李厚忠，高照渝，王慧，任公平，徐紅納，劉藝，鞏麗虹，張羽飛

（1.牡丹江醫(yī)學院，黑龍江 牡丹江 157011；2.牡丹江醫(yī)學院附屬紅旗醫(yī)院，黑龍江 牡丹江 157011；3.齊齊哈爾醫(yī)學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

支氣管哮喘（bronchial asthma，BA）簡稱哮喘，是一種高發(fā)病率的慢性炎癥性疾病，炎癥反應在哮喘發(fā)生和進展中發(fā)揮著重要作用，被認為可能是哮喘的可能發(fā)病機制之一[1-2]。目前臨床上常用的抗炎藥，如糖皮質(zhì)激素、白三烯受體拮抗藥等，能迅速控住氣道炎癥，效果良好，但是仍然存在一些弊端，如停藥后的復發(fā)，長期用藥導致全身或局部的不良反應等[3-4]。因此尋找一種安全有效而不良反應小的治療哮喘的藥物顯得格外重要。中藥大多為天然植物，不良反應相對較小，可作為很好的選擇。

川貝（Bulbus fritillariae cirrhosae）是具有代表性的川產(chǎn)道地名貴藥材，為臨床常用中藥，其性苦、甘，微寒，有化痰止咳、清熱散結、潤肺之功效，多用于熱痰、燥痰、肺虛勞嗽、久嗽、痰少咽燥及痰中帶血等最為對證，還常用于心胸郁結、肺痿、肺癰之證[5]。本研究前期實驗表明，川貝可有效降低哮喘模型模型小鼠一氧化氮（nitric oxide，NO）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、白細胞介素1（interleukin，IL-1）及白細胞介素6（interleukin，IL-6）含量，升高超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力等[6-7]，同時也降低哮喘模型模型小鼠血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和缺氧誘導因子1α（hypoxi-inducible factor-1α，HIF-1α）的表達[8]。本研究旨在前期研究基礎上，繼續(xù)觀察川貝對哮喘模型小鼠氣道炎癥及白細胞介素8（interleukin-8，IL-8）、白細胞介素13（interleukin-13，IL-13），CXC趨化因子受體（CXC chemokine receptor 2，CXCR-2）和趨化因子配體[腫瘤生長相關因子α（growth-related oncogene-α，GRO-α）、上皮細胞嗜中性粒細胞活性蛋白78（epithelial cell-derived neutrophil-activating protein-78，ENA-78） 及 嗜 中 性 活 性 肽 2（neutral active peptides-2，NAP-2）]的影響，探討其可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試藥中藥川貝粉的制備：選取整齊、粉性足者。用潔凈的紗布擦拭藥材表面以去除藥材表面的灰塵。凈選后的川貝通過滅菌消毒窗消毒15 min后直接轉(zhuǎn)至粉碎車間，用Fz-400型粉碎機組加工成100目細粉，收得的細粉裝入潔凈的容器中，封口。全部加工完后的細粉用潔凈的塑料袋分裝成1 kg/袋備用。臨用時參照唐德才等主編的《中藥學》所載成人所用劑量為3～6 g/d，根據(jù)動物體表面積等效劑量計算方法，計算小鼠給藥劑量18.0 mg/kg為高劑量組，9.0 mg/kg為低劑量組。分別稱取川貝粉18 mg，9 mg各溶于生理鹽水5 ml，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.1.2 實驗動物雌性BALB/c小鼠50只，6～8周齡，由哈爾濱醫(yī)科大學動物實驗中心提供，實驗動物合格證號為：P00102008，實驗動物使用許可證號：SYXK（黑）2008-033?？照{(diào)恒溫室內(nèi)22℃，相對濕度50%，自由飲水飲食，通風換氣8次/h。

