劉文麗，穆欣，張鍵

（西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院，西安 710061）

硬皮病（Scleroderma,SD）是一種以皮膚變硬、增厚，伴有各種程度的慢性炎癥浸潤(rùn)和顯著的纖維增生性微血管病變及體液和細(xì)胞免疫改變?yōu)樘卣鞯淖陨砻庖咝约膊1]，其發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，目前還不能完全闡明，可能與微血管病變、免疫反應(yīng)、細(xì)胞外基質(zhì)合成過多相關(guān)[1-3]。SD因其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜而成為一種難治性疾病，危害程度大，可累及到皮膚以及包括心肺、消化道等在內(nèi)的內(nèi)臟器官，導(dǎo)致器官結(jié)構(gòu)破壞和功能減退乃至衰竭，嚴(yán)重威脅人類健康和生命，給患者帶來(lái)極大的經(jīng)濟(jì)及精神壓力[3]。迄今的研究一致認(rèn)為TGF-β在SD的發(fā)病過程中扮演重要角色，其中TGF-β/Smads信號(hào)傳導(dǎo)途徑異?？赡馨l(fā)揮重要作用[4]。Smads家族作為TGF-β受體胞內(nèi)激酶底物受到廣泛關(guān)注，Smad3與Smad7是該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的重要分子，分別為受體活化型與抑制型Smads成員，參與介導(dǎo)多種纖維化疾病的發(fā)生[5]。本次研究通過檢測(cè)正常皮膚與SD患者皮損中Smad3與Smad7 mRNA的表達(dá)，探討其在SD發(fā)病機(jī)制中的潛在作用及臨床診斷與治療價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 資料來(lái)源 本次研究共納入2009年2月—2012年6月西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科門診和住院收取的46例臨床和病理確診、未經(jīng)治療的SD患者作為研究對(duì)象。其中男14例，女32例，平均年齡（27.2±11.3）歲。對(duì)所有SD患者進(jìn)行分型：28例為系統(tǒng)型硬化（Systemic sclerosis,SSc），18例為局限型硬皮?。↙ocalized scleroderma,LSc）。根據(jù)皮膚病變過程對(duì)SD患者進(jìn)行分期：14例為水腫期，17例為硬化期，15例為萎縮期。所有患者中18例出現(xiàn)關(guān)節(jié)痛、活動(dòng)受限等現(xiàn)象，11例發(fā)生明顯的肺纖維化，6例出現(xiàn)左心功能不全癥狀，5例出現(xiàn)高血壓?；颊叩钠p取材集中在四肢、腹部、面部。所有患者均經(jīng)組織病理學(xué)明確診斷，均具有典型的硬皮病皮膚臨床表現(xiàn)；患者的病程均小于1年，收集皮損前4周均未服用任何可能導(dǎo)致皮膚硬化的藥物，均未接受激素、免疫調(diào)節(jié)劑等治療。排除合并其他皮膚病或發(fā)生皮膚潰爛的患者；排除近期進(jìn)行過皮膚硬化癥等治療的患者；排除合并有嚴(yán)重原發(fā)性疾病及精神病患者，如心、腦血管，肝、腎、內(nèi)分泌系統(tǒng)及造血系統(tǒng)等。另選取15例我院整形外科因美容進(jìn)行手術(shù)切除患者的健康正常皮膚（取材部位集中在四肢、腹部、面部）作為對(duì)照。納入研究的患者均告知本研究的目的及方法，所有患者均簽署知情同意書，研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法 標(biāo)本常規(guī)石蠟包埋制成連續(xù)5 μm切片，采用原位RT-PCR法進(jìn)行染色。石蠟包埋的新鮮組織切片常規(guī)脫蠟至水，蛋白酶K消化，過氧化物酶阻斷。RT-PCR實(shí)驗(yàn)步驟：切片滴加10 μL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，30℃孵育10 min，42℃孵育 30 min，99℃2 min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，冷卻至5℃保持5 min；切片上滴加PCR反應(yīng)體系40 μL，輕蓋蓋玻片，指甲油封閉后置于原位擴(kuò)增板上；80℃熱啟動(dòng)進(jìn)行PCR擴(kuò)增（其循環(huán)參數(shù)為：94℃變性1 min；51℃退火1 min；72℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)，結(jié)束后72℃延伸10 min，4℃保存）；去蓋玻片，50mL/L小牛血清封閉液室溫20 min；滴加SABC試劑室溫下孵育20 min；滴加新鮮配制的AEC顯色劑，水溶性封片劑封片，鏡下觀察結(jié)果。每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)立陰性對(duì)照，陰性對(duì)照以雙蒸水代替引物作為質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 結(jié)果 原位RT-PCR結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)Shimizu法[6]改良而成。在顯微鏡下（×400倍）隨機(jī)選取5個(gè)視野（每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞），按照陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比（陽(yáng)性率）及染色強(qiáng)度分級(jí)評(píng)分。根據(jù)陽(yáng)性率分為4級(jí)，陰性為0分，陽(yáng)性率＜20%為1分，20%～50%為2分，＞50%為3分；根據(jù)染色強(qiáng)度分為3級(jí)：無(wú)著色為0分，淺著色為1分，深著色為2分；上述2項(xiàng)積分相加：＜2分為陰性（-），2分為弱陽(yáng)性（+），3分為陽(yáng)性（++），≥4分為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，2組間比較采用Mann-Whitney U秩和檢驗(yàn)，3組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)。2個(gè)變量之間相關(guān)分析采用Spearman秩相關(guān)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SD患者皮損和對(duì)照組正常皮膚中Smad3 mRNA的表達(dá) SD患者與對(duì)照組患者相比，性別、年齡等基本信息相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。原位RT-PCR結(jié)果顯示，SD患者皮損中Smad3 mRNA表達(dá)水平為：陰性0例，弱陽(yáng)性4例，陽(yáng)性12例，強(qiáng)陽(yáng)性30例；對(duì)照組正常皮膚中Smad3 mRNA表達(dá)水平為：陰性0例，弱陽(yáng)性4例，陽(yáng)性7例，強(qiáng)陽(yáng)性4例；2組相比SD患者皮損中Smad3 mRNA的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組正常皮膚（P＜0.05），見表1。典型患者的原位RT-PCR結(jié)果如圖1與圖2所示。

