李代紅，姚遠(yuǎn)，趙一賀（.天津市第一中心醫(yī)院，天津 3009；.北京博富瑞基因診斷技術(shù)有限公司，北京 0076）

慢性腎功能衰竭（chronic kidney disease，CRF）是指由各種原因引起腎臟損傷，體積明顯萎縮，且已不能維持腎臟基本功能的病癥。CRF惡化至終末期時(shí)被稱(chēng)為尿毒癥，此時(shí)藥物治療已無(wú)效，只有通過(guò)腎移植才能根治。目前我國(guó)有超過(guò)100萬(wàn)名尿毒癥患者，但每年只有1萬(wàn)名患者可以進(jìn)行腎移植手術(shù)，許多等待或不能進(jìn)行腎移植手術(shù)的患者只能不斷進(jìn)行血液透析等替代治療來(lái)延續(xù)生命，不少患者在等待腎源過(guò)程中死亡。面對(duì)我國(guó)如此稀缺的腎臟資源，如何通過(guò)優(yōu)化腎臟資源選取，減少尿毒癥重癥患者腎源的等待時(shí)間，提高移植腎存活率，一直是臨床醫(yī)生最為關(guān)注的問(wèn)題。

多年臨床實(shí)踐表明，大多數(shù)（＞80%）受體接受具有一個(gè)或多個(gè)人類(lèi)白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）錯(cuò)配的移植物，其最終失敗與產(chǎn)生針對(duì)錯(cuò)配供體HLA的供體特異性人類(lèi)白細(xì)胞抗原抗體（donor-specific human leukocyte antigenalloantibodies，DSA）相關(guān)，其介導(dǎo)各類(lèi)排斥反應(yīng)，如超急性排斥反應(yīng)、急性排斥反應(yīng)、加速性排斥反應(yīng)和慢性排斥反應(yīng)［1-2］。近年來(lái)，隨著新型強(qiáng)效免疫抑制劑的臨床運(yùn)用，腎移植的成功率明顯提高［3］，但由HLA抗體介導(dǎo)的體液免疫排斥反應(yīng)（antibody-mediated rejection，AMR）仍影響著移植后的人腎存活率。

隨著檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步，HLA抗體的檢測(cè)已由原來(lái)的補(bǔ)體依賴(lài)的微量淋巴細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)［4］（complement dependent cytotoxicity，CDC）、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）［5-6］和流式細(xì)胞術(shù)［7-8］發(fā)展為現(xiàn)在的基于Luminex平臺(tái)的微球分析法［9-10］，對(duì)HLA抗體檢測(cè)的靈敏性已滿足臨床需求。近年來(lái)利用以上方法對(duì)受體外周血DSA的檢測(cè)可以很好地預(yù)測(cè)移植后發(fā)生抗體介導(dǎo)的排斥反應(yīng)和移植腎失功的風(fēng)險(xiǎn)［11-12］，但隨著臨床經(jīng)驗(yàn)的積累和免疫學(xué)科的不斷發(fā)展，不少學(xué)者認(rèn)為受體DSA水平不能直接代表其免疫狀態(tài)，因?yàn)槠涞凸懒擞洃浶訠細(xì)胞對(duì)體液排斥反應(yīng)的影響［13］。研究表明，當(dāng)機(jī)體對(duì)某一蛋白抗原進(jìn)行免疫響應(yīng)時(shí)，將會(huì)同時(shí)產(chǎn)生漿細(xì)胞和記憶性B細(xì)胞。長(zhǎng)壽漿細(xì)胞可以持續(xù)產(chǎn)生高親和性的抗體結(jié)合抗原，給予機(jī)體免疫保護(hù)，當(dāng)機(jī)體再次遇到相同抗原時(shí)，記憶性B細(xì)胞可以迅速分化成長(zhǎng)壽漿細(xì)胞和短壽漿細(xì)胞，瞬間增加機(jī)體的特異性抗體濃度［14］。在器官移植中，有兩種不同的情況，記憶性B細(xì)胞可能起關(guān)鍵作用：① 在慢性AMR的情況下，其中持續(xù)活化的記憶性B細(xì)胞導(dǎo)致與免疫抑制暴露不足相關(guān)的低度但進(jìn)行性DSA形成，② 在高度致敏的患者中，接受含有先前由宿主識(shí)別的同種異體抗原的新移植物，從而觸發(fā)快速且在抗原再次暴露后強(qiáng)烈的繼發(fā)性DSA應(yīng)答［15］?；谝陨蠗l件，我們發(fā)現(xiàn)供體特異性HLA記憶性B細(xì)胞對(duì)移植后抗體排斥反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、優(yōu)化受體腎源選擇及減少受體等待時(shí)間具有重要的臨床意義。

