李先亮，劉向軍，姚遠(yuǎn)（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院肝膽脾胰專科，北京 0000；北京博富瑞基因診斷技術(shù)有限公司，北京 0076）

近年來，我國(guó)肝移植發(fā)展迅猛，已逐漸成為各種終末期肝病的有效治療手段［1-2］。隨著肝移植外科手術(shù)水平的提高、肝臟冷缺血保存技術(shù)的發(fā)展、新型免疫抑制藥在臨床逐漸推廣應(yīng)用，肝移植患者手術(shù)后早期生存率有顯著的提高。但在長(zhǎng)期的肝移植受體中，由抗體介導(dǎo)排斥反應(yīng)（antibodymediated rejection，AMR）導(dǎo)致的慢性移植肝失功及其相關(guān)并發(fā)癥仍是影響肝移植受體長(zhǎng)期存活的主要原因。肝移植臨床配型中，人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）配型和HLA抗體檢測(cè)是其中一種可能的原因。如何通過HLA配型和HLA抗體檢測(cè)技術(shù)優(yōu)化肝臟資源選取，避免患者預(yù)存有供體HLA抗體，及早檢測(cè)出新生供體特異性抗體（donor-specific alloantibodies，DSA），避免AMR的發(fā)生，提高移植后的患者存活率，應(yīng)該是肝移植長(zhǎng)期存活的受體研究中需要關(guān)注的問題。

1 肝移植的免疫耐受理論

在以往的研究中，肝臟因具有特惠的移植免疫特性，其排斥反應(yīng)明顯輕于其他移植器官，往往被認(rèn)作是“免疫豁免器官”，因此肝臟容易產(chǎn)生免疫耐受［3］。這種特性的產(chǎn)生主要有兩個(gè)客觀原因：① 患者進(jìn)行肝移植后，供體肝臟產(chǎn)生的大量分泌型MHC-Ⅰ可以有效誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（cytotoxic lymphocyte，CTL）凋亡，延長(zhǎng)移植物的存活時(shí)間［4］。② 肝臟過客細(xì)胞較多，約為25% ～50%，這種供受體間大量游走會(huì)逐漸形成微嵌合體［5］，最終使移植物被受體接受，有利于移植物的長(zhǎng)期存活［5］。因此，肝移植一般不需要特別嚴(yán)格的HLA配型和HLA抗體的檢測(cè)。但隨著免疫學(xué)的不斷發(fā)展，有了新的研究發(fā)現(xiàn)，肝臟的排斥反應(yīng)明顯輕于其他器官移植并不是全因其具有免疫特惠的特性，而是因?yàn)楦闻K具有強(qiáng)大的再生能力，通過排斥反應(yīng)死亡的肝臟細(xì)胞迅速再生，使肝臟的功能在排斥反應(yīng)中依然保持穩(wěn)定［6］。

2 HLA抗體檢測(cè)技術(shù)

2.1 HLA抗體檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展：隨著體液免疫理論的不斷完善和群體反應(yīng)性抗體（panel reactive antibodies，PRA）檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，臨床醫(yī)生逐漸認(rèn)識(shí)到在急性、超急性、加速排斥反應(yīng)中，可能也有體液免疫參與，其中HLA抗體能迅速或緩慢地召集血液中的補(bǔ)體，造成移植物損傷，引起臨床意義上的排斥反應(yīng)［7］?；诿嘎?lián)免疫吸附試驗(yàn) （enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）技術(shù)的PRA檢測(cè)已逐漸成為移植術(shù)前的常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目［8］，但其具有精度低、耗時(shí)長(zhǎng)、結(jié)果容易受到操作人員水平影響等缺陷。而在此基礎(chǔ)上發(fā)展的基于Luminex 的單抗原珠（luminex single antigen beads，LSAB）技術(shù)，同樣通過高特異的雙抗體選擇，但可以在一次實(shí)驗(yàn)中完成多個(gè)目標(biāo)的HLA抗體分析，從而顛覆了過去的檢測(cè)體系，建立了一個(gè)高效快速的HLA分析和HLA抗體檢測(cè)的分析平臺(tái)［9-10］。

