謝軍培 戴益琛 陳章興 曾偉 詹曉娟 傅育卡 沈許德

(中國人民解放軍第一七四醫(yī)院消化內(nèi)科,福建 廈門 361003)

大腸癌是臨床常見惡性腫瘤之一，世界范圍內(nèi)其發(fā)病率居第3位。目前研究發(fā)現(xiàn)大部分大腸癌起源于大腸腺瘤，但對(duì)結(jié)腸腺瘤確切癌變途徑和分子機(jī)制目前尚不清楚[1-3]。目前研究發(fā)現(xiàn)父系表達(dá)基因10(Paternally expressed gene 10, PEG10)在多種腫瘤中發(fā)揮重要作用，如前列腺癌、胃癌、食管癌、肝癌、乳腺癌，尤其亞細(xì)胞定位影響腫瘤生物學(xué)功能[4-7]。然而，關(guān)于PEG10蛋白與大腸癌生物學(xué)功能文獻(xiàn)國內(nèi)外報(bào)道尚少。本文旨在通過RNA干擾(RNA interference,RNAi)技術(shù)引發(fā)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制來研究PEG10對(duì)大腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。本研究以結(jié)腸癌SW620細(xì)胞系為研究對(duì)象，探討應(yīng)用siRNA敲低結(jié)腸癌細(xì)胞中腫瘤特異性PEG10的表達(dá)，以期發(fā)現(xiàn)PEG10在大腸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制以及它在調(diào)節(jié)大腸癌細(xì)胞生長及侵襲等生物學(xué)功能方面的作用，進(jìn)而為PEG10能否成為是大腸癌早期診斷和治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般資料 SW620大腸癌細(xì)胞株購買于ATCC(Ameriean type culture eolleetion)公司；空載體Pu6為本實(shí)驗(yàn)室保存；PEG10多克隆抗體購自美國Proteintech公司；C57BL/6小鼠購自中國上海動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) SW620大腸癌細(xì)胞貼壁生長細(xì)胞，培養(yǎng)于含嘌呤霉素(濃度為100u/ml)的10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，放置于37℃、含5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱，定期更換新鮮培養(yǎng)液。當(dāng)細(xì)胞濃度約90%融合時(shí)即開始傳代，棄去陳舊的培養(yǎng)基，再往培養(yǎng)基中加入0.25%胰蛋白酶，消化3分鐘，棄去消化液，再次加入新培養(yǎng)基，反復(fù)吹打皿底上的細(xì)胞，使之形成均勻單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后立即移至新培養(yǎng)皿中進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 構(gòu)建PEG10干擾細(xì)胞株和過表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞株 經(jīng)序列同源性比對(duì)(BLAST)設(shè)計(jì)含siRNA靶序列的正、反義寡核苷酸。將所得到的靶序列按要求插入到相應(yīng)位置，形成最終如下寡核苷酸鏈: Sense 5’-GCAGUCGGAGGAGAACAAC-3’, Antisense 5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’。轉(zhuǎn)染前將大腸癌SW620細(xì)胞以合適的細(xì)胞密度接種在DMEM培養(yǎng)液的6孔板內(nèi), 在37℃培養(yǎng)箱進(jìn)行恒溫培養(yǎng)，確保細(xì)胞轉(zhuǎn)染高效/穩(wěn)定。待細(xì)胞濃度達(dá)到90%的融合, 按照siPEG10質(zhì)粒∶脂質(zhì)體比例為4 μg：10 μL加入質(zhì)粒復(fù)合物及Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染細(xì)胞，加入新鮮的培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)設(shè)立siPEG10質(zhì)粒組、pU6質(zhì)粒對(duì)照組。用濃度為2.5μg/mL的嘌呤霉素培養(yǎng)基篩選，培養(yǎng)并轉(zhuǎn)染對(duì)照組及重組質(zhì)粒的細(xì)胞。待2周后篩選出PEG10干擾細(xì)胞株，分別提取細(xì)胞蛋白驗(yàn)證干擾效果。