1 國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀

1.1 記憶性B細(xì)胞的研究進(jìn)展：免疫記憶是高等脊椎動(dòng)物獲得性免疫應(yīng)答的顯著特征。體液免疫應(yīng)答與細(xì)胞免疫應(yīng)答是免疫記憶的兩大分支。記憶性B細(xì)胞是一類(lèi)具有記憶功能并持續(xù)存在于宿主體內(nèi)的細(xì)胞，由成熟的初始B細(xì)胞通過(guò)抗原激活分化而來(lái)。當(dāng)記憶性B細(xì)胞再次遇到相同抗原時(shí)，該細(xì)胞可迅速增殖并分化為漿細(xì)胞，以此產(chǎn)生高親和力的抗原特異性抗體，介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答，保護(hù)機(jī)體免受再次入侵抗原的感染［14］。

體液免疫的基本功能是抗體產(chǎn)生和抗體記憶。在感染、接種疫苗或是輸血、妊娠、移植后，通過(guò)B細(xì)胞受體（B cell receptor，BCR）對(duì)外來(lái)抗原的識(shí)別，成熟的初始B細(xì)胞會(huì)被激活，并分化為記憶性B細(xì)胞和漿細(xì)胞，使機(jī)體獲得免疫記憶功能［16］。維持機(jī)體免疫記憶功能的細(xì)胞主要是記憶性B細(xì)胞和長(zhǎng)壽漿細(xì)胞，且這種免疫記憶的維持是不依賴(lài)于抗原的［17］。長(zhǎng)壽漿細(xì)胞定居于骨髓中，能夠分泌抗體，低水平表達(dá)或不表達(dá)BCR，不能被刺激分化，也不能加速抗體產(chǎn)生。長(zhǎng)壽漿細(xì)胞在抗原被清除后的一段時(shí)間內(nèi)仍可以持續(xù)釋放高水平的中和性抗體。記憶性B細(xì)胞則大部分在外周血中循環(huán)，小部分定居于次級(jí)淋巴組織和骨髓中，表達(dá)高親和力的BCR，但不自主分泌抗體。研究表明，當(dāng)機(jī)體再次接觸相同抗原時(shí)，機(jī)體為了更有效清除入侵的非己物質(zhì)，IgG+B細(xì)胞可被快速活化，并增殖分化為產(chǎn)生高滴度、高親和力IgG抗體的分泌型細(xì)胞［16］。此外，記憶性B細(xì)胞除了分化為漿細(xì)胞產(chǎn)生抗體外，還可通過(guò)產(chǎn)生細(xì)胞因子或提呈抗原給T細(xì)胞，抵抗非己物質(zhì)的入侵［18］。

在初次免疫應(yīng)答期間，存在兩種不同類(lèi)型的記憶性B細(xì)胞在抗原再激發(fā)過(guò)程中表現(xiàn)出不同的功能：IgG+記憶性B細(xì)胞優(yōu)先分化成漿母細(xì)胞，而IgM+記憶性B細(xì)胞增殖更多并進(jìn)入生發(fā)中心反應(yīng)［15］。