1.1.3 試劑和儀器卵蛋白（OVA）（Sigma公司），兔抗人CXCR-2多克隆抗體、兔抗人GRO-α多克隆抗體、兔抗人ENA-78多克隆抗體及羊抗人NAP-2多克隆抗體（美國Santa Cruz公司），IL-8和IL-13檢測試盒（美國ADL公司），其他試劑均為國產(chǎn)或進口分析純。恒溫水浴箱（HH-W210420L）（天津泰斯鵬儀器有限公司），微量加樣器（3112）（德國eppendorf），自動平衡離心機（LDZ5-2）（北京京立離心機有限公司），電子天平（UW820S）（日本島津電子天平），超聲霧化器（402A）（江蘇魚躍醫(yī)療設備股份有限公司），光學顯微鏡（BH-2）（日本Olympus公司），粉碎機組（Fz-400）（天津市茂源制藥機械有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 模型復制健康清潔級BALB/c小鼠40只，腹腔內(nèi)注射10% OVA+10%氫氧化鋁混合液1 ml作為首次致敏，第15天將小鼠依次置于超聲霧化器中，用1%OVA生理鹽水噴霧激發(fā)小鼠哮喘發(fā)作，隔日1次，1次20 min，共激發(fā)10 d。以小鼠出現(xiàn)口唇發(fā)紺、腹肌痙攣、呼吸加快、點頭呼吸或站立不穩(wěn)等表現(xiàn)為成功激發(fā)。共復制成功30只。

1.2.2 分組及給藥將成功復制的哮喘模型小鼠隨機分模型組、高劑量組及低劑量組，每組10只；另設正常組（10只以生理鹽水代替OVA進行腹腔注射及霧化吸入）。分組后每天灌胃給藥，正常組和模型組給予等量生理鹽水，高劑量組，低劑量組分別按照18.0及9.0 mg/kg劑量給予川貝粉，每天1次，連續(xù)28 d。

1.2.3 支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）白細胞分類計數(shù)最后1次給藥2 h后，各組小鼠用1%巴比妥鈉麻醉，剪掉頸部毛發(fā)后剪開皮膚，分離氣管周圍的組織，氣管作一橫行切口，插入氣管插管；心臟采血0.8～1.0 ml，EDTA抗凝，用于ELISA檢測。結扎右主支氣管，經(jīng)氣管插管10 ml生理鹽水分3次灌洗左肺，回收BALF經(jīng)2 000 r/min離心15 min，棄上清液，取沉渣經(jīng)生理鹽水重懸。Diff-Quik染色液染色BALF細胞涂片后，作細胞分類計數(shù)。切取右支氣管平滑肌固定于10%的中性甲醛中，用于病理學觀察。切取右肺門部位組織用于免疫組織化學和realtime PCR分析。

1.2.4 支氣管平滑肌病理學觀察將右支氣管平滑肌組織10%中性甲醛固定后，常規(guī)酒精脫水，石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察各組小鼠支氣管平滑肌病理學變化。評判標準：沒有炎癥細胞（0分）；有少量炎癥細胞（1分）；較多分布炎癥細胞，且分布不均（2分）；大量炎癥細胞，少許聚集成團，且分布較均勻（3分）；可見大量炎癥細胞并且聚集成團（4分）。

1.2.5 血清IL-8和IL-13濃度測定采用ELISA測定IL-8和IL-13的濃度，嚴格按照ELISA試劑盒的操作說明書進行操作。每份樣品檢測3次。

1.2.6 免疫組織化學分析檢測CXCR-2和GRO-α、ENA-78、NAP-2陽性細胞右肺門組織石蠟切片、脫蠟、脫水、浸泡于3% H2O2中15 min滅活內(nèi)源性過氧化物酶。置于煮沸檸檬酸鈉中修復抗原，暴露抗原表位并且用3%小牛血清蛋白阻斷。滴加一抗、二抗及鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶復合物，DAB顯色、鏡下觀察至出現(xiàn)棕黃色陽性信號后蒸餾水沖洗終止反應，蘇木素復染、封片，拍照。隨機選定3個HPF（×200倍，用Image Pro Plus 6.0 圖像分析軟件測出光密度（OD）值，并計算平均OD值。