2.2 基于Luminex技術(shù)的HLA抗體檢測(cè)：Luminex技術(shù)應(yīng)用了微球和流式細(xì)胞儀的原理，其中微球內(nèi)含有紅色和綠色兩種熒光，通過熒光的深淺不同，Luminex平臺(tái)可以區(qū)分100種不同的微球［11］。每種微球可以用來檢測(cè)一種不同HLA抗體或基因。該技術(shù)利用熒光編碼的微球共價(jià)交聯(lián)HLA單克隆抗體或HLA分子探針，與被測(cè)定的HLA抗原或DNA結(jié)合后，加入二抗作為熒光標(biāo)記，再通過激光掃描微球的熒光編碼識(shí)別編碼和測(cè)量目的熒光的平均強(qiáng)度（median fluorescent intensity，MFI）［12］。基于Luminex平臺(tái)的HLA抗體檢測(cè)技術(shù)，在使用相同抗體的條件下，測(cè)量結(jié)果在準(zhǔn)確度、靈敏度和精確度上均與ELISA實(shí)驗(yàn)達(dá)到相同水平，但因其通量的大幅度增加，對(duì)HLA抗體的檢測(cè)個(gè)數(shù)由原來ELISA技術(shù)的20多個(gè)上升為100個(gè)，且操作時(shí)間更短［13］，是一種更適合為臨床提供服務(wù)的檢測(cè)技術(shù)體系。

2.3 HLA抗體檢測(cè)在器官移植中的作用：隨著器官移植免疫理論的不斷發(fā)展，HLA配型與HLA抗體檢測(cè)已在腎移植和心臟移植臨床中被廣泛運(yùn)用。國(guó)內(nèi)外研究機(jī)構(gòu)的臨床研究表明，HLA配型與DSA存在與腎移植術(shù)后早期排斥反應(yīng)、AMR及移植物長(zhǎng)期存活都有著密切關(guān)系。法國(guó)圣路易斯醫(yī)院的腎移植科對(duì)402例腎移植患者進(jìn)行研究，研究結(jié)果表明，術(shù)前預(yù)存DSA的患者（60.8%），8年的腎存活率遠(yuǎn)低于預(yù)存非DSA（83.6%）或PRA陰性患者（92.5%）［14］。英國(guó)哈特菲爾德醫(yī)院移植免疫科對(duì)243例心臟移植患者進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，術(shù)后產(chǎn)生新生DSA的患者十年存活率僅為62%，而沒有產(chǎn)生新生DSA患者的十年存活率卻達(dá)到89%［15］。英國(guó)劍橋醫(yī)學(xué)院對(duì)131例準(zhǔn)備進(jìn)行再次腎移植的患者進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)DSA的發(fā)生與HLA位點(diǎn)的錯(cuò)配個(gè)數(shù)或Epitope的錯(cuò)配個(gè)數(shù)存在明顯的正相關(guān)關(guān)系［16］。預(yù)存或新生DSA在器官移植中的致病作用，除了在腎移植和心臟移植有詳細(xì)的研究報(bào)道外，還在肺移植［17］和胰腺移植［18］中有所報(bào)道。

3 肝移植患者DSA與急性排斥反應(yīng)的產(chǎn)生

3.1 PRA產(chǎn)生原理：患者在移植前，曾經(jīng)歷過輸血、妊娠或其他器官移植都有可能使體內(nèi)預(yù)存PRA。研究發(fā)現(xiàn)，器官移植產(chǎn)生的HLA抗體概率較高，妊娠產(chǎn)生的HLA抗體概率次之，而輸血產(chǎn)生HLA抗體的概率較低［19］。但因?yàn)楦鞣N原因，部分患者進(jìn)行輸血的次數(shù)會(huì)較多，研究發(fā)現(xiàn)患者經(jīng)過反復(fù)有規(guī)律的的輸血，產(chǎn)生HLA抗體的頻率可高達(dá)50%［20］。

