徐喆，趙凱，李志軍

（1.天津醫(yī)科大學研究生院，天津 300070；2.天津市南開醫(yī)院 心內一科，天津 300100；3.天津市第一中心醫(yī)院 中西醫(yī)結合科，天津 300192）

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）又稱糖尿病腎小球硬化癥，是常見的糖尿病慢性微血管并發(fā)癥，近年來其發(fā)病率呈逐漸上升趨勢[1-2]。糖尿病腎病的主要病理改變是細胞外基質的重構引起腎小球硬化和腎間質纖維化的病理改變，最終導致腎功能衰竭[2-3]。其中，腎小管上皮細胞間充質轉分化是損傷的腎細胞轉變成纖維細胞，進而發(fā)生腎纖維化的引發(fā)糖尿病腎病的關鍵[3-4]。研究表明，細胞自噬可以通過與細胞生長，增殖，存活和死亡相關的多種信號傳導途徑誘導和加速腎小管上皮細胞的損傷和死亡。LC3作為自噬激活的主要細胞學標志，定位于前自噬泡和自噬泡膜表面，主要由AMPK/mTOR信號通路調控。LC3主要分為LC3-I和LC3-Ⅱ 2個亞型，其中LC3-Ⅱ共價結合在磷脂酰乙醇胺的羧基端，并且更加牢固地結合在自噬體膜上，因此，通過檢測細胞內LC3-Ⅱ的含量變化，可以方便地判斷細胞狀態(tài)，LC3-II是細胞自噬泡膜的通用標記物。AMPK是一種重要的受體，有助于細胞識別能量調節(jié)的變化，mTOR激酶是自噬的主要調節(jié)劑和關鍵信號分子，該自噬途徑啟動受觸發(fā)因素影響，如營養(yǎng)剝奪、胰島素和其他生長因子，該因素可以與酪氨酸激酶受體結合而導致相關受體和磷酸肌醇3激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/AMP依賴的蛋白激酶（adenosine 5'-monophosphate AMP-activated protein kinase，AMPK）信號通路的激活，最終激活哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR），而mTOR的激活可直接抑制自噬的啟動，通過調控自噬相關基因LC3-Ⅱ阻斷自噬通路。因此，對于探尋有效的方法阻止和緩解腎小管上皮細胞的損傷，合理的控制和緩解細胞自噬造成的細胞損傷是DN研究的重點。本探討傳統(tǒng)中藥冬蟲夏草對DN腎小管上皮細胞增殖和分化的作用，及冬蟲夏草對糖尿病腎病的治療和防護作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

60只成年雄性Wistar大鼠（購自北京維通利華實驗動物技術有限公司）。大鼠飼養(yǎng)在無特定病原體（SPF）級動物實驗室，12 h/12 h晝夜循環(huán)光照，溫度為（22±2）℃。冬蟲夏草（商品名：百令膠囊），規(guī)格：0.5 g每粒，批號：110826（杭州中美華東制藥有限公司）。一抗兔抗多克隆抗體p-AMPK、p-mTOR、LC-II和ACTB（美國Santa Cruz生物技術有限公司），二抗堿性磷酸酶標記山羊抗兔IgG（北京中杉金橋生物技術有限公司），TUNEL細胞凋亡檢測試驗盒（上海碧云天生物工程有限公司），SDS-PAGE電泳設備及轉膜儀（美國Bio-rad公司）。

1.2 大鼠糖尿病模型復制

大鼠隨機分為對照組、模型組和實驗組，每組20只。參照文獻[5]。模型組和實驗組大鼠給予腹腔內1次注射鏈脲佐菌素（STZ）55 mg/kg誘導糖尿病模型。3 d后大鼠尾靜脈取血，監(jiān)測大鼠血糖在16.7～27.0 mmol/L，視為糖尿病造模成功。1周后對大鼠進行尿蛋白測定，若蛋白含量均＜30 mg/24 h，則為糖尿病大鼠的成功模型。模型成功后第2天給予實驗組大鼠冬蟲夏草灌胃[2.5 g/（kg·d）]，對照組和模型組給予同劑量生理鹽水灌胃，連續(xù)灌胃8周后處死大鼠。常規(guī)測定尿蛋白量和血肌酐；HE法檢測腎臟病理改變；TUNEL檢測腎小管細胞凋亡；采用Western blot檢測AMPK、mTOR和LC-Ⅱ的蛋白表達。

