徐桐紅，于冬艷，任 玲

肝癌多藥耐藥(MDR)是影響化療效果及導(dǎo)致死亡的主要原因[1-2]。肝癌對(duì)化療藥物相對(duì)不敏感，對(duì)MDR發(fā)生機(jī)制不清楚。HBx具有多種調(diào)控功能，可激活腫瘤侵襲相關(guān)原癌基因和轉(zhuǎn)錄因子，是肝癌發(fā)病獨(dú)立危險(xiǎn)因素[3-5]。Notch信號(hào)通路是高度保守的細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。研究表明，Notch信號(hào)通路不僅對(duì)胚胎期腎臟發(fā)育起至關(guān)重要的作用，且參與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[6]，其能通過血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子促進(jìn)腫瘤血管發(fā)生，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖[7]。多藥耐藥蛋白(MRP)過表達(dá)是肝癌產(chǎn)生MDR的重要機(jī)制[8-9]。本研究采用基因轉(zhuǎn)染將HBx基因轉(zhuǎn)入肝癌HepG2細(xì)胞中，觀察HBx對(duì)HepG2細(xì)胞中Notch信號(hào)通路和MRP表達(dá)的影響，并探討轉(zhuǎn)染HBx對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和MDR的影響及其可能的作用機(jī)制，為肝癌的防治提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞株 人肝癌HepG2細(xì)胞株購(gòu)自中科院上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，本所傳代保存，置于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、含10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基(Thermo Fisher Scientific，MA，USA)的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2試劑 DMEM高糖細(xì)胞培養(yǎng)液(美國(guó)Gibco公司，批號(hào)：12100046)，DMEMF12(美國(guó)Gibco公司，批號(hào)：12400024)，HBSS緩沖液(上海研卉生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：BS0101)，Trizol裂解液(美國(guó)賽默飛世爾科技，批號(hào)：15596026)，Taqman MicroRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)賽默飛世爾科技，批號(hào)：4366596)，Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒(美國(guó)賽默飛世爾科技，批號(hào)：722255)，Annexin-V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(上海前塵生物科技有限公司，批號(hào)：40302ES20)，B27補(bǔ)充劑(美國(guó)GIBCO，批號(hào)：17504-044)，CCK-8試劑盒(上海鈺博，批號(hào)：YB1198)，小牛血清(北京索萊寶公司，批號(hào)：01-045)，胰蛋白酶(北京瑞達(dá)恒輝科技發(fā)展有限公司，批號(hào)：HB-0103-01)，RPMI-1640培養(yǎng)基(美國(guó)GIBCO公司，批號(hào)：11875-093)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1重組X質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肝癌HepG2細(xì)胞：在10%胎牛血清的DMEN中培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，胰酶消化后，接種于直徑25 cm培養(yǎng)瓶中，此時(shí)計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)為1×106個(gè)/L，細(xì)胞在6 h后貼壁，之后進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。在37℃預(yù)熱的無(wú)血清培養(yǎng)基加入5 μg DNA和15 μl Trans Fast Reagent，隨機(jī)高速渦旋混勻，在室溫下靜置15 min。培養(yǎng)基被小心移出，之后慢慢向培養(yǎng)瓶中加入混勻的DNA/脂質(zhì)體的混合物，在37℃孵育24 h后，輕輕加入4 ml含血清的培養(yǎng)基(完全培養(yǎng)基)，不必移去DNA/脂質(zhì)體混合物，37℃繼續(xù)孵育48 h；以HepG2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染重組x質(zhì)粒命名為轉(zhuǎn)染HBx細(xì)胞組(HepG2-HBx組)、未轉(zhuǎn)染重組x質(zhì)粒命名為轉(zhuǎn)染空載體細(xì)胞組(HepG2-con組)，未進(jìn)行任何處理的為空白細(xì)胞組(HepG2組)。

1.3.2實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè)HBx mRNA的表達(dá)：TRIzol試劑提取并收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的3組肝癌HepG2細(xì)胞的HBx mRNA，RNA完整性利用1%的瓊脂糖變性凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，純度和濃度利用紫外可見分光光度計(jì)檢測(cè)；在70℃(10 min)、冰育(2 min)、42℃(60 min)、70℃(10 min)反應(yīng)條件下，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA；在95℃(5 s)、60℃(20 s)、72℃(5 s)進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，40個(gè)循環(huán)，重復(fù)試驗(yàn)3次。

