劉然

（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100026）

0 引言

在臨床實(shí)踐過(guò)程中，常出現(xiàn)的會(huì)引發(fā)感染的念珠菌種類達(dá)17種之多，白念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、熱帶念珠菌以及近平滑念珠菌就是最為常見(jiàn)的幾類致病菌，超過(guò)90%的感染由這幾類念珠菌導(dǎo)致?？拐婢幬锏氖褂檬桥R床常見(jiàn)的治療方式，但此類藥物的長(zhǎng)期大量應(yīng)用會(huì)引發(fā)念珠菌耐藥性的產(chǎn)生。其中對(duì)氟康唑天然耐藥的克柔念珠菌對(duì)抗真菌藥物的耐藥率最高，已經(jīng)成為臨床上最為難治的念珠菌，對(duì)患者生命構(gòu)成嚴(yán)重的威脅。對(duì)克柔念珠菌的耐藥性的產(chǎn)生機(jī)制以及相應(yīng)治療藥物的進(jìn)一步研究已成為醫(yī)學(xué)界各方關(guān)注的重點(diǎn)。針對(duì)此，從克柔念珠菌的感染和耐藥現(xiàn)狀、耐藥性產(chǎn)生機(jī)理和相關(guān)臨床診治策略等不同方面進(jìn)行了詳盡闡述。

1 克柔念珠菌的感染及耐藥現(xiàn)狀

在國(guó)內(nèi)，因標(biāo)本來(lái)源、時(shí)間、地區(qū)及氣候的不同，各個(gè)醫(yī)院的克柔念珠菌的分離率從1.4%-8.86%不等[1-9]，對(duì)氟康唑、伊曲康唑的耐藥率從27.78%-100%不等[1-9]，對(duì)唑類藥物耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重。臺(tái)灣地區(qū)克柔念珠菌對(duì)氟康唑的耐藥率相比較2010年從2.2%上升到2.8%，對(duì)伏立康唑的耐藥率從0.3%上升至0.5%[10]，在另一項(xiàng)美國(guó)研究顯示，克柔念珠菌對(duì)棘白菌素類藥物耐藥率在2008年僅為4.2%，至2014年，其耐藥率已升為7.8%[11]。

2 克柔念珠菌的耐藥機(jī)制

2.1 對(duì)唑類藥物的耐藥機(jī)制

羊毛甾醇14α-去甲基化酶（14α-demythylase，14-DM）是唑類藥物耐藥機(jī)制中的作用靶酶，該酶是由ERG11基因編碼產(chǎn)生的，編碼蛋白ERG11p，在麥角甾醇生物的合成過(guò)程中處于關(guān)鍵位置，是真菌細(xì)胞膜的主要甾醇成分，經(jīng)由和14-DM結(jié)合，唑類藥物抑制了其生物活性，導(dǎo)致甾醇中間產(chǎn)物的堆積，阻礙麥角固醇的合成，最終使念珠球菌的胞膜結(jié)構(gòu)及功能發(fā)生改變，最終產(chǎn)生抗藥性。克柔念珠菌對(duì)唑類藥物的耐藥機(jī)制可能由以下幾種引起。

2.1.1 藥物靶酶ERG11編碼基因的突變和過(guò)度表達(dá)

克柔念珠菌的ERG11基因大小為1587bp，耐藥株克柔念珠菌中ERG11的mRNA表達(dá)增多，和耐藥性呈正相關(guān)。ERG11基因的突變可導(dǎo)致酶結(jié)構(gòu)變化，最終造成其功能差異，降低和唑類藥物間的親合力，出現(xiàn)耐藥性。相關(guān)研究結(jié)果提示，ERG11基因上G487T（A114S）和T916C（Y257H）的錯(cuò)義突變和唑類耐藥相關(guān)[12]。有研究[13]提到，Upc2p在調(diào)節(jié)麥角固醇的代謝中起到了重要作用，可以對(duì)外排泵的基因表達(dá)產(chǎn)生影響。Upc2p中G648D和A643T的功能性突變，均可造成某一丙氨酸結(jié)構(gòu)改變，變?yōu)樘K氨酸，刺激ERG11的過(guò)度表達(dá)，提高菌株耐藥性[14]。在唑類耐藥的臨床分離株中，已報(bào)道ERG11p中至少有60個(gè)氨基酸被取代[12]。