1.2 記憶性B細(xì)胞體外檢測(cè)方法的研究進(jìn)展：如何活化誘導(dǎo)記憶性B細(xì)胞在體外增殖是檢測(cè)、研究其生理特性首先要面臨的問(wèn)題。因此，為精確評(píng)估HLA抗原特異性記憶B細(xì)胞在器官移植中的作用，需探索建立快速有效的B細(xì)胞活化方法。

經(jīng)典的初始B細(xì)胞活化途徑包括B細(xì)胞與抗原特異性結(jié)合以及抗原特異性T、B淋巴細(xì)胞的相互識(shí)別。但研究表明，記憶性B細(xì)胞的功能特性與初始B細(xì)胞存在差異，且活化方式也并不一致。因此，非抗原依賴(lài)的記憶性B細(xì)胞的活化增殖方案成為新的探索方向。研究發(fā)現(xiàn)，非抗原依賴(lài)的多克隆刺激劑CpG（cytosine-phosphate-guanine）、PWM（pokeweed mitogen） 和 SAC（staphylococcus aureus cowan）聯(lián)合誘導(dǎo)記憶性B細(xì)胞分化為抗體分泌細(xì)胞（antibody-secreting cells，ASC）［19］。而對(duì)于多種細(xì)胞因子的聯(lián)合應(yīng)用，如CpG + CD40L +IL-2 + IL-10 + IL-15和R848 + IL-2的體外培養(yǎng)模型中，記憶性B細(xì)胞則更有效地分化為ASC，并分泌大量的IgM或IgG［20-21］。

目前已有多種使外周血記憶性B細(xì)胞增殖分化為ASC并產(chǎn)生相關(guān)抗體的成熟體外培養(yǎng)方案。但對(duì)于記憶性B細(xì)胞的活化卻只是一種非特異性的多克隆激活方式，并分泌多克隆抗體［22-23］。如何從眾多活化的記憶性B細(xì)胞中篩選出針對(duì)某種抗原的抗原特異性記憶B細(xì)胞依然是臨床亟待解決的問(wèn)題。此前，國(guó)外已有不少器官移植相關(guān)試驗(yàn)通過(guò)體外表達(dá)純化的HLA抗原蛋白或用商業(yè)化的HLAⅠ類(lèi)位點(diǎn)和Ⅱ類(lèi)位點(diǎn)抗原混合物為抗原，通過(guò)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試 驗(yàn)（enzyme linked immunospot，ELISPOT） 檢 測(cè)HLA抗原特異性記憶B細(xì)胞的含量［24-25］。ELISPOT法測(cè)量HLA抗原特異性記憶B細(xì)胞雖然靈敏度高，但操作較為繁瑣，耗時(shí)較長(zhǎng)，且只能檢測(cè)患者是否存在HLA 抗原特異性記憶B細(xì)胞，并不能明確HLA抗原特異性記憶B細(xì)胞的HLA致敏位點(diǎn)。最近，隨著Luminex平臺(tái)技術(shù)的發(fā)展，HLA抗體檢測(cè)試劑盒的不斷成熟，國(guó)外已有實(shí)驗(yàn)室用商品化的HLA抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)刺激培養(yǎng)后的記憶性B細(xì)胞上清中的抗HLA抗體含量［26］。此方法雖然靈敏度不如ELISPOT法，但操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)小，且能準(zhǔn)確知道HLA抗原特異性記憶B細(xì)胞的HLA致敏位點(diǎn)，現(xiàn)已被國(guó)外多家實(shí)驗(yàn)室接受。

