林高城　陳云歡　+楊莉惠　魏偉　+鄒愉龍　陳雨

【摘要】 目的：觀察澤瀉湯對巨噬細胞泡沫化脂質(zhì)沉積及IL-1β表達的影響。方法：采用 Ox-LDL（ 50 mg/L）處理大鼠腹腔巨噬細胞24 h，采用20%澤瀉湯血清干預后，油紅O染色觀察細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積情況；酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法測定各組細IL-1β表達情況。結(jié)果：成功建立巨噬細胞泡沫化模型；相比于空白組的巨噬細胞，模型組巨噬細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積增加明顯，實驗組巨噬細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積顯著減少，IL-1β呈低水平表達，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。結(jié)論：Ox-LDL（50 mg/L） 處理巨噬細胞可以成功建立巨噬細胞泡沫化模型。澤瀉湯能改善巨噬細胞泡沫化過程的脂質(zhì)沉積，其作用機制可能是通過下調(diào)IL-1β的表達來實現(xiàn)的。

【關(guān)鍵詞】 澤瀉湯； 泡沫細胞； IL-1β

Effect of Alisma Decoction on Lipid Deposition and Expression of IL-1β on Macrophagic Foam Cell Formation/LIN Gaocheng，CHEN Yunhuan，YANG Lihui，et al.//Medical Innovation of China，2017，14（35）：025-028

【Abstract】 Objective：To observe the effect of Alisma Decoction on lipid deposition and the expression of IL-1βon macrophagic foam cell formation.Method：Macrophagic foam cell formation was established after induction with oxidized low density liprotein（ox-LDL，50 mg/L） for 24 h and then the cells were intervened with 20% Alisma Decoction-containing serum.Oil red O staining to detect the lipid deposition in cells.Enzyme linked immunosorbent assay（ELISA） was used to determine the expression of IL-1β the cells of each group.Result：Ox-LDL（50 mg/L） treated macrophages successfully to establish macrophage foam model.Compared with the control group of macrophages，macrophage lipid deposition in the model group increased.The lipid deposition of macrophages in the experiment group decreased obviously.IL-1β was low expressed in the experiment group and the blank group.The level of IL-1β expression in the experiment group was significantly lower than that of the model group（P<0.01）.Conclusion：Ox-LDL（50 mg/L） treated macrophages successfully established a macrophage foam model.Alisma decoction can improve the lipid deposition in the process of macrophage foaming，this may be achieved by down regulation of IL-1β expression.

【Key words】 Alisma Decoction； Foam cell； IL-1β

First-authors address：Rehabilitation Hospital Affiliated of Fujian University of Traditional Chinese Medicine，F(xiàn)uzhou 350000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.35.007

動脈粥樣硬化（AS）是嚴重危害人類健康的常見病、多發(fā)病，是腦卒中和心肌梗死等疾病發(fā)病的共同基礎。隨著人們生活方式以及飲食習慣的改變，其發(fā)病呈現(xiàn)逐年上升的趨勢。醫(yī)學家張仲景創(chuàng)立澤瀉湯，首載于《金匱要略·痰飲咳嗽病脈證并治》，全方僅由澤瀉和白術(shù)這兩味藥物，據(jù)現(xiàn)代基礎試驗研究表明本方具有改善脂肪代謝、利尿、抗動脈粥樣硬化等作用[1-3]。此次研究通過巨噬細胞泡沫化模型的建立，觀察澤瀉湯對巨噬細胞泡沫化脂質(zhì)沉積的影響，探討其與IL-1β的相關(guān)性，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器和材料 Ox-LDL購自廣州奕源生物公司，胎牛血清購自FAA有限公司，油紅O購自Sigma公司，蘇木素購自北京中杉金橋公司，RPMI1640培養(yǎng)基購自廣州碩恒生物科技有限公司，ELISA檢測試劑盒購自武漢默沙克生物????科技有限公司。SD 大鼠（雄性）40 只，購自福建醫(yī)科大學實驗動物中心（許可證號：SCXK（閩）2012-0001），細胞培養(yǎng)箱（武漢普諾賽生命科技有限公司），倒置顯微鏡（北京瑞億斯科技有限公司）等。endprint