3.2 PRA與肝移植術(shù)后的急性排斥反應(yīng)：肝移植后發(fā)生急性排斥反應(yīng)的體液免疫學(xué)機(jī)制是移植肝的肝細(xì)胞表面HLA-Ⅰ類抗原與膽管上皮細(xì)胞表面的HLA-Ⅱ類抗原與患者體內(nèi)預(yù)存的HLA抗體結(jié)合，形成抗原抗體復(fù)合物，并通過激活補(bǔ)體經(jīng)典途徑的級(jí)聯(lián)反應(yīng)形成攻膜復(fù)合體，直接損害移植肝的肝細(xì)胞與膽管上皮細(xì)胞［21］。另外，由于供受體之間的HLA抗原產(chǎn)生差異，移植肝進(jìn)入受者體內(nèi)后，供肝的HLA抗原被受體提呈，通過輔助T細(xì)胞的作用，激活CD8+T細(xì)胞攻擊移植肝臟，另一方面，CD4+T細(xì)胞釋放的多種細(xì)胞因子也會(huì)通過巨噬細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞（natural killer cell，NK）等間接或直接的攻擊靶細(xì)胞［22］。

3.3 肝移植后急性排斥反應(yīng)的癥狀：肝移植后急性排斥反應(yīng)的癥狀包括肝功能紊亂、血小板下降、補(bǔ)體水平和DSA水平上升、肝活檢顯示微血管炎性損傷［23］。這些急性排斥反應(yīng)癥狀最早可發(fā)生于術(shù)后的第2天，通常在肝移植后的數(shù)周內(nèi)發(fā)生，其發(fā)生率隨時(shí)間推移而下降。肝臟因?yàn)橛袕?qiáng)大的再生能力，使其具有一定的術(shù)前DSA的吸收能力，早期因?yàn)锳MR產(chǎn)生的肝細(xì)胞損傷、肝內(nèi)膽汁淤積及膽道并發(fā)癥都有可能被肝臟的再生能力掩蓋，使患者沒有出現(xiàn)相應(yīng)的病例癥狀［24-25］。這一情況給我們通過病理學(xué)研究DSA與肝移植結(jié)果帶來了困難。研究發(fā)現(xiàn)，在正常肝移植患者中急性排斥反應(yīng)發(fā)生的概率非常罕見，因此造成的移植肝功能失功只占移植肝失功的1%，但對(duì)于預(yù)存有DSA的患者，急性排斥反應(yīng)造成的移植肝功能失功卻占到移植肝失功的 10%［25］。

3.4 預(yù)存DSA抗體與肝移植術(shù)后產(chǎn)生急性排斥反應(yīng)的關(guān)系：早前已有臨床研究表明，在進(jìn)行肝移植的患者當(dāng)中，補(bǔ)體依賴的微量淋巴細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)（complement dependent cytotoxity ， CDC）陽性患者的移植肝存活率遠(yuǎn)低于CDC陰性患者［26-27］。隨著基于Luminex的HLA抗體檢測(cè)技術(shù)的成熟，幾個(gè)研究單位都利用這一先進(jìn)快捷的檢測(cè)技術(shù)對(duì)患者預(yù)存DSA與肝移植急性排斥反應(yīng)之間的關(guān)系進(jìn)行研究。Taner等［28］研究發(fā)現(xiàn)，85%的肝移植患者預(yù)存的DSA將會(huì)在移植后消失，但大部分DSA沒有消失且具有較高M(jìn)FI的患者均會(huì)產(chǎn)生AMR。Kozlowski等［29］研究發(fā)現(xiàn)，79%的術(shù)前T細(xì)胞或B細(xì)胞CDC陽性患者，肝移植后CDC會(huì)變成陰性，但是CDC持續(xù)陽性的患者將會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的急性AMR。這一結(jié)果說明，肝臟雖然有強(qiáng)大的修復(fù)能力去減少DSA帶來的損傷，直至預(yù)存DSA耗盡，但一旦預(yù)存DSA的含量強(qiáng)于肝臟的自我修復(fù)能力，肝臟就會(huì)受到嚴(yán)重的病理損傷。O'Leary等［30］發(fā)現(xiàn)23%的患者在肝移植后，體內(nèi)依然保持有術(shù)前預(yù)存的HLA-Ⅱ DSA，且MFI＞5 000 ，這一因素與移植肝功能失功存在明顯的單因素正相關(guān)關(guān)系。Castillo-Rama等對(duì)896例肝移植患者進(jìn)行回顧性研究，發(fā)現(xiàn)預(yù)存的HLA-I DSA與HLA-ⅡDSA或CDC陽性患者均與移植肝功能失功和死亡風(fēng)險(xiǎn)存在明顯的正相關(guān)性。另外，Musat等［31］發(fā)現(xiàn)患者預(yù)存DSA在肝移植術(shù)后發(fā)生急性細(xì)胞排斥反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)明顯增加。

