任凱旋 涂岳圣 朱濤 駱萬婷 林家衍 葉煥榮 方俊杰

(1.南方醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)五年制，廣東 廣州 510280；2.南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院呼吸內(nèi)科，廣東 廣州 510280)

炎癥是機(jī)體對損傷產(chǎn)生的一種保護(hù)性反應(yīng)，但過度的炎癥反應(yīng)也可直接導(dǎo)致組織細(xì)胞的損傷和死亡，抗炎治療目前已經(jīng)成為慢性炎性疾病的主要治療手段，如對動脈粥樣硬化、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、哮喘、膿毒血癥、急性呼吸窘迫綜合征和急性胰腺炎等[1-5]。大黃素是大黃的主要藥理成分，研究發(fā)現(xiàn)大黃素對多種炎癥性疾病如急性胰腺炎、動脈粥樣硬化及哮喘有良好的治療效果[6-7]。有實驗證明大黃素對炎癥的調(diào)控作用主要與阻斷NF-κB的活化密切相關(guān)[7-8]。同時有研究顯示PPARγ信號通路可能參與了大黃素對NF-κB活化的調(diào)控作用，但具體的關(guān)系尚未明確[8-9]。因此，本研究旨在探究大黃素對LPS誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的調(diào)控作用及其相關(guān)信號通路，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和材料 RAW264.7細(xì)胞購自中國典型培養(yǎng)物保存中心；大黃素及LPS購自Sigma Chemical公司；siRNA-PPARγ (sc-29455) 和siRNA-scrambled (sc-37007)購自美國Santa Cruz Biotechnology公司；β-actin、ICAM-1抗體、MCP-1抗體、PPARγ抗體、NF-κB p65及磷酸化NF-κB p65抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology公司；超純水。其余試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)于添加青霉素(100 IU/mL)、鏈霉素(100 μg/mL)以及10%熱滅活胎牛血清的培養(yǎng)基中，置于37°C、95%空氣、5% CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗。取細(xì)胞置于96孔板上，密度為每孔2×103個細(xì)胞。預(yù)先用大黃素(25 μM)干預(yù)RAW264.7細(xì)胞。使用siRNA轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞。干預(yù)4h后加入LPS (100 ng/mL)。6h后使用MTT比色法檢測細(xì)胞活性[10]。提取蛋白和mRNA，同時收集培養(yǎng)液上清保存于-80°C用于ELISA。

1.2.2 細(xì)胞ICAM-1 mRNA、 MCP-1 mRNA表達(dá)檢測 qPCR測定ICAM-1和 MCP-1的mRNA表達(dá)定量，β-actin為內(nèi)參，按照PCR試劑盒說明書提取總RNA。采用PrimerScript RT試劑盒用于反轉(zhuǎn)錄。使用iQ 5多色實時熒光定量PCR檢測系統(tǒng)和熒光定量PCR試劑盒用于擴(kuò)增，得到含1.6ul cDNA的培養(yǎng)液20ul，加入正向及反向引物各0.8 μL、10μL SYBR Premix Ex TaqTM II及6.8 μL去離子水。引物和探針使用Primer Premier設(shè)計。引物序列為：ICAM-1正義：5’-AGGTGT GATATCCG GTAGAT-3’，反義：5’-CCTT CTAAGT GGTTGGAACA-3’；MCP-1正義：5’-TTAAAAA CCTGG ATCGGA ACCAA-3’，反義：5’-GCATTAGC TTCAG ATTTAC GGGT-3’；PPARγ正義：5’-AGGTGT GATATCCG GTAGAT-3’，反義：5’-TTATTC ATCAGG GAGGCCAG-3’；β-actin 正義：5’-GATTAC TGCTCT GGCTCC TAGC-3’，反義：5’-ACTCAT CGTA CTCC TGCTTGCT-3’?；虮磉_(dá)水平變化采用2△△Ct法測定，△△Ct=(Cttarget-Ctβ-actin) sample-(Cttarget-Ctβ-actin) control[11]。