1.3.3蛋白免疫印跡法(Western-blot)檢測(cè)肝癌HepG2細(xì)胞中HBx、Notch-1和MRP表達(dá)：轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組進(jìn)行細(xì)胞總蛋白提取，通過Bradford方法調(diào)整相同的蛋白濃度后，行電泳獲得根據(jù)分子量分離的蛋白條帶，根據(jù)pierce公司W(wǎng)estern-blot試劑盒的指導(dǎo)說明進(jìn)行，蛋白NC膜電轉(zhuǎn)，進(jìn)行蛋白封閉和一抗結(jié)合，一抗結(jié)合后洗脫，再進(jìn)行二抗孵育標(biāo)記兔抗大鼠的多克隆抗體。ECL試劑盒顯色后，暗室發(fā)光拍照，以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行系統(tǒng)軟件分析。

1.3.4CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性：取3組細(xì)胞以1×106個(gè)/L接種于96孔板中，每孔100 μl，培養(yǎng)48 h后每孔加入10 μl CCK-8試劑，4 h后在450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各孔吸光度(OD)值，重復(fù)3次取均值。以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.3.5流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期：收集轉(zhuǎn)染48 h后的3組細(xì)胞，用冷PBS洗滌細(xì)胞后加入體積分?jǐn)?shù)70%冷乙醇固定過夜。采用Cell Quet軟件分析細(xì)胞周期分布情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.6細(xì)胞耐藥性檢測(cè)：將3組處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞制成濃度為1×106個(gè)/L的細(xì)胞懸液，每孔100 μl，接種于96孔板，每孔設(shè)3個(gè)復(fù)孔。孵育24 h后，換用濃度為0.5、1、2.5、5、10、25、50、100 μmol/L絲裂霉素、阿霉素培養(yǎng)液，0.5、1、2.5、5、10、25、50、100、250、500 μmol/L 5-氟尿嘧啶、順鉑、奧沙利鉑培養(yǎng)液。孵育48 h后，去除含藥液，每孔加100 μl不含藥培養(yǎng)基和10 μl CCK-8，設(shè)空白孔。孵育2 h后，酶標(biāo)儀測(cè)光密度值，設(shè)a為加藥組的OD值，b為不加藥細(xì)胞組的OD值，c為無(wú)細(xì)胞的空白組的OD值，藥物對(duì)細(xì)胞的抑制率(%)=[1-(a-c)/(b-c)]×100%。計(jì)算5種藥物抑制率為50%的濃度(IC50)和耐藥指數(shù)(RI)，RI=耐藥細(xì)胞IC50/親本細(xì)胞IC50。

2 結(jié)果

2.1HBx mRNA的表達(dá) 將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，可見HepG2-HBx組有目的片段出現(xiàn)，而其他2組未見HBx mRNA的表達(dá)，見圖1。

圖13組肝癌細(xì)胞HepG2聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果
A.HepG2組；B.HepG2-con組；C.HepG2-HBx組

2.2HBx、Notch-1和MRP蛋白表達(dá) HepG2-HBx組有HBx蛋白表達(dá)，HepG2組和HepG2-con組未見表達(dá)。Notch-1和MRP蛋白在HepG2-HBx組條帶最大，HepG2-con組次之，HepG2組最小。見圖2。

圖23組肝癌HepG2細(xì)胞中HBx、Notch-1和多藥耐藥蛋白的表達(dá)情況

A.HepG2組；B.HepG2-con組；C.HepG2-HBx組

2.3轉(zhuǎn)染HBx后各組細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線 與HepG2組和HepG2-con組比較，HepG2-HBx組細(xì)胞增殖顯著加快(P<0.05)。見表1。

表1 3組肝癌HepG2細(xì)胞培養(yǎng)不同時(shí)間吸光度值比較

注：與HepG2組比較，aP<0.05，bP<0.01；與HepG2-con組比較，cP<0.05

2.4轉(zhuǎn)染HBx后細(xì)胞周期變化 與HepG2組和HepG2-con組比較，HepG2-HBx組G0/G1期細(xì)胞顯著減少，S期細(xì)胞增加(P<0.05，P<0.01)，G2/M期細(xì)胞變化不大(P>0.05)。見表2。