表1Smad3、Smad7 mRNA在SD組與對(duì)照組間的比較

2.2 SD患者皮損和對(duì)照組正常皮膚中Smad7 mRNA的表達(dá) SD患者皮損中Smad7 mRNA表達(dá)水平為：陰性4例，弱陽(yáng)性15例，陽(yáng)性22例，強(qiáng)陽(yáng)性5例；對(duì)照組正常皮膚中Smad3 mRNA表達(dá)水平為：陰性1例，弱陽(yáng)性2例，陽(yáng)性5例，強(qiáng)陽(yáng)性7例；2組相比SD患者皮損中Smad7 mRNA的表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組正常皮膚（P＜0.05），見表1。典型患者的原位RT-PCR結(jié)果如圖3與圖4所示。

圖1 正常皮膚組織Smad3 mRNA的表達(dá)（原位 RT-PCR ×400）

圖2SD組織Smad3 mRNA的表達(dá)（原位RT-PCR×400）

圖3 正常皮膚組織Smad7 mRNA的表達(dá)（原位RT-PCR ×400）

圖4SD組織Smad7 mRNA的表達(dá)（原位RT-PCR×400）

2.3 SD患者皮損和對(duì)照組正常皮膚中Smad3與Smad7 mRNA的相關(guān)性分析 采用Spearman秩相關(guān)性分析對(duì)Smad3與Smad7 mRNA的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：對(duì)照組正常皮膚中Smad3與Smad7的mRNA水平呈正相關(guān)（r=0.603,P＜0.05），而SD患者的皮損中Smad3與Smad7的mRNA水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（r=-0.130,P＞0.05），見表2。

表2 Smad3與Smad7的相關(guān)性分析

2.4 不同分型與分期SD患者皮損中Smad3與Smad7 mRNA水平的比較 對(duì)SD患者進(jìn)行分型，SSc與LSc患者皮損中Smad3或Smad7 mRNA的表達(dá)水平相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。根據(jù)皮膚病變過程對(duì)SD患者進(jìn)行分期，不同分期患者皮損中Smad3或Smad7 mRNA的表達(dá)水平相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表 3。