1.2.3 Western blot 將分別含有等量蛋白(150 μg)的樣本溶解于10% Tris-glycine SDS電緩沖液，轉(zhuǎn)膜后使用ICAM-1抗體，MCP-1抗體，PPARγ抗體，磷酸化NF-κB p65抗體，NF-κB p65抗體或β-actin抗體作為一抗在4°C環(huán)境下孵化24h，加入二抗并室溫下孵化1h。用ECL進(jìn)行顯色，用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描。使用ICAM-1/β-actin、MCP-1/β-actin和PPARγ/β-actin以及Phospho-NF-κB p65/total NF-κB p65顯影強(qiáng)度比值進(jìn)行蛋白表達(dá)量及磷酸化水平分析[12]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS17.0進(jìn)行單因素方差分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩樣本均數(shù)多重比較采用LSD法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞ICAM-1、MCP-1和TNF-α的表達(dá)水平 與Control組相比較，RAW264.7細(xì)胞在LPS干預(yù)6h后ICAM-1、MCP-1 mRNA和蛋白的表達(dá)量及TNF-α的表達(dá)水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。但LPS組較Emodins+LPS組和Emodins+LPS+siRNA-PPARγ組ICAM-1、MCP-1 mRNA和蛋白TNF-α的表達(dá)水平升高更加顯著，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；且Emodins+LPS+siRNA-PPARγ組較Emodins+LPS組升高更加明顯，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。同時Emodins+LPS組和Emodins+LPS+siRNA-scramble組ICAM-1和MCP-1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平及TNF-α的表達(dá)水平未見明顯差異，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖1、表1。

圖1 RAW264.7細(xì)胞MCP-1和ICAM-1 western blot結(jié)果

Figure1ThewesternblotresultsofMCP-1andICAM-1inRAW264.7cells

表1RAW264.7細(xì)胞ICAM-1和MCP-1mRNA和蛋白的表達(dá)水平與TNF-α表達(dá)水平(n=4, ±s)
Table1TheexpressionofICAM-1,MCP-1,TNF-αinRAW264.7cells

組別MCP?1mRNAMCP?1蛋白ICAM?1mRNAICAM?1蛋白TNF?α蛋白Control組1．00013±0041．00009±0051156±128Emodin組124±051017±004117±026010±00327885±2671LPS組2217±352①097±007①2038±287①095±005①12765±1614①LPS+Emodin組537±133①②③041±008①②③687±098①②③028±012①②③9054±896①②③LPS+Emodin+siRNA?PPARγ組1526±218①②081±015①②1624±216①②075±014①②18972±2445①②LPS+Emodin+siRNA?scrambled組561±109①②③039±006①②③644±084①②③026±009①②③8876±1009①②③

注：與Control組比較，①P<0.01；與LPS組比較，②P<0.01；與LPS+Emodi+siRNA-PPARγ組比較，③P<0.01。

2.2 細(xì)胞PPARγ mRNA和蛋白表達(dá)及NF-κB p65活化水平 與Control組相比較，RAW264.7細(xì)胞在LPS干預(yù)后PPARγ mRNA和蛋白的表達(dá)量明顯降低，NF-κB p65磷酸化水平明顯增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。但LPS組較Emodins+LPS組和Emodins+LPS+siRNA-PPARγ組PPARγ mRNA和蛋白的表達(dá)下降更加明顯，NF-κB p65磷酸化水平升高更加顯著，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；且Emodins+LPS+siRNA-PPARγ組較Emodins+LPS組PPARγ mRNA和蛋白表達(dá)的下降及NF-κB p65磷酸化水平的升高更加明顯，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。同時Emodins+LPS組和Emodins+LPS+siRNA-scramble組PPARγ mRNA和蛋白表達(dá)及NF-κB p65磷酸化水平未見明顯差異，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2、圖2。

表2 RAW264.7細(xì)胞PPARγ mRNA及其蛋白表達(dá)和NF-κB p65活化水平Table 2 The mRNA and protein expression of PPARγ, and the activation of NF-κB p65 in RAW264.7 cells