但基于Luminex平臺(tái)技術(shù)和HLA抗體檢測(cè)試劑盒（Luminex-single antigen bead，Luminex-SAB）發(fā)展起來(lái)的HLA抗原特異性記憶B細(xì)胞的檢測(cè)仍然存在以下缺陷：① HLA抗體檢測(cè)試劑盒中的HLA抗原是體外合成的，未必能反映體內(nèi)真實(shí)的抗原抗體結(jié)合反應(yīng)；② HLA抗體檢測(cè)試劑盒只能通過(guò)檢測(cè)熒光強(qiáng)度大致反映患者由記憶性B細(xì)胞分泌出來(lái)HLA抗體的多少，既不能非常準(zhǔn)確地分析檢測(cè)樣品中HLA抗體濃度也不能分析出樣品中HLA抗原特異性記憶B細(xì)胞的數(shù)量，遠(yuǎn)不能達(dá)到定量分析患者體內(nèi)HLA抗原特異性記憶B細(xì)胞的水平，較難作為臨床診斷指標(biāo)。

隨著記憶性B細(xì)胞研究的進(jìn)一步深入，荷蘭萊頓醫(yī)學(xué)院免疫血液及輸血科建立了一種基于ELISPOT的定量檢測(cè)供體特異性記憶B細(xì)胞的方法［27］。該方法主要通過(guò)植物血凝素（phytohaemagglutinin，PHA）刺激供體外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），使PBMC持續(xù)分化，細(xì)胞中的HLA抗原含量上升，然后通過(guò)HLAⅠ類(lèi)抗體和HLAⅡ類(lèi)抗體獲取供體HLA抗原。并利用這一供體特異性的HLA抗原與患者的記憶性B細(xì)胞進(jìn)行孵育，最終通過(guò)ELISPOT方法定量檢測(cè)出患者體內(nèi)含有供體HLA特異性記憶B細(xì)胞的數(shù)量。通過(guò)這一方法檢測(cè)患者的HLA抗原特異性記憶B細(xì)胞，無(wú)論是靈敏性、精確性還是可靠性都優(yōu)于Luminex-SAB檢測(cè)技術(shù)，但因?yàn)槠湟獙?duì)供體細(xì)胞進(jìn)行數(shù)日的誘導(dǎo)分化，使其在腎移植的臨床運(yùn)用受到限制，目前只能用于活體移植中。

2 HLA抗原特異性記憶B細(xì)胞在腎移植臨床中的應(yīng)用與前景

記憶性B細(xì)胞作為機(jī)體體液免疫的重要成員，在器官移植的免疫排斥反應(yīng)中起到重要作用，國(guó)外不少實(shí)驗(yàn)室已開(kāi)始對(duì)HLA抗原特異性記憶B細(xì)胞指標(biāo)在腎移植中的臨床應(yīng)用進(jìn)行了研究。

巴塞羅那醫(yī)學(xué)院腎臟內(nèi)科對(duì)10例腎移植術(shù)后發(fā)生AMR的患者進(jìn)行回顧性分析發(fā)現(xiàn)［28］，其中5例患者術(shù)前外周血群體反應(yīng)性抗體（panel reactive antibodies，PRA）檢測(cè)為陰性，5例患者為可疑陽(yáng)性。但當(dāng)他們利用Luminex-SAB方法檢測(cè)患者HLA抗原特異性記憶B細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)，9例患者都顯示為陽(yáng)性。該回顧性試驗(yàn)表明，患者外周血HLA抗體含量可能受患者當(dāng)時(shí)免疫狀態(tài)或免疫抑制劑等影響，含量變化較大，其濃度不能等同于患者此時(shí)相對(duì)應(yīng)HLA抗原的免疫狀態(tài)。而HLA抗原特異性B細(xì)胞作為HLA抗體的上游細(xì)胞，能更為準(zhǔn)確地預(yù)示患者針對(duì)于特定HLA位點(diǎn)發(fā)生排斥反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。 進(jìn)一步對(duì)等待移植患者血清HLA抗體和記憶性B細(xì)胞的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，30.8%（42/136）HLA抗體MFI＜1 500的患者，體內(nèi)均存有HLA抗原特異性記憶B細(xì)胞。