1.2.3 PEG10蛋白的亞細(xì)胞定位 將SW620結(jié)腸癌細(xì)胞接種到培養(yǎng)皿中，用4%多聚甲醛固定10min。磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液沖洗3次。細(xì)胞采用0.2%Triton X-100透化處理10 min，用含2%牛血清白蛋白進(jìn)行封閉30 min。PBS溶液沖洗3次。加入抗PEG10蛋白抗體，在溫箱中放置l h。PBS溶液沖洗3次。加入熒光標(biāo)記的二抗，室溫孵育45 min。PBS溶液沖洗3次。加入0.5 mg/L的4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)溶液染色15 min。PBS溶液沖洗3次。最后加人20ul封片劑封片，-70℃冰箱中備用。激光掃描共聚焦顯微鏡成像拍照定位。

1.2.4 Western-blot蛋白檢測(cè) 收集經(jīng)過處理后的細(xì)胞，采用含蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液反復(fù)裂解。BCA法進(jìn)行定量蛋白質(zhì)，取60ug蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分析，采用120V 恒壓轉(zhuǎn)移2h，室溫內(nèi)用2%BSA 封閉30min，待檢測(cè)的一抗與NC膜室溫孵育1h；PBST緩沖液反復(fù)洗膜3次，每次10min，將HRP標(biāo)記的二抗加入，室溫孵育30min。最后NC膜用ECL發(fā)光試劑盒處理，進(jìn)行顯影。

1.2.5 SW620細(xì)胞的侵襲能力 采用含有基質(zhì)膠的Transwell小室進(jìn)行研究，實(shí)驗(yàn)前在Transwell小室內(nèi)外加入500ul無血清的DMEM，經(jīng)常規(guī)消化后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。每孔加入無血清的細(xì)胞懸液500ul,培養(yǎng)箱孵育22h后，反復(fù)用PBS沖洗，最后用甲醇固定，祛除上室底部膜上的細(xì)胞，反復(fù)采用PBS沖洗三遍，再加入0.1%結(jié)晶紫溶液200ul，37℃孵育30 min。最后拍照計(jì)數(shù)。

1.2.6 C57BL/6小鼠皮下成瘤生長情況 20只4-6個(gè)月大小的雄性C57BL/6小鼠，將其隨機(jī)分為四組。在每只小鼠皮下分別注射5× 106細(xì)胞，7天后開始觀察小鼠實(shí)體瘤和體重的變化增長情況。采用游標(biāo)卡尺測(cè)量增長的腫瘤最大以及最小直徑，小鼠的腫瘤體重和大小每隔2天進(jìn)行測(cè)量。體積計(jì)算公式=[長(mm)×寬2]/2。第3周后，處死小鼠，取出瘤體進(jìn)行拍照，根據(jù)測(cè)量數(shù)據(jù)繪制腫瘤增長曲線。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 全部數(shù)據(jù)均采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗(yàn)對(duì)兩組計(jì)量資料差異進(jìn)行比較，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PEG10蛋白的亞細(xì)胞定位 激光掃描共聚焦顯微鏡成像表明，PEG10蛋白均定位在細(xì)胞質(zhì)。PEG10在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)在共聚焦顯微鏡下，應(yīng)用不同的抗體檢測(cè)到的熒光信號(hào)基本一致。未經(jīng)細(xì)胞膜預(yù)處理的SW620活細(xì)胞中均未檢測(cè)到PEG10熒光信號(hào)，經(jīng)0.2%Triton X-100 預(yù)處理組中細(xì)胞質(zhì)上PEG10熒光信號(hào)明顯強(qiáng)于細(xì)胞核中信號(hào)，見圖1。

圖1 PEG10在大腸癌細(xì)胞SW620的亞細(xì)胞定位(400×) Figure 1 Subcellular localization of PEG10 in colorectal cancer cells (400 x)