注：與Control組比較，①P<0.01；與LPS組比較，②P<0.01；與LPS+Emodi+siRNA-PPARγ組比較，③P<0.01。

圖2RAW264.7細(xì)胞PPARγ蛋白表達(dá)和NF-κBp65磷酸化的westernblot結(jié)果

Figure2ThewesternblotresultsofPPARγandtheactivationofNF-κBp65inRAW264.7cells

3 討論

目前研究認(rèn)為適度的炎癥反應(yīng)對機(jī)體有保護(hù)作用，但嚴(yán)重的級聯(lián)放大和失控的炎癥反應(yīng)會導(dǎo)致機(jī)體的系統(tǒng)性損傷。目前發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞(macrophage)在急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征(acute lung injury/acute respiratory distress syndrome, ALI/ARDS)和支氣管哮喘等炎癥相關(guān)性疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用[13-15]。細(xì)菌、病毒和真菌等感染導(dǎo)致的炎癥因子(inflammatory mediators)大量釋放間接和/或直接地刺激巨噬細(xì)胞、血液中的單核細(xì)胞以及其他初級免疫細(xì)胞活化，導(dǎo)致更多的炎癥細(xì)胞的過度活化和炎癥介質(zhì)如TNF-α、MCP-1、ICAM-1、IL-1β及IL-6等的過度合成和分泌，從而造成肺泡上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞等的損傷[4, 8, 15-17]。有研究顯示抑制巨噬細(xì)胞活性有利于減輕ARDS及其他炎癥相關(guān)性疾病包括膿毒血癥和動脈粥樣硬化等的組織和系統(tǒng)性損傷[16-20]。Liu Y等的研究表明抑制巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)性一氧化氮合酶(iNOS)的表達(dá)可減輕LPS誘導(dǎo)的ALI相關(guān)的炎癥反應(yīng)[21]；Yu W等人研究證實二苯乙烯苷(Tetrahydroxystilbene Glucoside, TSG)可以通過活化HO-1減輕LPS誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞的活化及炎癥因子的釋放[22]?；舯据x等的實驗發(fā)現(xiàn)橙皮苷可以通過下調(diào)HMGB1表達(dá)抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥分子的合成和釋放[23]。

大黃素(emodin)是大黃的有效成分，目前發(fā)現(xiàn)大黃素具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗纖維化、抗炎、抗動脈粥樣硬化、免疫抑制以及調(diào)節(jié)代謝等多種藥理活性[8-9, 24]。Jia X等發(fā)現(xiàn)在高脂血癥小鼠模型中大黃素對LPS誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷及炎癥反應(yīng)有抑制作用[24]。Xiao M等在小鼠動物模型中發(fā)現(xiàn)大黃素可有效改善LPS誘導(dǎo)的肺組織炎癥反應(yīng)和損傷水平[8]。TNF-α作為最重要的促炎癥分子(pro-inflammatory mediator)在包括ARDS和慢性阻塞性肺疾病(COPD)等在內(nèi)的多種炎癥相關(guān)疾病中發(fā)揮重要的生物學(xué)生物活性，研究表明肺組織中TNF-α可一方面可導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，同時可以誘導(dǎo)更多的炎癥分子的釋放[3-5]。研究發(fā)現(xiàn)MCP-1和ICAM-1作為巨噬細(xì)胞分泌的重要炎癥分子，在LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中亦有重要的價值和意義。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)抑制巨噬細(xì)胞TNF-α、MCP-1和ICAM-1等炎癥介質(zhì)的合成和釋放對ARDS和哮喘等炎癥相關(guān)性疾病有保護(hù)作用[13, 18-19]。在本研究我們發(fā)現(xiàn)大黃素可以有效抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞ICAM-1和MCP-1 mRNA和蛋白的表達(dá)量及TNF-α的表達(dá)水平，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。該結(jié)果提示大黃素對LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)有明顯的抑制作用。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)大黃素的多種生物活性與PPARγ/NF-κB信號通路的活化明確相關(guān)[11, 24, 26]。PPARγ/NF-κB信號通路的過度活化在ARDS、哮喘、COPD及膿毒血癥等炎癥疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中扮演著重要的角色。同時大量研究證實PPARγ/NF-κB信號通路對于TNF-α、MCP-1和ICAM-1等炎癥分子的表達(dá)具有關(guān)鍵的調(diào)控作用[9, 11, 26]。Yang Z等的研究發(fā)現(xiàn)大黃素可以通過抑制PPARγ/NF-κB通路的活化減輕LPS誘導(dǎo)的小鼠乳腺上皮細(xì)胞TNF-α、IL-6、iNOS和COX-2等炎癥分子的合成[9]。在本實驗中我們發(fā)現(xiàn)大黃素可以有效抑制LPS誘導(dǎo)的PPARγ表達(dá)水平下降及NF-κB p65磷酸化水平增高。同時在本研究中我們還發(fā)現(xiàn)大黃素對于PPARγ表達(dá)和NF-κB p65磷酸化水平的調(diào)控作用可被siRNA-PPARγ明顯阻斷。該結(jié)果表明大黃素對于LPS誘導(dǎo)狀態(tài)下的PPARγ/NF-κB信號通路具有調(diào)控作用。

4 結(jié)論

本文資料顯示，大黃素可以通過調(diào)控PPARγ/NF-κB信號通路抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥反應(yīng)，為大黃素應(yīng)用于支氣管哮喘、ARDS和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等炎癥相關(guān)性疾病的臨床治療奠定了理論基礎(chǔ)。

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