示，在非小細(xì)胞肺癌組織和肺癌細(xì)胞系中，miR-370表達(dá)均顯著下調(diào)（均＜0.05），表明miR-370在非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展過程中可能充當(dāng)了抑癌基因的功能。在對肺癌細(xì)胞A549進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，可觀察到miR-370mimics組在第3天開始生長速度顯著降低，在第4天其生長速度顯著低于空白組，表明miR-370可抑制肺癌細(xì)胞的增殖能力；流式細(xì)胞檢測結(jié)果表明，空白對照組、miR-370 mimics組和miR-370 inhibitor組的細(xì)胞凋亡率分別為 39.0%、76.1%和18.0%，miR-370mimics組細(xì)胞凋亡率顯著高于抑制劑組和空白組（均＜ 0.05），表明 miR-370對肺癌細(xì)胞的凋亡具有促進(jìn)作用。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測結(jié)果顯示miR-370可直接靶向作用與TRAF-4蛋白，同時(shí)，Western blotting結(jié)果顯示，miR-370mimics組肺癌細(xì)胞中TRAF-4的表達(dá)量顯著低于空白組，而抑制miR-370的表達(dá)后，肺癌細(xì)胞A549中TRAF-4的表達(dá)則顯著上調(diào)，這說明miR-370對肺癌細(xì)胞中TRAF-4的表達(dá)具有抑制作用。

綜上所述，miR-370在非小細(xì)胞肺癌組織和細(xì)胞中低表達(dá)，過表達(dá)miR-370可抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的生長，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。因此，miR-370表達(dá)的顯著下調(diào)對于非小細(xì)胞肺癌的診斷提供一定參考，同時(shí)也可能成為肺癌治療的靶向分子之一。