2.2 干擾質(zhì)粒PU6-SiRNA-PEG10的鑒定 將陽性對(duì)照組為成功驗(yàn)證PEG10蛋白表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組為在SW620細(xì)胞中提取蛋白。Western-blot結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組顯示一條特異性條帶與對(duì)照的陽性條帶大小一致(見圖2)；利用Westen blot的方法檢測(cè)穩(wěn)轉(zhuǎn)siRNA-PEG10-SW620細(xì)胞組、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pU6質(zhì)粒的SW620細(xì)胞中PEG10蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示siRNA-PEG10細(xì)胞組在翻譯水平的表達(dá)具有明顯抑制效果，見圖3。

圖2 SW620細(xì)胞內(nèi)源性PEG10表達(dá)的驗(yàn)證Figure 2 validation of endogenous PEG10 in SW620 cells

圖3 Westen blot檢驗(yàn)PEG10干擾蛋白表達(dá)Figure 3 Expression of siPEG10 by Westen blot

2.3 干擾PEG10對(duì)SW620細(xì)胞侵襲的影響 利用Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力，結(jié)果示穩(wěn)轉(zhuǎn)siRNA PEG10-SW620組有較少細(xì)胞穿越基質(zhì)膠，而穩(wěn)定轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒組有較多細(xì)胞穿過基質(zhì)膠(見圖4)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞的侵襲能力，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖5)。光鏡下拍照、計(jì)數(shù)、取均值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。本結(jié)果表明穩(wěn)定轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒組細(xì)胞較對(duì)照組細(xì)胞侵襲水平減弱，說明PEG10蛋白在增強(qiáng)SW620細(xì)胞侵襲力方面發(fā)揮重要作用。

圖4 兩組SW620細(xì)胞侵襲能力的比較Figure 4 Cell invasion ability of the two groups

圖5 兩組細(xì)胞侵襲能力統(tǒng)計(jì)比較Figure 5 Statistical comparison of invasion ability in the two groups

2.4 PEG10對(duì)裸鼠移植瘤生長的影響 皮下注射穩(wěn)定的siPEG10-SW620和Pu6-SW620細(xì)胞(對(duì)照組)在C57BL/6小鼠皮下移植瘤模型的建立，動(dòng)態(tài)觀察瘤體生長情況。注射細(xì)胞后1周，開始測(cè)量實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組裸鼠移植瘤的大小，每隔3天記錄一次直到小鼠生長第24天。結(jié)果揭示：與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組siPEG10-SW620細(xì)胞在裸鼠皮下移植瘤生長更緩慢，見圖6。

圖6 各組小鼠皮下瘤的生長情況比較Figure 6 Tumor growth of mice subcutaneous

3 討論

隨著我國經(jīng)濟(jì)發(fā)展和生活水平的日益提高，大腸癌早期篩查提示大腸癌的發(fā)病率呈逐年增長態(tài)勢(shì)，2016年中國腫瘤年報(bào)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)城市地區(qū)大腸癌發(fā)病率占29.5/10萬，占全部惡性腫瘤的12.81%，居第三位；死亡率為14.7/10萬，居第四位[8-11]。國內(nèi)外學(xué)者已證實(shí)大腸癌是惡性腫瘤致死的重要原因之一[12]。大腸癌發(fā)生、發(fā)展是多因素、多步驟的積累過程，確切發(fā)病機(jī)制目前尚不明確。大多患者就診時(shí)已屬中晚期，而化療成為大腸癌的重要輔助治療，在轉(zhuǎn)移和預(yù)防其復(fù)發(fā)中發(fā)揮著不可替代的作用，而多數(shù)患者化療藥物治療效果一般，其主要原因是大腸癌對(duì)多種化療藥存在廣泛的耐藥性，導(dǎo)致耐藥現(xiàn)象的發(fā)生機(jī)制目前研究發(fā)現(xiàn)與多藥耐藥及相關(guān)基因異常表達(dá)有關(guān)[13-14]。因此尋找參與大腸癌侵襲、轉(zhuǎn)移和化療耐藥的特異靶點(diǎn)并闡明其機(jī)制迫在眉睫。本實(shí)驗(yàn)研究確定了父系表達(dá)基因10(Paternally Expressed Gene 10，PEG10)在小鼠大腸癌細(xì)胞SW620的表達(dá)。2001年，日本科學(xué)家Ono等用cDNA 微陣列在肝癌細(xì)胞組織中發(fā)現(xiàn)一個(gè)父方表達(dá)的基因組印記基因(PEG10)，該基因定位于人類7 號(hào)染色體長臂2 號(hào)帶1 號(hào)位( 7q21)[15-16]。目前研究發(fā)現(xiàn)PEG10基因可促進(jìn)細(xì)胞的生長，也有研究發(fā)現(xiàn)這類基因的過表達(dá)或表達(dá)缺失可導(dǎo)致細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化[17-18]。將PEG10基因轉(zhuǎn)染到不表達(dá)PEG10的肝癌細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞生長明顯加速，下調(diào)PEG10基因表達(dá)可抑制肝癌細(xì)胞的生長，表明PEG10基因具有促進(jìn)肝癌細(xì)胞生長的作用[19-20]。

