閆康鵬　江長安　吳昆

【摘要】 目的：探討COX-2促進(jìn)結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移效果及其機(jī)制，從而為結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移防治提供依據(jù)。方法：建立COX-2低表達(dá)和高表達(dá)CT26結(jié)腸癌細(xì)胞株，通過注射0.2 mL的對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞濃度為1×106 個(gè)/mL的正常CT26結(jié)腸癌細(xì)胞懸液（A組，n=20）、COX-2高表達(dá)的CT26結(jié)腸癌細(xì)胞懸液（B組，n=20）以及COX-2低表達(dá)的結(jié)腸癌細(xì)胞懸液（C組，n=20）至脾臟制作小鼠結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型，檢測比較三組小鼠移植瘤COX-2、PI3K、p-Akt表達(dá)、移植瘤體積、肝臟腫瘤大小和數(shù)量以及生存期，并分析結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移小鼠COX-2、PI3K、p-Akt表達(dá)的相互關(guān)系以及三者與其移植瘤體積、肝臟腫瘤大小和數(shù)量以及生存期的關(guān)系。結(jié)果：與A組比較，B組和C組移植瘤COX-2、PI3K、p-Akt蛋白檢測陽性率均升高，移植瘤體積降低，肝臟腫瘤大小和數(shù)量降低，生存期延長（P<0.05）。與B組比較，C組移植瘤COX-2、PI3K、p-Akt蛋白檢測陽性率均升高，移植瘤體積降低，肝臟腫瘤大小和數(shù)量降低，生存期延長（P<0.05）。Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移小鼠移植瘤COX-2蛋白表達(dá)與其PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（P<0.05），且其移植瘤COX-2、PI3K、p-Akt與其移植瘤體積、肝臟腫瘤大小和數(shù)量均呈正相關(guān)（P<0.05），與其生存期均呈負(fù)相關(guān)（P<0.05）。結(jié)論：COX-2可促結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移和影響其預(yù)后，在此過程中可能涉及其活化PI3K/Akt信號(hào)通路作用。

【關(guān)鍵詞】 COX-2； 活化； PI3K； Akt； 信號(hào)通路； 結(jié)直腸癌； 肝轉(zhuǎn)移

Experimental Study on COX-2 Promoting Liver Metastasis of Rectal Cancer by Activating PI3K/Akt Signaling Pathway/YAN Kangpeng，JIANG Changan，WU Kun.//Medical Innovation of China，2017，14（35）：001-005

【Abstract】 Objective：To investigate the effect of COX-2 on the liver metastasis of colorectal cancer and its mechanism，so as to provide the basis for prevention and treatment of liver metastasis of colorectal cancer.Method：COX-2 low expression and high expression CT26 colon cancer cell line were established，and mouse colon cancer liver metastasis model was established by injecting 0.2 mL of 1×106/mL cell concentration logarithmic growth phase normal CT26 colon cancer cell suspension（group A，n=20），COX-2 high expression colorectal cancer cell suspension（group B，n=20） and COX-2 low expression colorectal cancer cell suspension（group C，n=20） into spleen.The expression of COX-2，PI3K，p-Akt，the volume of transplanted tumor，the size and number of liver tumor and the survival time of three groups were analyzed and compared.The relationship between COX-2 expression with PI3K，p-Akt expression，the volume of transplanted tumor，the size and number of liver tumors and the survival time were analyzed.Result：Compared with group A，COX-2，PI3K and p-Akt positive protein expression rate of group B and group C were increased，the volume of transplanted tumor of group B and group C were decreased，the size and number of liver tumor of group B and group C were decreased，and the survival time of group B and group C were prolonged（P<0.05）.Compared with group B，COX-2，PI3K and p-Akt positive protein expression rate of group C were increased，the volume of transplanted tumor of group C were decreased，the size and number of liver tumor of group C were decreased，and the survival time of group C was prolonged（P<0.05）.Spearman correlation analysis showed that COX-2 protein expression was positively correlated with PI3K and p-Akt protein expression in colorectal cancer liver transplanted mice（P<0.05）.The expression of COX-2，PI3K and p-Akt were positively correlated with the tumor volume， the size and number of liver tumors（P<0.05），and negatively correlated with the survival time（P<0.05）.Conclusion：COX-2 can promote the liver metastasis of colorectal cancer and affect its prognosis.In this process，it may be involved in the activation of PI3K/Akt signaling pathway.endprint

