王玲，范文葛，毛敏

（江蘇省常熟市第一人民醫(yī)院，常熟215500）

乳房外 Paget?。‥xtramammary Paget’s disease,EMPD）又稱乳房外濕疹樣癌，是一種少見的惡性皮膚腫瘤。細(xì)胞周期的調(diào)控異常與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。細(xì)胞周期調(diào)控的主要物質(zhì)包括細(xì)胞周期蛋白

Cyclins、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（Cyclindependent kinases,CKDs）和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制蛋白（Cyclin-dependent kinases inhibitors,CDKIs）作為細(xì)胞周期調(diào)控的正性調(diào)控因子，細(xì)胞的癌變與Cyclins的過度表達(dá)有密切關(guān)系。本研究旨在討論CyclinA和CyclinB1在EMPD中的表達(dá)情況及其與EMPD發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。為探討CyclinA和CyclinB1與EMPD發(fā)生的關(guān)系，我們用免疫組化方法，檢測(cè)CyclinA和CyclinB1在EMPD皮損中的表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集常熟市第一人民醫(yī)院2010年1月—2017年7月經(jīng)組織病理確診為EMPD標(biāo)本共28例，其中男23例，女5例，年齡54～83歲，平均69歲，皮損主要位于陰囊及腹股溝處，見圖1。術(shù)前均未實(shí)施放、化療?；颊邿o胃腸道腫瘤或泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤。另取18例正常皮膚組織作為對(duì)照。

1.2 主要試劑 兔抗人CyclinA購(gòu)自武漢博士德公司。兔抗人CyclinB1和二步法免疫組化檢測(cè)試劑購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 免疫組化染色 免疫組化染色按免疫組化二步法檢測(cè)試劑盒操作說明書進(jìn)行操作。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水；高溫法修復(fù)抗原，3%H2O2用室溫孵育10min，滴加一抗（工作濃度為 1∶50），37℃孵育 1.5h，加二抗37℃孵育0.5 h，DAB顯色。用已知陽性片作為陽性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判斷 CyclinA和CyclinB1陽性染色為細(xì)胞核著色，為棕黃色顆粒。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)參照Campo等[1]的標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合染色強(qiáng)度和染色百分率進(jìn)行結(jié)果判定。染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：基本不著色為0分，著色弱為1分，著色中度為2分，著色強(qiáng)為3分。染色百分率評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：著色細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)＜5%為 0分，6%～25%為 1分，26%～50%為 2分，＞50%為3分。以染色強(qiáng)度和染色百分率的評(píng)分之和進(jìn)行結(jié)果判定：0分為陰性（-），1～2分為弱陽性（+）,3～4分為陽性（++）,≥5強(qiáng)陽性（+++）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，采用卡方檢驗(yàn)。CyclinA和CyclinB1的相關(guān)性分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)。

2 結(jié)果

2.1 CyclinA在EMPD和正常皮膚組織中的表達(dá) 28例EMPD患者標(biāo)本中有22例（78.6%）CyclinA表達(dá)陽性，其中5例弱陽性，17例為強(qiáng)陽性，陽性表達(dá)位于細(xì)胞核，見圖2；18例正常皮膚組織中有1例CyclinA表達(dá)弱陽性。兩者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=23.365，P＜0.05）。結(jié)果見表 1。

圖1 EMPD的臨床和組織病理圖片（B：HE染色×100倍）

圖2 CyclinA在EMPD中的陽性表達(dá)（A：DAB染色 ×100倍，B：DAB染色×400倍）

表1 CyclinA和CyclinB1在EMPD和正常皮膚組織中的表達(dá) 例

2.2 CyclinB1在EMPD和正常皮膚組織中的表達(dá) 28例EMPD患者標(biāo)本中有24例（85.7%）CyclinB1表達(dá)陽性，其中6例弱陽性，18例為強(qiáng)陽性，陽性表達(dá)位于細(xì)胞核，見圖3；18例正常皮膚組織中有2例CyclinB1表達(dá)陽性。兩者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=24.814，P＜0.05）。結(jié)果見表 1。

圖3 CyclinB1在EMPD中的陽性表達(dá)（DAB染色A×100倍，B×400倍）

2.3 CyclinA和CyclinB1在EMPD組織中表達(dá)的相互關(guān)系 Spearman等級(jí)相關(guān)分析表明，在EMPD組織中，CyclinA和CyclinB1兩者表達(dá)呈正相關(guān)，見表2。

表2 EMPD組織中CyclinA和CyclinB1表達(dá)的相關(guān)性 例

3 討論

CyclinA是細(xì)胞周期重要的正性調(diào)控因子，它的正常表達(dá)是保證細(xì)胞S期、G2/M期順利完成的主要因子。研究發(fā)現(xiàn)CyclinA與腫瘤的增殖有相關(guān)性，曾將CyclinA作為腫瘤擴(kuò)增的標(biāo)記[2]。CyclinA過表達(dá)，見于皮膚鱗癌、瘢痕癌、舌癌、胃癌等[3-6]。CyclinA過表達(dá)持續(xù)性激活細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2（CDK2），促進(jìn)G1/S期轉(zhuǎn)換，一旦這種機(jī)制超越了細(xì)胞周期的控制，便會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞周期的循環(huán)加速和細(xì)胞過度增殖，最終導(dǎo)致細(xì)胞癌變。本研究結(jié)果顯示，CyclinA在EMPD中的陽性表達(dá)明顯高于正常組織，表明CyclinA在EMPD的發(fā)生中起重要作用，并對(duì)EMPD的早期診斷有一定的參考價(jià)值，同時(shí)可能為EMPD的治療提供新的作用靶點(diǎn)和理論基礎(chǔ)。

CyclinB1是細(xì)胞周期G2/M轉(zhuǎn)換的重要正性調(diào)節(jié)因子。CyclinB1過表達(dá)使細(xì)胞周期G2/M轉(zhuǎn)換時(shí)間縮短，促進(jìn)細(xì)胞過度增殖，導(dǎo)致細(xì)胞癌變。研究表明CyclinB1與多種惡性腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期調(diào)控異常密切相關(guān)，在喉鱗狀細(xì)胞癌、眼瞼基底細(xì)胞癌、腦膠質(zhì)瘤等組織中存在CyclinB1高表達(dá)[7-9]。本研究中發(fā)現(xiàn)，EMPD組CyclinB1的陽性率為85.7%，明顯高于對(duì)照組，提示在正常皮膚組織、EMPD中細(xì)胞增殖活性不同，細(xì)胞過度增殖可能與EMPD的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，CyclinB1可以作為EMPD發(fā)生發(fā)展的檢測(cè)指標(biāo)。

本研究結(jié)果顯示，在EMPD中有CyclinA與CyclinB1的異常高表達(dá)，并呈正相關(guān)，提示CyclinA與CyclinB1的過表達(dá)可能協(xié)同調(diào)控了細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞異常增殖，最終導(dǎo)致腫瘤形成，提示兩者在EMPD腫瘤形成機(jī)制中可能起重要作用。

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