本研究通過采用RNAi技術(shù)沉默細(xì)胞系SW620中PEG10基因表達(dá)，與此同時(shí)觀察PEG10基因在人大腸癌細(xì)胞系SW620細(xì)胞定位、對(duì)增殖、侵襲等過程中的作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)改變PEG10基因表達(dá)可影響大腸癌細(xì)胞的侵襲和生長能力。Transwell分析結(jié)果也表明，與對(duì)照組相比，PEG10基因沉默后穿過Transwell小室的大腸癌細(xì)胞數(shù)減少，上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示PEG10基因?qū)W620大腸癌細(xì)胞遷移能力的影響；抑制SW620細(xì)胞中PEG10的表達(dá)，抑制細(xì)胞生長，為進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠性，我們采用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，研究顯示與體外細(xì)胞研究結(jié)果一致，確定了PEG10基因在大腸癌中重要作用。然而，所涉及的分子機(jī)制方面還需進(jìn)一步研究。目前研究發(fā)現(xiàn)ERK/MAPK信號(hào)通路的激活與大腸癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。雖然PEG10在癌癥中的確切作用是未知的，這其中的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路需要進(jìn)一步研究。

本研究仍存在不足，PEG10 核聚集現(xiàn)象需要進(jìn)一步的動(dòng)態(tài)試驗(yàn)觀察方可進(jìn)一步得以證實(shí)。同時(shí)，在小部分大腸癌細(xì)胞中核聚集的PEG10的具體原因仍然不明，是否與凋亡狀態(tài)有關(guān)，在將來，仍需要大量的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)大腸癌細(xì)胞中的PEG10 的具體作用機(jī)制。本研究結(jié)果顯示在結(jié)腸癌組織特異表達(dá)的遺傳印記基因PEG10在大多數(shù)結(jié)腸癌組織中發(fā)生了印記丟失現(xiàn)象，PEG10的印記丟失可能是其在結(jié)腸癌組織中過表達(dá)的原因之一。結(jié)腸癌中PEGl0印記異常現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)為我們從表觀遺傳學(xué)角度探討結(jié)腸癌發(fā)病機(jī)制提供了新的線索。加大樣本量進(jìn)一步證實(shí)本研究結(jié)果以及深入研究結(jié)腸癌中PEG10的印記調(diào)控機(jī)制將有助于我們進(jìn)一步了解結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制。

4 結(jié) 論

資料顯示，父系表達(dá)基因10 ( Paternally Expressed Gene 10，PEG10)在體內(nèi)外對(duì)小鼠大腸癌細(xì)胞SW620的侵襲和生長能力有促進(jìn)作用，可為大腸癌早期診斷和治療提供相關(guān)臨床依據(jù)。

[1]Al-Asmari AK, Ullah Z, Al Balowi A,etal. In vitro determination of the efficacy of scorpion venoms as anti-cancer agents against colorectal cancer cells: a nano-liposomal delivery approach[J]. Int J Nanomedicine, 2017, 12: 559-574.

[2]Wang C, Jette N, Moussienko D,etal. ATM-Deficient Colorectal Cancer Cells Are Sensitive to the PARP Inhibitor Olaparib[J]. Transl Oncol, 2017, 10(2): 190-196.