荷蘭萊頓大學(xué)醫(yī)學(xué)院輸血及免疫科對(duì)39例腎移植術(shù)前PRA陽(yáng)性的患者進(jìn)行分析［26］，研究發(fā)現(xiàn)，抗原特異性記憶B細(xì)胞的出現(xiàn)與患者所經(jīng)歷的免疫事件大小與次數(shù)相關(guān)。如只接受過(guò)輸血的患者，雖然體內(nèi)預(yù)存有HLA抗體，但只有較少幾率產(chǎn)生HLA抗原特異性記憶B細(xì)胞，而只經(jīng)歷過(guò)妊娠或移植的患者，產(chǎn)生HLA抗原特異性記憶B細(xì)胞的幾率也不高于60%，但當(dāng)患者同時(shí)經(jīng)歷過(guò)輸血、妊娠及移植，則幾乎必然會(huì)產(chǎn)生HLA抗原特異性記憶B細(xì)胞。另外，相關(guān)的臨床研究表明，利用HLA抗體檢測(cè)試劑盒測(cè)量患者外周血PRA時(shí)，因?yàn)槿肭治锟乖cHLA抗原相近等原因，獲得的假陽(yáng)性位點(diǎn)較多，不利于腎源選擇，但利用Luminex-SAB法檢測(cè)患者HLA抗原特異性記憶B細(xì)胞時(shí)，出現(xiàn)的HLA陽(yáng)性位點(diǎn)較少，且HLA陽(yáng)性位點(diǎn)均具有相同的致敏表位，利于供體腎源的選擇。以上臨床結(jié)果對(duì)我院腎移植專(zhuān)科的臨床指導(dǎo)意義重大，每年在我院等待腎移植患者中，PRA陽(yáng)性患者高達(dá)100人，這類(lèi)患者往往等待腎源的時(shí)間較長(zhǎng)，還有部分PRA高陽(yáng)性患者因?yàn)榈却坏胶线m的腎源而死亡。如果部分PRA陽(yáng)性患者只單獨(dú)接受過(guò)輸血，其產(chǎn)生抗原特異性記憶B細(xì)胞幾率較少，術(shù)前可以只需接受血漿置換或免疫吸附將HLA抗體濃度降低到安全水平即可，不需過(guò)分考慮腎源的配對(duì)問(wèn)題，大幅度降低患者等待腎源的時(shí)間。但以上結(jié)論獲得所依賴(lài)的病例數(shù)較少，且外周血PRA檢測(cè)陽(yáng)性而記憶B細(xì)胞上清PRA檢測(cè)陰性的HLA位點(diǎn)是否會(huì)給移植帶來(lái)排斥反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，還需要進(jìn)一步的臨床試驗(yàn)去驗(yàn)證。

綜上所述，近幾年來(lái)國(guó)外多個(gè)腎移植實(shí)驗(yàn)室已陸續(xù)開(kāi)展HLA抗原特異性記憶B細(xì)胞相關(guān)的臨床試驗(yàn)。現(xiàn)已表明，抗原特異性記憶B細(xì)胞在優(yōu)化腎源選擇，預(yù)示術(shù)后排斥風(fēng)險(xiǎn)上具有重要的臨床意義。但其研究和運(yùn)用時(shí)間尚短，還需要更多的臨床病例信息明確術(shù)后患者產(chǎn)生AMR是否與其預(yù)存HLA抗原特異性記憶B細(xì)胞相關(guān)，明確記憶性B細(xì)胞是否在腎移植各階段含量是否穩(wěn)定，是否可以作為一個(gè)穩(wěn)定指標(biāo)指導(dǎo)臨床診斷，明確輸血、妊娠、移植等免疫事件對(duì)HLA抗原特異性記憶B細(xì)胞產(chǎn)生的關(guān)系。最終為我們進(jìn)一步運(yùn)用抗原特異性記憶B細(xì)胞作為臨床指標(biāo)提供理論依據(jù)。