2.5耐藥性 與HepG2組和HepG2-con組比較，HepG2-HBx組中肝癌細(xì)胞HeG2對(duì)5種藥物耐藥指數(shù)增高(P<0.05，P<0.01)。見表3。

表2 3組肝癌HepG2細(xì)胞周期變化情況,%)

注：與HepG2組比較，aP<0.05，bP<0.01;與HepG2-con組比較，cP<0.05，dP<0.01

表3 3組肝癌HepG2細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性比較

注:IC50為藥物抑制率為50%的濃度，RI為耐藥指數(shù)；與HepG2組比較，aP<0.05，bP<0.01；與HepG2-con組比較，cP<0.05，dP<0.01

3 討論

HBV慢性感染是世界范圍內(nèi)原發(fā)性肝細(xì)胞癌(HCC)的主要發(fā)病原因之一[10-11]，HBx基因致HCC發(fā)生的機(jī)制是目前研究的熱點(diǎn)。HBx基因具有強(qiáng)大的生物學(xué)功能，包括反式激活病毒基因組和宿主細(xì)胞基因的轉(zhuǎn)錄、增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄因子DNA結(jié)合特性、抑制p53蛋白活性、參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)等。這些功能可能與HCC的發(fā)生具有密切的關(guān)系[12]。一些體內(nèi)及體外研究也發(fā)現(xiàn)，HBx可誘導(dǎo)細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，甚至參與癌變發(fā)生[13]。

在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中，Notch信號(hào)出現(xiàn)紊亂時(shí)，能夠直接引起腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，且可通過多條信號(hào)通路的相互作用，間接誘導(dǎo)腫瘤的形成[14]。本研究qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染HBx的HepG2細(xì)胞內(nèi)HBx mRNA和蛋白表達(dá)明顯，提示轉(zhuǎn)染構(gòu)建過表達(dá)HBx的肝癌細(xì)胞成功。本研究還發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染HBx人肝癌HepG2細(xì)胞Notch-1蛋白表達(dá)高于HepG2組和HepG2-con組，提示HepG2細(xì)胞中HBx過表達(dá)誘導(dǎo)了細(xì)胞內(nèi)Notch-1表達(dá)水平的增加，造成細(xì)胞內(nèi)Notch信號(hào)通路的紊亂。細(xì)胞增殖和周期檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染HBx后細(xì)胞增殖能力顯著提高，S期細(xì)胞增加，提示Notch-1的活化誘導(dǎo)了HepG2細(xì)胞增殖的發(fā)生。

MDR是導(dǎo)致腫瘤治療失敗和復(fù)發(fā)的主要原因之一[15-16]。有報(bào)道指出，檢測(cè)患者體內(nèi)MRP的表達(dá)可以作為監(jiān)測(cè)惡性腫瘤細(xì)胞原發(fā)性耐藥的主要指標(biāo)[17]。腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生MRP與藥物外排泵ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的過度表達(dá)與細(xì)胞凋亡水平異常改變、細(xì)胞DNA修復(fù)活性增強(qiáng)、胞內(nèi)酶異常改變和器官微環(huán)境改變有密切關(guān)系[18]。此外，Notch-1信號(hào)與腫瘤細(xì)胞MDR的形成有關(guān)，過表達(dá)Notch-1能增加與MDR相關(guān)的ABBCC1基因的表達(dá)，誘導(dǎo)MDR的發(fā)生[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染HBx的HepG2細(xì)胞耐藥指數(shù)明顯增高，提示轉(zhuǎn)染HBx HepG2細(xì)胞，可能通過誘導(dǎo)Notch-1和MRP的過表達(dá)，最終導(dǎo)致MDR的發(fā)生。此外，在本研究基礎(chǔ)上檢測(cè)Notch通路的活化情況及由此引起凋亡抑制蛋白livin表達(dá)，同時(shí)研究livin的表達(dá)后MDR相關(guān)蛋白表達(dá)的變化,并觀察HBx、Notch通路活化、livin蛋白及MDR蛋白表達(dá)之間的相關(guān)性是下一步的研究重點(diǎn)，為乙型肝炎相關(guān)性HCC臨床治療提供新靶點(diǎn)。

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