2.1.2 靶位拷貝數(shù)的增多

有關(guān)研究提示，當(dāng)唑類耐藥株中的ERG11基因出現(xiàn)拷貝數(shù)增加的情況，就會(huì)導(dǎo)致有絲分裂重組、基因突變和等臂染色體形成等情況出現(xiàn)，最終提高對(duì)唑類藥物耐藥性發(fā)生的幾率[15]。

2.1.3 通過(guò)藥物外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和減少攝取，而降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度

真菌中可導(dǎo)致唑類耐藥的外排泵主要包括兩類，分別是ATP結(jié)合盒（ABC）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（如CaCdr1和CaCdr2）和主要協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族（MFS）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（如CaMdr1），前者轉(zhuǎn)運(yùn)藥物使用的能量來(lái)源于ATP的水解，后者利用細(xì)胞質(zhì)膜電化學(xué)梯度轉(zhuǎn)運(yùn)底物。在克柔念珠菌中，菌株應(yīng)對(duì)唑類藥物暴露時(shí)，ABC1會(huì)被強(qiáng)力上調(diào)，因此它在天然耐藥方面，可能發(fā)揮了重要作用[16]。臨床上已經(jīng)從暴露于唑類抗真菌藥物患者連續(xù)分離的菌株中證實(shí)，多因素耐藥的逐步發(fā)展與藥物暴露、CDR和（或）MDR基因表達(dá)[17]以及其他機(jī)制（如ERG11過(guò)表達(dá)）有關(guān)。

2.1.4 其他的麥角固醇的生物合成途徑成分的修飾

ERG3基因編碼固醇Δ5,6-去飽和酶，有助于固醇的生物合成。相關(guān)研究結(jié)果顯示[18]，把克柔念珠菌至于內(nèi)含伊曲康唑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，會(huì)出現(xiàn)麥角固醇含量減少，14-甲基3,6-二醇含量增多，細(xì)胞生長(zhǎng)停滯的情況。而提高培養(yǎng)基中氯康唑濃度，則會(huì)發(fā)生14-去甲基糞甾醇蓄積的情況，據(jù)此，我們推測(cè)甾醇ERG3在克柔念珠菌耐氟康唑機(jī)制中起到了重要影響。

2.1.5 生物膜和持留細(xì)胞

生物膜是微生物自然生長(zhǎng)最普遍的形式之一，其特性是抵抗常用抗真菌藥物。在生物膜里，藥物外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因CDR和MDR在生物膜形成過(guò)程中被上調(diào)[19]。持留細(xì)胞生長(zhǎng)速度不如正常生物被膜細(xì)胞，通過(guò)“休眠-生長(zhǎng)-增殖”應(yīng)對(duì)逆境的脅迫[20]，能夠在高濃度抗菌藥物下存活并且形成菌落[21]。

2.2 對(duì)多烯類藥物的耐藥機(jī)制

2.2.1 細(xì)胞壁組分發(fā)生變化

以細(xì)胞壁與膜作用為基礎(chǔ)，兩性霉素B對(duì)克柔念珠菌的指數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行了抑制，而細(xì)胞壁內(nèi)葡聚糖的水平改變最終導(dǎo)致了耐藥性的產(chǎn)生。當(dāng)真菌細(xì)胞壁幾丁質(zhì)含量降低時(shí)耐藥性產(chǎn)生[22]。

2.2.2 交叉耐藥

經(jīng)由和真菌細(xì)胞膜表面的麥角固醇相互結(jié)合，多烯類藥物讓細(xì)胞膜表面出現(xiàn)許多微孔，細(xì)胞膜完整性受損，膜內(nèi)重要組成物質(zhì)外泄，真菌死亡。然而，若真菌抗唑類藥物耐藥性出現(xiàn)，真菌細(xì)胞就會(huì)失去合成麥角固醇的能力，最終讓兩性霉素B的抗菌活性消失。所以唑類藥物與多烯類藥物間存在交叉耐藥[23]。

2.3 對(duì)丙烯胺類藥物的耐藥機(jī)制

利用對(duì)角鯊烯環(huán)氧化酶的抑制作用，丙烯胺類藥物擾亂了真菌甾醇的合成進(jìn)程，造成角鯊烯的細(xì)胞內(nèi)堆積，引起真菌的脂質(zhì)代謝紊亂，最終起到抗真菌的效果[24]。現(xiàn)階段見(jiàn)報(bào)的與丙烯胺類藥物耐藥性有關(guān)的研究不多,但在臨床應(yīng)用過(guò)程中，耐特比萘芬的毛孢子菌屬(T richophyton rubrum)已經(jīng)出現(xiàn)對(duì)此類耐藥株中所蘊(yùn)含的角鯊烯環(huán)氧化酶進(jìn)行編碼基因的序列解析,研究結(jié)果提示所有菌株都含有1個(gè)氨基酸突變L 393F。