1.2.7 Real-time PCR分析CXCR-2和GRO-α、ENA-78、NAP-2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平Trizol試劑提取肺組織總RNA，檢測RNA純度，按照Real-time PCR試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄反應，合成單鏈的cDNA。cDNA產(chǎn)物置入-20℃冰箱冷凍保存。利用Pubmed查找相關基因序列，并利用引物合成軟件Primer Premier 5.0設計引物。Real-time PCR反應體系：體積為25 μl；反應程序為：94℃變性45 s，60℃復性45 s，72℃延伸50s，共28個循環(huán)，72℃再延伸7 min。每個樣本以內(nèi)參基因β-actin調(diào)整。每個樣本以內(nèi)參基因β-actin調(diào)整。2-ΔΔCt法定量分析。每份樣品檢測3次。引物序列見表1。

表1 Real-time PCR引物序列

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，各組數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，方差齊時，采用one-way-ANOWA分析，組間兩兩比較采用LDS-t檢驗；方差不齊時采用Games-Howell檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 BALF白細胞分類計數(shù)結果

各組小鼠BALF中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞和嗜酸性粒細胞計數(shù)比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。模型組中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞和嗜酸性粒細胞計數(shù)與正常組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；高劑量組和低劑量組中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞和嗜酸性粒細胞計數(shù)與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 各組小鼠BALF分類細胞計數(shù) （n =10，×104/ml，±s）

表2 各組小鼠BALF分類細胞計數(shù) （n =10，×104/ml，±s）

注：1）與正常組比較，P ＜0.05；2）與模型組比較，P ＜0.05

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圖1 各組小鼠支氣管平滑肌病理學觀察 （HE染色×200）

2.2 支氣管平滑肌病理學觀察及半定量分析結果

HE染色結果顯示，正常組小鼠支氣管壁完整，平滑肌呈正常厚度，支氣管黏膜平整，細胞排列整齊，管腔內(nèi)無上皮細胞脫落，支氣管平滑肌內(nèi)及其周圍無明顯炎癥細胞浸潤；模型組小鼠基層細胞增生，排列紊亂，平滑肌增厚，支氣管壁和周圍肺組織中有大量炎癥細胞浸潤，主要是嗜酸性粒細胞和淋巴細胞，支氣管黏膜上皮脫落，水腫，管腔內(nèi)有分泌物，以上改變也證明哮喘模型復制成功；高劑量組和低劑量組小鼠支氣管平滑肌和氣管壁厚度減少，支氣管腔內(nèi)少量黏液和脫落細胞，支氣管噬酸性粒細胞和其他炎癥細胞浸潤有所減少，支氣管噬酸性粒細胞及其他炎癥細胞浸潤減少，幾乎消失，平滑肌和管壁厚度幾乎接近正常組，支氣管黏膜平整規(guī)則，管腔內(nèi)偶爾可見脫落上皮細胞和少量黏液。見圖1。各組小鼠炎癥評分比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=12.451，P=0.001）。模型組炎癥評分與正常組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；高劑量組和低劑量組炎癥評分與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表 3。

表3 各組小鼠炎癥評分結果 （n =10，分，±s）

表3 各組小鼠炎癥評分結果 （n =10，分，±s）

注：1）與正常組比較，P ＜0.05；2）與模型組比較，P ＜0.05

組別 炎癥評分正常組 1.13±0.18模型組 3.37±0.471）高劑量組 1.93±0.172）低劑量組 1.98±0.132）F值 12.451 P值 0.001

2.3 ELISA結果

各組小鼠血清IL-8和IL-13濃度比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。模型組血清IL-8和IL-13濃度與正常組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；高劑量組和低劑量組血清IL-8和IL-13濃度與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表4。

表4 各組小鼠血清IL-8和IL-13濃度（n =10，pg/mL，±s）

表4 各組小鼠血清IL-8和IL-13濃度（n =10，pg/mL，±s）

注 ：1）與正常組比較，P ＜0.05 ；2）與模型組比較，P ＜0.05

組別 IL-8 IL-13正常組 327.00±57.01 382.80±56.82模型組 765.50±82.241） 834.24±86.241）高劑量組 421.69±47.672） 469.30±19.982）低劑量組 587.56±30.762） 682.60±24.802）F值 12.176 14.763 P值 0.001 0.000