1.2 制備澤瀉湯 據(jù)《金匱要略》原方劑量比例配置澤瀉湯，由澤瀉、白術(shù)組成澤瀉湯，福建省康復醫(yī)院藥劑科提供藥品，以上中藥均符合《中華人民共和國藥典》2005年版有關(guān)規(guī)定。制備相當于生藥材2.64 g/mL的藥液：第一次煎藥添加水量與藥量的比為6∶1，浸泡1 h后再煎20 min；第二次煎藥添加水量與藥量的比為4∶1，煎0.5 h后兩次藥液混合，再濃煎蒸餾，制備完畢后4 ℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 SD大鼠腹腔巨噬細胞提取及細胞培養(yǎng) 先向SD大鼠腹腔內(nèi)注射10 mL RPMI1640培養(yǎng)液，72 h后以頸椎脫臼法處死。然后腹腔內(nèi)注射RPMI1640培養(yǎng)液10 mL，75%酒精浸泡5 min，嚴格無菌操作條件收集腹腔內(nèi)液，1500 r/min離心5 min后收集細胞，用含10%胎牛血清的無酚紅RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細胞數(shù)至5×106 mL/L，將細胞接種到覆有蓋玻片的6孔板和25 cm2培養(yǎng)瓶中，置5% 二氧化碳、37 ℃孵箱培養(yǎng)6 h，經(jīng)顯微鏡觀察細胞貼壁后棄去上清液，PBS沖洗液洗去未貼壁細胞。

1.4 澤瀉湯含藥血清的制備 清潔級雄性SD 大鼠40 只，體重200～210 g。飼養(yǎng)4 d后，清潔級雄性SD大鼠隨機分為空白血清組（注射相同量的生理鹽水）和澤瀉湯含藥血清組，隨機分配各組20只。按大鼠重量100 g給予1 mL灌胃給藥，每天灌藥2次，連續(xù)灌藥7 d，第8天灌藥2 h后腹腔注射麻醉，腹主動脈采血，于4℃ 3000 r/min離心10 min分離血清。全部離心后合并血清，56 ℃滅活30 min，微孔濾膜過濾除菌，于-20 ℃保存待用。制備完畢后的血清均在4周內(nèi)使用。

1.5 細胞干預方法以及分組 模型組：大鼠腹腔巨噬細胞+Ox-LDL （泡沫細胞，50 mg/L），培養(yǎng)48 h后提取細胞備用；空白組：大鼠腹腔巨噬細胞+20%正常大鼠血清，培養(yǎng)48 h后提取細胞備用； 實驗組：在大鼠腹腔巨噬細胞+Ox-LDL （泡沫細胞，50 mg/L）孵育24 h后，加入含有20%澤瀉湯含藥血清的RPMI1640培養(yǎng)基孵育細胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后提取細胞備用，以上每組實驗均重復3次。

1.6 油紅O及蘇木素染色 先取出干預后細胞（6孔板），然后PBS 洗滌細胞標本1次，之后用4%多聚甲醛固定15 min，緊接油紅O染色細胞10 min，蘇木素染色細胞5 min，最后10 mL/L HCl分色及返藍，水性封片劑封片備用。普通顯微鏡下觀察，細胞內(nèi)脂質(zhì)呈紅色，細胞核呈藍色。

1.7 ELISA檢測各組實驗細胞IL-1β的表達 收集各組細胞的上清液，采用雙抗體一步夾心法ELISA法。往預先包被IL-1β抗體的包被微孔中，依次加入標本、標準品、辣根過氧化物酶標記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并徹底洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，最后加終止液硫酸。用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。

1.8 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 含有澤瀉湯血清干預后對巨噬細胞源性泡沫細胞形成率的影響 大鼠腹腔巨噬細胞與Ox-LDL共同培養(yǎng)48 h后，然后用PBS洗滌孵育后的細胞2次，試驗中先后采用油紅O與蘇木素染色，顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)巨噬細胞的胞漿內(nèi)存在大量紅色的脂滴，蘇木素染色后細胞核呈藍色，細胞偽足在模型組明顯增加，以上特征均提示巨噬細胞源性泡沫細胞成功建立，使用20%澤瀉湯含藥血清干預后的細胞內(nèi)紅色脂滴顏色較前明顯變淡，充分提示脂質(zhì)沉積減輕，見圖1。

2.2 澤瀉湯含藥血清對巨噬細胞源性泡沫細胞IL-1β濃度的影響 模型組IL-1β濃度為（12.5±0.48）ng/L，空白組為（7.52±0.52）ng/L，實驗組為（9.61±0.42）ng/L，模型組與空白組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），實驗組與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。