2.4 對(duì)氟胞嘧啶類藥物的耐藥機(jī)制

耐氟胞嘧啶類藥物的耐藥性產(chǎn)生的機(jī)理常是因特定的氨基酸被替換最終造成前體藥物的吸收及修飾過(guò)程產(chǎn)生變化，最終出現(xiàn)耐藥性[25]。還有研究顯示，其耐藥性可能和胞嘧啶透酶、胞嘧啶脫氨酶缺陷或胸苷酸合酶活性變化有關(guān)。

2.5 對(duì)棘白菌素類藥物的耐藥機(jī)制

有研究[26]提出棘白菌素的耐藥機(jī)制一般與以下幾類因素有緊密聯(lián)系：①FKS1基因突變。②細(xì)胞膜表明轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Sbe2P過(guò)度表達(dá)。③藥物過(guò)度外排。在這之中，F(xiàn)KS1基因突變的影響已獲得了普遍認(rèn)可。Kahn等[27]的研究結(jié)果提示因FKS1中T2080K發(fā)生雜合突變，讓Phe655→Cys失去了靶酶Fks1p亞單元內(nèi)的(1，3)β-D葡聚糖合成，最終造成了克柔念珠菌抗棘白菌素的耐藥性產(chǎn)生。

3 抗克柔念珠菌對(duì)策的研究進(jìn)展

3.1 建立標(biāo)準(zhǔn)化抗真菌藥物敏感實(shí)驗(yàn)[28]

近20年來(lái)，伴隨藥敏試驗(yàn)方式的持續(xù)完善，抗真菌藥物的敏感性結(jié)果的真實(shí)性更為可信。但也因患者免疫狀態(tài)的不同，基礎(chǔ)疾病的差異，藥物間相互影響，抗真菌藥物劑量高低區(qū)別，療程長(zhǎng)短和血藥濃度水平高低的不同，和別種感染因素的影響，如膿腫引流狀況，插入導(dǎo)管是否去除等因素造成藥敏試驗(yàn)結(jié)果與臨床治療情況不符。這就需要我們判斷真菌藥敏結(jié)果要慎重，在將其他會(huì)對(duì)治療效果產(chǎn)生不利影響的因素排除后，將最初致感染菌提取出來(lái)，同時(shí)和治療失敗后分離出的真菌的MIC進(jìn)行比較，若其MIC顯著提升，則顯示其耐藥性提高。

3.2 新藥研發(fā)

3.2.1 嗜鉻粒蛋白A(CGA)-N46

CGA是分布于內(nèi)分泌細(xì)胞嗜鉻顆粒和神經(jīng)細(xì)胞中的一種可溶性蛋白[29]。經(jīng)過(guò)對(duì)CGA中不同衍生片段的抗菌活性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果提示CGA N端的CGA-46顯示出極強(qiáng)的抗真菌活性[30]。CGA-N46能對(duì)進(jìn)行測(cè)試的念珠菌屬的生長(zhǎng)進(jìn)行抑制，在這之中，克柔念珠菌的敏感性最強(qiáng)。利用暫時(shí)對(duì)磷脂膜的穩(wěn)定性進(jìn)行去除，造成線粒體功能障礙，同時(shí)抑制DNA合成，CGA-N46被認(rèn)為是抗克柔念珠菌感染的最新化合物[31]。

3.2.2 銀納米顆粒（AgNP）

AgNPs指利用環(huán)保方式，將半胱氨酸視作還原劑合成產(chǎn)生的。在某些學(xué)者的認(rèn)知中，AgNP可被視為開(kāi)發(fā)新型抗真菌劑的最新化合物，它在成纖維細(xì)胞中具有最低的細(xì)胞毒性，同時(shí)針對(duì)具有抗常規(guī)真菌化合物抗性的念珠菌屬有較強(qiáng)致死性。這就是此類藥物的新藥研究的潛力體現(xiàn)[32]。