表3 Smad3、Smad7 mRNA在各分型與分期SD患者間的比較

3 討論

筆者之前的研究顯示，在組織水平上，SD患者皮損中Smad3的蛋白水平是升高的，Smad7的蛋白水平是降低的[7]。也有報(bào)道指出Smad3在體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞中表達(dá)升高，Smad7在體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞中表達(dá)降低[8]。在對(duì)其他組織或器官的纖維化研究中，如瘢痕疙瘩的纖維中，也曾發(fā)現(xiàn)Ⅰ、Ⅲ型膠原及Smad3 mRNA的表達(dá)量是升高的[9]。有關(guān)腎臟疾病的研究指出，除輕度IgA腎病外，其他所有類型病變腎小球均有TGF-β和Smad3 mRNA的表達(dá)增加[10]。本次研究通過檢測(cè)正常皮膚與SD患者皮損中Smad3與Smad7 mRNA的表達(dá)，探討其在SD發(fā)病機(jī)制中的潛在作用及臨床診斷價(jià)值。

硬皮病是一種以皮膚變硬、增厚，伴有各種程度的慢性炎癥浸潤(rùn)和顯著的纖維增生性微血管病變及體液和細(xì)胞免疫改變?yōu)樘卣鞯淖陨砻庖咝约膊1-3]。根據(jù)其發(fā)病累及范圍不同，主要分為系統(tǒng)性硬皮?。⊿Sc）和局限性硬皮?。↙Sc）2 種類型[2，11]。SD患者癥狀輕者可致殘、毀容，癥狀重的可導(dǎo)致死亡。在美國(guó)，SSc的5年生存率為50%，與腫瘤相當(dāng)，而內(nèi)臟器官的纖維化是引起硬皮病患者高死亡率的最重要因素。SD的發(fā)病機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，目前還不能完全闡明。纖維化的發(fā)生是膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）合成與降解不平衡的結(jié)果。TGF-β是最強(qiáng)的ECM沉積促進(jìn)劑，它能使ECM的合成增加、降解減少[12]。在硬皮病的發(fā)生發(fā)展過程中，TGF-β一方面能直接促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖，另一方面可通過Smads依賴通路在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)膠原蛋白等ECM基因的表達(dá)[13]。

Smad3屬于受體活化型，參與多種基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)，Smad3增加不僅通過增加膠原的合成，而且通過減少金屬蛋白酶的降解和增加金屬蛋白酶抑制劑的合成促進(jìn)纖維化的發(fā)生[14]。本次研究顯示SD患者皮損中Smad3 mRNA表達(dá)量升高，提示Smad3 mRNA表達(dá)升高可能是導(dǎo)致TGF-β作用增強(qiáng)，膠原過度沉積及組織纖維化的重要因素。Smad7為抑制型Smad，組成TGF-β信號(hào)環(huán)路的負(fù)性調(diào)節(jié)信號(hào)[15]。報(bào)道指出體外培養(yǎng)SD成纖維細(xì)胞中基礎(chǔ)水平及TGF-β誘導(dǎo)Smad7的表達(dá)能力明顯受損。本次研究發(fā)現(xiàn)SD患者皮損中Smad7 mRNA的表達(dá)量顯著低于對(duì)照組正常皮膚，Smad7 mRNA的降低可能導(dǎo)致成纖維細(xì)胞在TGF-β刺激下過度活化。

本次研究中，對(duì)照組正常皮膚中Smad3與Smad7 mRNA的水平呈正相關(guān)，而SD患者的皮損中Smad3與Smad7 mRNA的水平間無(wú)顯著相關(guān)性。正常情況下，細(xì)胞內(nèi)TGF-β/Smad信號(hào)的激活在時(shí)間及空間上是緊密配對(duì)的，即信號(hào)激活的同時(shí)伴隨抑制信號(hào)的發(fā)生。在SD患者皮損中Smad3與Smad7 mRNA水平之間的不同步性打破了TGF-β/Smad信號(hào)的平衡，為SD的發(fā)病提供了基礎(chǔ)。

綜上所述，本次研究表明，與健康正常的皮膚相比，SD患者的皮損中Smad3 mRNA發(fā)生上調(diào)，Smad7 mRNA發(fā)生下調(diào)。這種變化導(dǎo)致Smad3與Smad7 mRNA水平之間的相關(guān)性缺失。這可能是TGF-β介導(dǎo)的SD患者生理平衡改變與SD病理發(fā)生的關(guān)鍵因素。因此，SD患者Smad3與Smad7 mRNA的檢測(cè)可能對(duì)SD患者的診斷與治療提供新的思路。

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