【Key words】 COX-2； Activation； PI3K； Akt； Signaling pathway； Colorectal cancer； Liver metastasis

First-authors address：Jiangxi Provincial Cancer Hospital，Nanchang 330029，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.35.001

結(jié)直腸癌為臨床常見惡性腫瘤，?？砂l(fā)生肝臟轉(zhuǎn)移而加重其治療困難程度，影響預(yù)后[1-2]，因此，對(duì)結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移進(jìn)行有效的防治具有重要性和緊迫性。結(jié)直腸癌等癌癥的發(fā)生發(fā)展涉及多個(gè)機(jī)制，其中環(huán)氧酶-2（COX-2）、PI3K-Akt信號(hào)通路等均為癌癥密切相關(guān)基因[3-4]。然而目前關(guān)于COX-2、

PI3K-Akt信號(hào)通路在結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移中的作用及其相互關(guān)系研究甚少。因此，本研究制作了不同COX-2表達(dá)情況的小鼠結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型，檢測比較了其PI3K-Akt信號(hào)通路表達(dá)、病情和預(yù)后等情況，并分析了其相互關(guān)系，旨在為結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的防治提供依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 小鼠結(jié)腸腺癌CT26細(xì)胞株均購自上海麥莎生物有限公司。小鼠為SPF級(jí)的BALB/C小鼠，均為雄性，年齡6～8周，中位年齡48 d，體重15～23 g，中位體重19 g，均購自復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部，獨(dú)立飼養(yǎng)，自由攝食攝水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 主要儀器和試劑 恒溫箱（江蘇佳美儀器有限公司），胰蛋白酶（美國Sigma 公司），玻璃瓶、吸管、試管、注射器等（廣東東普醫(yī)療科技有限公司），RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清（美國Gibco公司），顯微鏡（日本Nikon公司），COX-2 RNA干擾靶序列（蘇州泓迅生物科技股份有限公司），真核表達(dá)載體（上海捷蘭生物技術(shù)有限公司），RNA提取試劑盒（德國Qiagen公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Promega公司），實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒和SYBR Premix EX Taq（日本Takara公司），單克隆鼠抗人COX-2試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），單克隆鼠抗人PI3K試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），單克隆鼠抗人p-Akt試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），COX-2二抗試劑盒（美國Sigma公司），PI3K二抗試劑盒（美國Sigma公司），p-Akt二抗試劑盒（美國Sigma公司）。

1.2.2 建立COX-2低表達(dá)和高表達(dá)CT26結(jié)腸癌細(xì)胞株 建立COX-2低表達(dá)CT26結(jié)腸癌細(xì)胞株：設(shè)計(jì)靶向COX-2基因RNA干擾序列，并利用真核表達(dá)載體構(gòu)建重組質(zhì)粒，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染CT26結(jié)腸癌細(xì)胞篩選陽性克隆，經(jīng)傳代10次以上，RT-PCR檢查確定結(jié)腸癌細(xì)胞株COX-2表達(dá)，建立COX-2低表達(dá)結(jié)腸癌細(xì)胞株（≤COX-2正常表達(dá)的50%）。

建立COX-2高表達(dá)CT26結(jié)腸癌細(xì)胞株：克隆野生型COX-2全長基因，構(gòu)建COX-2真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)導(dǎo)入CT26結(jié)直腸癌細(xì)胞株，篩選陽性克隆，經(jīng)傳代10次以上，RT-PCR檢查確定結(jié)腸癌細(xì)胞株COX-2表達(dá)，建立高表達(dá)結(jié)腸癌細(xì)胞株（≥COX-2正常表達(dá)的200%）。