[3]Zhu XS, Dai YC, Chen ZX,etal. Knockdown of ECHS1 protein expression inhibits hepatocellular carcinoma cell proliferation via suppression of Akt activity[J]. Crit Rev Eukaryot Gene Expr 2013, 23(3): 275-82.

[4]何煒,王全玉,李曉敏,等.Notchl和c-Met在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其與血管生成擬態(tài)和預(yù)后的關(guān)系[J].西部醫(yī)學(xué),2016,28(9):1203-1206.

[5]Zhang J, He P, Zhong Q,etal. Increasing Cystatin C and Cathepsin B in Serum of Colorectal Cancer Patients[J]. Clin Lab, 2017, 63(2): 365-371.

[6]Kainz B, Shehata M, Bilban M,etal. Overexpression of the paternally expressed gene 10 (PEG10) from the imprinted locus on chromosome 7q21 in high-risk B-cell chronic lymphocytic leukemia[J]. Int J Cancer, 121(9): 1984-93.

[7]Zhang FW, Cheng HC, Jiang CD,etal. Imprinted status of pleomorphic adenoma gene-like I and paternal expression gene 10 genes in pigs[J]. J Anim Sci, 2007, 85(4): 886-90.

[8]朱小三,戴益琛,陳章興,等.ECHS1經(jīng)線粒體途徑調(diào)控HepG2細(xì)胞凋亡[J].中國生物工程雜志,2013,22(8):10-14.

[9]Chen H, Sun M, Zhao G,etal. Elevated expression of PEG10 in human placentas from preeclamptic pregnancies[J]. Acta Histochem, 2012, 114(6):589-93.

[10] Wen J, Liu L, Song G,etal. Biallele expression of PEG10 gene in primordial germ cells derived from day 27 porcine fetuses[J]. Reprod Domest Anim, 2010, 45(6):e375-81.

[11] 朱小三,戴益琛,陳章興,等.烯脂酰輔酶A水合酶短鏈1促進(jìn)結(jié)腸癌HepG2細(xì)胞的增殖[J].腫瘤, 2013, 33(05): 422-427.

[12] 賈文斌,孫欣,杜志杰,等.青蒿琥酯對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116和HT29的增殖與凋亡[J].中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新, 2015, 12(12): 4-7.

[13] Hua Y, Ma X, Liu X,etal.Identification of the potential biomarkers for the metastasis of rectal adenocarcinoma[J]. APMIS, 2017, 125(2): 93-100.

[14] 龍庭鳳,楊靜,沈麗達(dá),等.結(jié)腸癌組織中CIAPIN1 mRNA表達(dá)及意義[J].西部醫(yī)學(xué),2016,28(09):1243-1245.

[15] Ha GS, Kim YW, Choi EH,etal. Factors Associated with the Lack of Adjuvant Chemotherapy Following Curative Surgery for Stage II and III Colon Cancer: A Korean National Cohort Study[J]. Anticancer Res, 2017, 37(2): 915-922.

[16] Wu Y, Fang B, Yang XQ,etal. Therapeutic Molecular Targetingof 15-Lipoxygenase-1 in Colon Cancer[J]. Mol Ther,200,16(5):886-892.

[17] 朱小三,戴益琛.ECHS1的表達(dá)異常與臨床的關(guān)系[J].醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志, 2013,10(03):158-161.

[18] Xie JP, Zhu XS, Dai YC,etal. Expression of enoyl coenzyme A hydratase, short chain, 1 , in colorectal cancer and its association with clinic pathological characteristics[J]. Mol Clin Oncol, 2014, 2(1): 1081-1084.

[19] Chen H, Sun M, Liu J,etal. Silencing of Paternally Expressed Gene 10 Inhibits Trophoblast Proliferation and Invasion[J]. PLoS One, 2015, 10(12): 0144845.

[20] Agosto-Arroyo E, Isayeva T, Wei S,etal.Differential Gene Expression in Ductal Carcinoma In Situ of the Breast Based on ERBB2 Status[J]. Cancer Control, 2017, 24(1): 102-110.