1.3 采樣與指標檢測

成模后第8周末將大鼠放入代謝籠中，收集排泄24 h的尿液，大鼠血糖用血糖儀測定。10%水合氯醛（300 mg/kg）將大鼠腹腔注射麻醉，雙縮脲法測定大鼠尿蛋白含量；心臟穿刺采血，終點酶法測血清肌酐含量。

處死大鼠后，分離兩腎，取左腎測定左腎體重比（LKW/BWT），置于液氮中備用；取右腎稱重后，用10%中性甲醛固定，常規(guī)脫水、透明及浸蠟包埋，連續(xù)石蠟切片6張（5 μm/張），切片用于HE染色和TUNEL原位凋亡細胞檢測。

1.4 TUNEL檢測原位凋亡細胞

切片加入標記液37℃孵育2 h后，加入生物素37℃孵育30 min。37℃恒溫孵育SABC試劑30 min，加入DAB顯色液進行顯色。切片用×20、×40物鏡顯微鏡進行觀察，細胞核中有棕黃色顆粒者即為凋亡細胞。每張切片選擇6個高倍鏡視野進行計數（×400），平均值即為切片凋亡細胞數。

1.5 Western blot檢測蛋白表達水平

取大鼠腎組織冰上裂解2 h，離心后用BCA試劑盒進行蛋白濃度檢測，將各組蛋白濃度總量調整為30 μg/μl。將各組蛋白樣品加入到10% SDS聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳，轉膜至PVDF膜后按1∶500的稀釋比例加入多克隆抗體p-AMPK、p-mTOR、LC-II、ACTB和二抗。ECL顯色劑顯色，用Bio-Pro凝膠成像分析儀成像以及用Quantity-one軟件對各泳道條帶進行灰度掃描得出相應蛋白表達量。

1.6 統(tǒng)計學方法

數據處理采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較做單因素方差分析，兩兩比較用Bonferroni's Multiple Comparison Test檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠物理及生化指標

與對照組比較，模型組和實驗組大鼠血糖含量增加，差異有統(tǒng)計學意義（F=47.310，P=0.000）；模型組和實驗組大鼠尿蛋白含量增加，差異有統(tǒng) 計 學 意 義（F=156.500，P=0.000）； 模 型 組和實驗組大鼠血清肌酐含量增加，差異有統(tǒng)計學意 義（F=33.900，P=0.000）； 模 型 組 和 實 驗 組大鼠LKW/BWT增加，差異有統(tǒng)計學意義（F=436.600，P=0.000）。

與模型組比較，實驗組大鼠血糖含量降低，差異有統(tǒng)計學意義（t=2.950，P=0.000）；尿蛋白含量降低，差異有統(tǒng)計學意義（t=3.141，P=0.000）；血清肌酐含量降低，差異有統(tǒng)計學意義（t=5.130，P=0.000）；LKW/BWT降低，差異有統(tǒng)計學意義（t=16.270，P=0.000）。見附表。

附表 3組大鼠物理及生化指標的比較 （n =20，±s）

附表 3組大鼠物理及生化指標的比較 （n =20，±s）

組別 血糖/（mmol/L） 尿蛋白/（mg/24 h） 血肌酐/（μmol/L） LKW/BWT/%對照組 8.21±0.92 4.52±1.22 40.55±7.28 0.32±0.02模型組 26.37±3.82 52.77±11.41 58.84±7.17 0.61±0.04實驗組 20.74±3.51 43.68±10.97 47.32±6.85 0.45±0.03 F值 47.310 156.500 33.900 436.600 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

2.2 HE染色結果

對照組大鼠的腎組織形態(tài)未見明顯異常，腎間質、腎小球和腎小管的結構基本正常。模型組大鼠可見腎小管上皮細胞出現大量的空泡變性，上皮細胞出現變形、脫落和部分壞死；腎小管出現管腔擴張、纖維化或萎縮，出現水腫和炎癥細胞浸潤；腎小球基底膜增厚，腎小球出現部分硬化，腎間質出現明顯的纖維組織增生。實驗組癥狀改善，腎間質腎小管結構破壞并不明顯，損傷有所改善。見圖1。