圖2 各組小鼠免疫組織化學結果 （免疫組織化學×200）

2.4 免疫組織化學結果

免疫組織化學分析結果顯示，CXCR-2和GRO-α、ENA-78、NAP-2陽性細胞的胞漿呈棕黃色表達，主要為支氣管上皮細胞和平滑肌細胞。正常組小鼠陽性細胞表達較低，而模型組小鼠表達較高，高劑量組和低劑量組小鼠表達降低。見圖2。各組小鼠CXCR-2和GRO-α、ENA-78、NAP-2 OD值比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。模型組鼠CXCR-2和GRO-α、ENA-78、NAP-2 OD值與正常組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；高劑量組和低劑量組鼠CXCR-2和GRO-α、ENA-78、NAP-2 OD值與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表5。

表5 各組小鼠CXCR-2和GRO-α、ENA-78、NAP-2表達 （n =10，±s）

表5 各組小鼠CXCR-2和GRO-α、ENA-78、NAP-2表達 （n =10，±s）

注：1）與正常組比較，P ＜0.05；2）與模型組比較，P ＜0.05

OD值CXCR-2 GRO-α ENA-78 NAP-2正常組 152.80±25.14 173.20±27.07 233.40±38.72 115.19±21.11模型組 916.63±154.201） 820.64±124.501） 1231.00±206.301） 1024.82±208.481）高劑量組 304.17±27.862） 415.50±57.392） 549.50±80.932） 363.76±58.642）低劑量組 401.51±31.592） 497.41±45.622） 833.79±48.012） 575.92±47.072）F值 16.746 13.534 16.263 13.639 P值 0.001 0.001 0.000 0.001組別

2.5 Real-time PCR結果

各 組 小 鼠CXCR-2和 GRO-α、ENA-78、NAP-2 mRNA表達比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。模型組 鼠 CXCR-2和 GRO-α、ENA-78、NAP-2 mRNA表達與正常組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；高劑量組和低劑量組鼠CXCR-2和GRO-α、ENA-78、NAP-2 mRNA表達與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表 6。

表6 各組小鼠CXCR-2和GRO-α、ENA-78、NAP-2 mRNA表達 （n =10，±s）

表6 各組小鼠CXCR-2和GRO-α、ENA-78、NAP-2 mRNA表達 （n =10，±s）

注：1）與正常組比較，P ＜0.05；2）與模型組比較，P ＜0.05

mRNA表達CXCR-2 GRO-α ENA-78 NAP-2正常組 0.173±0.026 0.041±0.007 0.327±0.027 0.247±0.047模型組 0.414±0.0591） 0.743±0.1011） 1.228±0.1981） 1.189±0.1751）高劑量組 0.240±0.0262） 0.347±0.0642） 0.404±0.0612） 0.499±0.0652）低劑量組 0.301±0.0122） 0.531±0.0342） 0.729±0.0812） 0.675±0.0442）F值 10.481 24.935 7.642 17.423 P值 0.001 0.000 0.008 0.000組別