3 討論

隨著人們生活水平的提高及飲食習慣的改變，AS為病理基礎的心腦血管疾病發(fā)生率呈逐年上升趨勢，并成為致死的重要原因。尋找AS的發(fā)病機制，并以此為作用點延緩或逆轉(zhuǎn)AS發(fā)生及發(fā)展，是降低腦中風、心肌梗死等心腦血管疾病的關(guān)鍵因素。AS是一個復雜而漫長的過程，脂質(zhì)氧化和炎性反應在其形成與發(fā)展中起著關(guān)鍵性作用[4-6]，它的發(fā)展起源于內(nèi)皮細胞的功能失調(diào)導致炎癥細胞的激活，使單核細胞粘附并聚集在血管內(nèi)膜下形成巨噬細胞。

巨噬細胞在AS形成中起重要作用，巨噬細胞吞噬脂質(zhì)后分化成為泡沫細胞[7]，這是AS形成過程中重要的病理基礎。Ox-LDL與巨噬細胞匯集后，巨噬細胞膜上有關(guān)蛋白被進一步激活，通過清道夫受體攝取Ox-LDL，巨噬細胞最終形成泡沫細胞，并分泌各種介質(zhì)，如IL-1β和大量基質(zhì)蛋白酶等，促進AS的形成。

東漢時期張仲景在《金匱要略》中首創(chuàng)澤瀉湯，現(xiàn)代實驗研究表明，澤瀉湯具有降脂、利水、抗動脈粥樣硬化等藥理作用，在心腦血管疾病中應用甚廣。劉金元等[8]通過動物實驗發(fā)現(xiàn)澤瀉湯對大鼠血脂代謝及血液流變學指標有調(diào)節(jié)作用，對AS具有逆轉(zhuǎn)作用，其可降低動脈粥樣斑塊內(nèi)脂質(zhì)體。王玉仙等[9]應用澤瀉湯治療脂肪代謝異常，發(fā)現(xiàn)該方可改善脂肪代謝異常所致臨床癥狀，而且能抑制脂類物質(zhì)吸收，明顯降低膽固醇水平；但是其作用機制是否與IL-β有關(guān)，目前尚未見研究報道。

IL-1β通過與配體的結(jié)合介導單核細胞在血管內(nèi)皮表面粘附聚集，在AS過程中發(fā)揮重要作用[10]。Olofsson等[11]采用RT-PCR對人腎動脈IL-1β的mRNA水平進行測定，結(jié)果顯示動脈粥樣斑塊處IL-1β的mRNA水平顯著高于健康人群。Lindholm等[12]以脂蛋白處理后的巨噬細胞作為研究對象，含IL-1β的培養(yǎng)基培養(yǎng)上述細胞，發(fā)現(xiàn)IL-1β可明顯減少上述巨噬細胞中脂質(zhì)代謝，而且增加內(nèi)源性泡沫細胞的形成。目前研究認為IL-1β可通過多種途徑參與AS進程[13-18]，IL-1β可誘導內(nèi)皮細胞表達多種粘附分子及趨化因子，使血管通透性增加以及產(chǎn)生有細胞毒性的脂質(zhì)過氧化物；可刺激血管內(nèi)皮細胞增殖，提高凝血酶原活性，促進中性粒細胞對血管壁的粘附及平滑肌細胞增生，外周血單核細胞遷入內(nèi)皮下間隙被激活并分化為巨噬細胞，進而攝取脂質(zhì)形成泡沫細胞，從而促進AS的發(fā)生和發(fā)展。endprint

在本研究中通過油紅O染色的方法觀察巨噬細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積情況，成功建立巨噬細胞源性泡沫細胞模型，并發(fā)現(xiàn)澤瀉湯含藥血清干預后的細胞內(nèi)紅色脂滴顏色較淡，脂質(zhì)沉積減輕，提示澤瀉湯具有改善脂質(zhì)代謝作用，而改善脂質(zhì)代謝在抗AS過程中起到基石作用。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組泡沫細胞的IL-1β呈高水平表達，加入澤瀉湯含藥血清后能夠明顯降低IL-1β的表達水平， 提示澤瀉湯對泡沫化的巨噬細胞分泌的IL-1β有抑制作用，而IL-1β在AS進程中起到重大推動作用[19-20]。因此筆者推測澤瀉湯可能通過抑制IL-1β表達以改善巨噬細胞泡沫化進程中脂質(zhì)沉積。并進一步抑制AS的發(fā)生與發(fā)展，該試驗研究結(jié)果進一步證明澤瀉湯抗AS的藥理作用，為以后研究澤瀉湯提供了新的思路和理論基礎。

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（收稿日期：2017-08-16） （本文編輯：程旭然）endprint