1.2.3 小鼠結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型的建立 取對(duì)數(shù)生長期COX-2低表達(dá)、正常表達(dá)和高表達(dá)CT26結(jié)腸癌細(xì)胞，添加胰消化酶消化后采用RPMI-1640制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)為1×106個(gè)/mL。小鼠腹部皮膚酒精消毒后通過注射器將0.2 mL的對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL的正常CT26結(jié)腸癌細(xì)胞懸液（A組，n=20）、COX-2高表達(dá)的CT26結(jié)腸癌細(xì)胞懸液（B組，n=20）以及COX-2低表達(dá)的結(jié)腸癌細(xì)胞懸液（C組，n=20）注射至小鼠脾臟上緣，制作小鼠結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型。

1.2.4 相關(guān)指標(biāo)檢測觀察 小鼠結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型制備后每3天進(jìn)行一次小鼠體重檢查、超聲移植瘤體積、肝臟腫瘤大小和數(shù)量檢查等，以末次檢查結(jié)果為最終結(jié)果，并觀察其自然生存期。三組小鼠死亡后均剖腹切取移植瘤進(jìn)行COX-2、PI3K、p-Akt表達(dá)的檢測，將獲得的標(biāo)本常規(guī)制成石蠟包塊，切成4 μm厚連續(xù)石蠟切片，檢測前常規(guī)行二甲苯脫蠟、梯度酒精水化后高壓抗原修復(fù)3次，3%過氧化氫滅活內(nèi)源性生物素和過氧化物酶后添加正常山羊血清封閉孵育，添加即用型COX-2、PI3K、p-Akt單克隆抗體后孵育過夜，添加COX-2、PI3K、p-Akt二抗后室溫孵育，行DAB顯色，顯色滿意后行蘇木精復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片觀察，顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行觀察，以出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽性表達(dá)，統(tǒng)計(jì)各基因陽性表達(dá)情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件包，計(jì)數(shù)資料比較采用 字2檢驗(yàn)，多組計(jì)量資料比較采用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用q檢驗(yàn)，采用Spearman相關(guān)分析法分析結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移小鼠COX-2、PI3K、p-Akt表達(dá)的相互關(guān)系以及三者與其移植瘤體積肝臟腫瘤大小和數(shù)量以及生存期的關(guān)系。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組移植瘤COX-2、PI3K、p-Akt蛋白檢測陽性率比較 與A組比較，B組和C組移植瘤COX-2、PI3K、p-Akt蛋白檢測陽性率均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與B組比較，C組移植瘤COX-2、PI3K、p-Akt蛋白檢測陽性率均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1和圖1～3。

2.2 三組病情和預(yù)后比較 與A組比較，B組和C組移植瘤體積降低，肝臟腫瘤大小和數(shù)量降低，生存期延長，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與B組比較，C組移植瘤體積降低，肝臟腫瘤大小和數(shù)量降低，生存期延長，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2。endprint

2.3 結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移小鼠COX-2、PI3K、p-Akt表達(dá)的相互關(guān)系以及三者與其移植瘤體積、肝臟腫瘤大小和數(shù)量以及生存期的關(guān)系分析 Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移小鼠移植瘤COX-2蛋白表達(dá)與其PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.892、0.883，P<0.05），且其移植瘤COX-2、PI3K、p-Akt與其移植瘤體積、肝臟腫瘤大小和數(shù)量均呈正相關(guān)（COX-2：r=0.879、0.825、0.878，PI3K：r=0.821、0.848、0.828，p-Akt：r=0.808、0.852、0.816，P<0.05），與其生存期均呈負(fù)相關(guān)（r=-0.835、-0.812、-0.827，P<0.05）。