3 討論

氣道的炎癥是哮喘的特征性病理改變，包括多種炎癥細胞參與，如中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞和嗜酸性粒細胞等[9]。動物實驗研究表明，BALF中存在大量的中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞和嗜酸性粒細胞是哮喘的典型特征[10-11]。當哮喘發(fā)作時，誘發(fā)機體的免疫反應，引起中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞和嗜酸性粒細胞活化、向炎癥部位趨化、聚集，從而釋放炎癥介質(zhì)（如內(nèi)皮素、血小板活化因子及白三烯等）間接或者直接損傷氣道上皮細胞，引發(fā)氣道炎癥[12]。故此，中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞和嗜酸性粒細胞也稱為哮喘的主要炎癥效應細胞，與哮喘的嚴重程度呈正相關，是哮喘臨床診斷最為重要的指標。本研究顯示，模型組小鼠BALF中存在大量的中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞和嗜酸性粒細胞，與以往研究相一致，而正常組小鼠BALF中性粒細胞、巨噬細胞，淋巴細胞和嗜酸性粒細胞較少；給予川貝，高劑量組和低劑量組小鼠BALF中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞和嗜酸性粒細胞均較模型組降低。同時，本研究病理學觀察也證實川貝可降低哮喘小鼠炎癥評分。以上結果提示，川貝可有效抑制哮喘模型小鼠氣道炎癥反應，改善哮喘癥狀。研究證實，IL-8和IL-13在哮喘的發(fā)病中起重要作用，且在哮喘的氣道炎癥形成中發(fā)揮更重要的作用[13]。IL-8是趨化因子超家族中的一員（CXCL亞家族），也是中性粒細胞主要的趨化劑和激活劑，又名中性粒細胞趨化因子，同時還是哮喘氣道炎癥的上調(diào)因子，對多種炎癥細胞具有趨化作用，并與哮喘的嚴重程度密切相關[14]。IL-13是一種具有多效性的免疫調(diào)節(jié)功能的細胞因子，對哮喘的氣道炎癥具有激發(fā)和促進作用，是哮喘病理改變發(fā)生和發(fā)展的主要因素，可導致哮喘氣道慢性持續(xù)性炎癥，增加氣道阻力，促進哮喘發(fā)病[15]。本研究顯示，模型組小鼠血清IL-8和IL-13濃度較高，而正常組小鼠血清濃度較低；給予川貝，高劑量組和低劑量組小鼠血清IL-8和IL-13濃度降低。以上結果提示，川貝對哮喘模型小鼠抑制炎癥反應的機制可能與其抑制IL-8和IL-13濃度有關。

趨化因子是一大類功能結構基本相似，具有和相應的受體結合，誘導中性粒細胞、淋巴細胞及單核細胞等細胞趨化游走的作用，從而介導炎癥部位的細胞聚集活化，并參與組織損傷的小分子蛋白質(zhì)[16]。CXCR-2屬于趨化因子受體超家族中的重要成員之一，是趨化因子主要受體。趨化因子受體是表達在中性粒細胞、巨噬細胞等炎癥細胞表面上介導相應趨化因子發(fā)揮生物學功能的關鍵的G蛋白偶聯(lián)受體超家族。常見的趨化因子配體有GRO-α、ENA-78及NAP-2等。CXCR-2可與GRO-α、ENA-78及NAP-2等特異結合，趨化表達CXCR2的中性粒細胞、淋巴細胞等細胞的游走及脫顆粒等一系列生物學效應，在機體的防御和炎癥反應等方面起重要作用，為哮喘治療的新靶點[17]。目前，以趨化因子受體CXCR-2為靶點的藥物已有所開發(fā)[18]。研究發(fā)現(xiàn)，在IL-13的刺激下，支氣管平滑肌的CXCR-2和GRO-α、ENA-78、NAP-2均升高，且與中性粒細胞的移行和活化有關[19]。本研究顯示，模型組小鼠CXCR-2和GRO-α、ENA-78、NAP-2陽性細胞和基因表達均較高，與以往研究相一致[20]，而在正常組小鼠CXCR-2和GRO-α、ENA-78、NAP-2陽性細胞和基因表達均較低；給予川貝，高劑量組和低劑量組小鼠CXCR-2和GRO-α、ENA-78、NAP-2陽性細胞和基因表達降低。以上結果提示，川貝對哮喘模型小鼠抑制炎癥反應的機制可能與其抑制CXCR-2和GRO-α、ENA-78、NAP-2有關。

綜上所述，中藥川貝可通過降低中性粒細胞、巨噬細胞，淋巴細胞和嗜酸性粒細胞計數(shù)，進而緩解小鼠哮喘的發(fā)作，減輕哮喘模型小鼠支氣管平滑肌的炎癥反應，其機制可能與其抑制IL-8、IL-13，CXCR-2和GRO-α、ENA-78、NAP-2有關。

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