圖1 大鼠的腎組織形態(tài) （HE×400）

2.3 凋亡細胞

對照組僅見少量凋亡細胞，模型組和實驗組大鼠腎內凋亡細胞數量增多，與對照組大鼠凋亡細胞數量（47.232±5.118）比較，模型組大鼠凋亡細胞數量（184.734±13.610）和實驗組大鼠凋亡細胞數量（136.878±12.433）增加，差異有統(tǒng)計學意義（F=798.800，P=0.000）。與模型組比較，實驗組大鼠凋亡細胞數量降低，差異有統(tǒng)計學意義（t=13.700，P=0.000）。見圖 2、3。

圖2 原位凋亡細胞 （TUNEL×400）

圖3 3組凋亡細胞比較

2.4 3組蛋白表達水平比較

與對照組比較，模型組和實驗組中p-mTOR蛋白含量（47.234±5.122）降低，差異有統(tǒng)計學意義（F=272.100，P=0.000）；模型組和實驗組中p-AMPK蛋白含量升高，差異有統(tǒng)計學意義（F=198.400，P=0.000）；模型組和實驗組中LC-Ⅱ蛋白含量升高，差異有統(tǒng)計學意義（F=328.100，P=0.000）。

與模型組比較，實驗組p-mTOR蛋白含量升高，差異有統(tǒng)計學意義（t=13.720，P=0.000）；p-AMPK蛋白含量降低，差異有統(tǒng)計學意義（t=9.064，P=0.000）；LC-Ⅱ的蛋白含量降低，差異有統(tǒng)計學意義（t=10.456，P=0.000）。見圖 4。

圖4 3組mTOR、AMPK和LC-Ⅱ蛋白表達水平比較

3 討論

CS是一種名貴的蟲草屬植物類藥用真菌，主要由氨基酸、脂肪酸、多糖、有機酸和多種微量元素構成[6-7]。研究表明，CS可有效降低血尿素氮和尿蛋白，減輕腎臟病理改變，阻止腎小球代償性肥大[8-9]；能夠拮抗氨基糖苷所致的溶酶體損傷和脂質過氧化損傷，保護和調節(jié)腎組織表皮生長因子的表達，促進腎小管的修復和再生[9-10]；CS可以抑制腎組織和腎小球硬化，減輕腎小管萎縮和腎間質損傷，促進腎小管上皮細胞的修復，同時對腎間質纖維化有明顯的防治作用[11-12]；同時，冬蟲夏草能夠降低糖尿病動物模型中血膽固醇、血肌酐和血Ⅳ型膠原的表達，抑制和緩解腎組織纖維化，減輕和延緩腎臟病理變化，對糖尿病腎病所致的大鼠腎損傷起到治療和防護作用[10-12]。

本研究表明，冬蟲夏草可以緩解糖尿病腎病導致的大鼠血糖含量、尿蛋白含量、血清肌酐含量和LKW/BWT等常規(guī)指標增高的狀態(tài)。同時，CS持續(xù)作用糖尿病腎病大鼠后，大鼠腎臟的腎小管、腎小球和腎基質損傷緩解，還可以有效減輕腎小管細胞的細胞損傷和壞死。由于mTOR和AMPK已被確定為自噬的主要調節(jié)劑，AMPK是一種重要的受體，活化的AMPK負調節(jié)mTOR，在富含氨基酸和生長因子的營養(yǎng)充足時，細胞中mTOR被激活，用于阻斷自噬通路；而當營養(yǎng)缺乏，細胞處于饑餓環(huán)境時，mTOR的活性受到抑制，促進細胞自噬通路的發(fā)生[13-15]。LC-Ⅱ作為參與mTOR信號通路的主要細胞自噬蛋白，在細胞自噬，細胞周期，細胞凋亡的過程中起到主要的調節(jié)作用[15]。研究表明，冬蟲夏草的腎臟保護作用可通過有效調節(jié)AMPK/mTOR信號通路的表達，降低LC-3II蛋白的含量，可以有效降低腎小管細胞自噬的發(fā)生。

綜上所述，本研究表明冬蟲夏草提取物能改善糖尿病腎病大鼠的腎小管細胞的自噬作用，減輕腎小管細胞的損傷，延緩大鼠糖尿病腎病的進展。冬蟲夏草可能通過調節(jié)AMPK/mTOR信號通路的基因表達，延緩腎小管細胞的損傷。

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