3 討論

近年來隨著生活水平的提高，飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的改變，各類消化系統(tǒng)疾病的發(fā)生亦不斷增加。結(jié)直腸癌是臨床常見消化系統(tǒng)惡性病變，可發(fā)生于結(jié)直腸的任意部位，近年來其發(fā)病不斷增加，已成為嚴(yán)重困擾人類健康和威脅患者生命安全的重要病癥[5-7]。且結(jié)直腸癌可發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，在其遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移中肝轉(zhuǎn)移是最為常見轉(zhuǎn)移臟器，其肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生可進(jìn)一步加重病情和治療困難程度，嚴(yán)重威脅患者健康和生存[8-10]。本研究結(jié)直腸癌小鼠模型均可進(jìn)一步出現(xiàn)肝臟轉(zhuǎn)移，且其肝臟轉(zhuǎn)移瘤書庫較多，體積較大，可影響病情和療效，甚至影響生存期。因此，結(jié)直腸癌肝臟轉(zhuǎn)移發(fā)生率，對(duì)病情和預(yù)后影響大，明確其發(fā)生發(fā)展機(jī)制對(duì)結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的防治均具有重要的指導(dǎo)意義。

結(jié)直腸癌等癌癥的發(fā)生發(fā)展涉及多個(gè)機(jī)制，而其肝轉(zhuǎn)移等遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的發(fā)生確切機(jī)制不明。已有研究證實(shí)，結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生涉及多個(gè)癌癥相關(guān)基因表達(dá)異常[11-12]。在癌癥相關(guān)基因中，COX-2是常見的促癌基因，而選擇性地進(jìn)行COX-2表達(dá)抑制有利于促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[13-14]。因此，COX-2亦可能促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移，導(dǎo)致肝轉(zhuǎn)移等遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的發(fā)生。PI3K-Akt信號(hào)通路在人類大多數(shù)惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中均具有重要作用，可通過促進(jìn)癌癥細(xì)胞的增殖和存活并抑制癌癥細(xì)胞的凋亡而促進(jìn)癌癥發(fā)生發(fā)展[15-16]。亦有多個(gè)研究證實(shí)了PI3K-Akt信號(hào)通路在腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移中具有重要作用[17-18]。因此，PI3K-Akt信號(hào)通路激活可能為結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制，而COX-2則可能協(xié)同或調(diào)控PI3K-Akt信號(hào)通路從而影響結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移，然而目前此方面研究甚少，需進(jìn)一步研究證實(shí)[19-20]。

本研究制作了COX-2低表達(dá)、COX-2正常表達(dá)和COX-2高表達(dá)結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型，并對(duì)其PI3K-Akt信號(hào)通路情況進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，COX-2表達(dá)率較高組的結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移動(dòng)物中PI3K-Akt信號(hào)通路表達(dá)亦越高，提示COX-2表達(dá)可能與PI3K-Akt信號(hào)通路相關(guān)。而進(jìn)一步的Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移小鼠移植瘤COX-2蛋白表達(dá)與其PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，且其移植瘤COX-2、PI3K、p-Akt與其移植瘤體積、肝臟腫瘤大小和數(shù)量均呈正相關(guān)，與其生存期均呈負(fù)相關(guān)。結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移中COX-2、PI3K-Akt信號(hào)通路均具有促進(jìn)作用，而PI3K-Akt信號(hào)通路的激活情況與COX-2表達(dá)情況一致，由此可推論COX-2可能通過PI3K-Akt信號(hào)通路的激活而促進(jìn)結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生發(fā)展，而抑制COX-2和PI3K-Akt信號(hào)通路表達(dá)可能為結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移防治的重要途徑，此方面尚需更深入研究證實(shí)。

綜上所述，COX-2可能通過PI3K/Akt信號(hào)通路激活促進(jìn)結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移和影響預(yù)后，COX-2和PI3K-Akt信號(hào)通路均可能為結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移防治的重要靶點(diǎn)。

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（收稿日期：2017-09-15） （本文編輯：程旭然）endprint