3.2.3 羧甲基殼聚糖（CM-殼聚糖）

Tan[33]等通過(guò)深刻研究，顯示CM-殼聚糖不論是針對(duì)單個(gè)和混合物中生物膜的非白色念珠菌，均具有顯著抑制作用，常見(jiàn)菌屬包括了熱帶假絲酵母，近平滑假絲酵母，還包括了克柔假絲酵母以及光滑念珠菌。所以CM-殼聚糖不單單可以起到減低念珠菌細(xì)胞代謝活性的作用，還可以刺激生物膜的建立和發(fā)展，在進(jìn)行新藥物研究中極具價(jià)值。

3.2.4 艾沙康唑

艾沙康唑有可預(yù)測(cè)的和與劑量成正比的藥動(dòng)學(xué)，現(xiàn)已完成Ⅲ期臨床試驗(yàn)，一般被用來(lái)治療侵襲性念珠菌病、念珠菌血癥，還可被用于治療侵襲性曲霉病和較為少見(jiàn)的曲霉感染[34]。在艾莎康唑的分子結(jié)構(gòu)式中，其側(cè)鏈具有很高的真菌CYP51蛋白親和力，造成其抗真菌譜范圍更廣，甚至將對(duì)別種唑類抗真菌藥所耐受的真菌也囊括其中[34]。

3.2.5 阿巴康唑

阿巴康唑是一種生物利用度高、抗真菌活性強(qiáng)的口服制劑，針對(duì)足廯已完成Ⅰ期試驗(yàn)評(píng)價(jià)，用于腳趾甲真菌病治療已完成Ⅱ期臨床試驗(yàn)[35]。

3.2.6 福司氟康唑

福司氟康唑是氟康唑的磷酸酯前體藥物，是以氟康唑?yàn)槠鹗荚贤ㄟ^(guò)兩部合成。福司氟康唑靜脈給藥2-3d即可達(dá)到有效血藥濃度。安全性好，不良反應(yīng)小[36]。

3.3 聯(lián)合用藥

相關(guān)動(dòng)物結(jié)果提示，小檗堿及黃芩素能有效提升唑類藥物的抗真菌效應(yīng)[37]。王維欣等[38]研究表明，沒(méi)食子酸與氟康唑聯(lián)用對(duì)耐藥克柔念珠菌的浮游菌表現(xiàn)出體外協(xié)同抗真菌作用。有些研究結(jié)果顯示[39]，枸櫞酸托瑞米芬具有明顯提升卡泊芬凈及兩性霉素B體內(nèi)外抗生物被膜活性的作用。

3.4 老藥新劑型

兩性霉素B脂質(zhì)體是兩性霉素B的一種新劑型，發(fā)揮其最強(qiáng)殺菌效能的同時(shí)降低其毒副作用[26]。20世紀(jì)90年代，研發(fā)了3種不同的兩性霉素B的脂類復(fù)合體，分別是兩性霉素B脂質(zhì)體、兩性霉素B脂質(zhì)復(fù)合體和兩性霉素B膠狀分散體。制霉菌素脂質(zhì)體是游離制霉菌素包裹在多層脂質(zhì)中，保留其抗菌活性的同時(shí)降低其腎毒性?；尹S霉素的卵磷脂脂質(zhì)體也于20世紀(jì)90年代研發(fā)，其肝毒性大大低于常規(guī)灰黃霉素口服劑。

3.5 抗真菌中草藥

中草藥因其所具備的來(lái)源多、抗菌譜廣、毒性小、耐藥性產(chǎn)生率低等優(yōu)勢(shì)引起了多方關(guān)注。有研究提示，大蒜、地錦草、黃芩、魚(yú)腥草等都具備較高的抗真菌性[40]。還有研究對(duì)這一輪點(diǎn)進(jìn)行了進(jìn)一步肯定[41]，研究顯示大蒜素可有效抑制生物膜的黏附和胞外多糖的產(chǎn)生；苦參堿則能夠顯著阻礙白念珠菌的黏附和菌絲生長(zhǎng)；黃芪苷可抑制真菌DNA的合成而達(dá)到抗菌作用。

4 小結(jié)

克柔念珠菌的耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重是多種耐藥機(jī)制共同作用的結(jié)果，不同耐藥機(jī)制的結(jié)合也形成了其對(duì)氟康唑的天然耐藥。在上文中所提及的耐藥機(jī)制仍待我們的深層次研究，也許會(huì)有未發(fā)現(xiàn)的耐用機(jī)制亟待進(jìn)一步闡明，從而為研制新的抗真菌藥物提供新思路，也可以為臨床合理使用抗真菌藥物提供理論依據(jù)。