3.5 患者新生DSA與移植肝存活：雖然肝臟強(qiáng)大的再生功能使我們研究DSA與肝移植的結(jié)果存在困難，但最近也有不少研究單位對(duì)此作出了報(bào)道。Kaneku 等［32］研究發(fā)現(xiàn)，肝移植后1年內(nèi)新生DSA的概率為8.2%，且進(jìn)一步研究表明1年內(nèi)產(chǎn)生新生DSA的患者比沒有產(chǎn)生新生DSA受體的患者存活率低［32-33］。Goh等［34］對(duì)139例再次進(jìn)行活體肝移植的受體進(jìn)行研究分析，發(fā)現(xiàn)HLAⅠ類抗體與移植物損傷存在明顯的正相關(guān)關(guān)系。Musat等對(duì)43例肝移植后發(fā)生急性排斥反應(yīng)或慢性排斥反應(yīng)的患者進(jìn)行肝活檢，C4d染色后發(fā)現(xiàn)，患者C4d的沉積量與DSA強(qiáng)度存在明顯的正相關(guān)。且隨后的研究表明肝移植后產(chǎn)生DQ DSA的患者，發(fā)生慢性排斥反應(yīng)的概率高于產(chǎn)生非DQ DSA的患者，這一研究結(jié)果與其他器官移植的臨床研究結(jié)果相吻合［35］。另外，該研究表明，肝移植受體術(shù)后新生DSA的MFI值越高，慢性排斥反應(yīng)的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)越高［36］。進(jìn)一步的研究對(duì)IgG亞型與肝移植慢性排斥反應(yīng)的相關(guān)性做了分析，研究發(fā)現(xiàn)患者體內(nèi)具有多種DSA IgG亞型,比單種DSA IgG亞型更容易產(chǎn)生慢性排斥反應(yīng)（50% 比 14%），且IgG3亞型與移植物存在著明顯的正相關(guān)［37］。

4 總 結(jié)

因?yàn)楦我浦裁庖咛鼗堇碚摵团R床肝移植免疫排斥反應(yīng)輕微的原因，我們一直忽略了DSA在肝移植后的損害作用，并在臨床中一直忽視肝移植的HLA配型和DSA的監(jiān)測(cè)，缺乏相應(yīng)的肝臟移植AMR臨床診斷指標(biāo)。移植肝臟具有強(qiáng)大的自我再生能力，使其能承受患者預(yù)存DSA造成的早期肝損傷。近幾年的臨床研究逐漸表明，DSA與肝移植術(shù)后的急性排斥反應(yīng)、AMR發(fā)生與移植肝存活時(shí)間存在明顯的正相關(guān)，如果術(shù)前預(yù)存的HLA II類抗體較多，產(chǎn)生的肝損傷強(qiáng)于肝自身的恢復(fù)能力，就會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)烈的急性排斥反應(yīng)，降低移植受體的存活率。相比于腎移植和心臟移植，對(duì)于如何利用DSA指導(dǎo)肝移植臨床篩選供體和用藥還在起步階段。未來還需要利用更大規(guī)模的肝移植受體進(jìn)行DSA與病理學(xué)結(jié)果的分析，并思考如何共同利用DSA MFI值、DSA IgG亞型、DSA召集補(bǔ)體C1q和C3d這些指標(biāo)，共同預(yù)測(cè)肝移植后急性排斥反應(yīng)和慢性排斥反應(yīng)的發(fā)生，期望達(dá)到最佳肝臟移植存活效果。