靳松 黃愛(ài)軍 林昆 彭建強(qiáng) 李亞杰 鄒學(xué)農(nóng)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)是一類來(lái)源于骨髓的具有多向分化潛能的干細(xì)胞，具有自我更新、組織再生和抗炎修復(fù)等功能。研究表明，MSC經(jīng)誘導(dǎo)分化后性別決定區(qū)Y框蛋白9(Sox9)、Ⅱ型膠原及缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)的表達(dá)水平上調(diào)，提示其具有轉(zhuǎn)化為類髓核細(xì)胞的潛能[1]。MSC移植修復(fù)椎間盤(pán)退變疾病的重要機(jī)制是，在椎間盤(pán)微環(huán)境中MSC向類髓核細(xì)胞分化并增加基質(zhì)大分子的合成。MSC來(lái)源廣泛、體外培養(yǎng)可誘導(dǎo)類髓核細(xì)胞分化，是一種非常有前景的可應(yīng)用于臨床治療椎間盤(pán)退變疾病的種子細(xì)胞。微小RNA(miR)是一類含有18～24個(gè)核苷酸的非編碼RNA，通過(guò)與靶基因mRNA 3’端非翻譯區(qū)(3’UTR)的互補(bǔ)序列以堿基配對(duì)方式執(zhí)行降解靶基因或抑制其翻譯的功能，參與調(diào)控MSC分化過(guò)程中的多種生物學(xué)過(guò)程[2-4]。本研究通過(guò)在線軟件預(yù)測(cè)miR-124的靶基因，發(fā)現(xiàn)活化T細(xì)胞核因子c1(NFATc1)是其中一個(gè)潛在靶點(diǎn)。NFAT家族是一類具有廣泛生理功能的轉(zhuǎn)錄因子，在成軟骨分化過(guò)程中，NFATc1能促進(jìn)軟骨基因表達(dá)[5]。NFATc1廣泛參與MSC生長(zhǎng)、分化的生物學(xué)過(guò)程，特別是在成軟骨過(guò)程中有基因調(diào)控的功能[6]。由此推測(cè)，miR-124可能通過(guò)靶向調(diào)控NFATc1表達(dá)促進(jìn)人MSC向軟骨細(xì)胞分化。本研究采用成軟骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)體系誘導(dǎo)C3H10T1/2細(xì)胞向成軟骨細(xì)胞分化，并探究miR-124在此過(guò)程是否通過(guò)調(diào)控NFATc1靶基因發(fā)揮生物學(xué)作用。

材料與方法

一、主要材料

間充質(zhì)干細(xì)胞株C3H10T1/2細(xì)胞系(中山大學(xué)骨科研究所提供)；高糖型DMEM培養(yǎng)基、10%胎牛血清購(gòu)自美國(guó)HyClone公司；谷氨酰胺購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胰酶、0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)、抗壞血酸、青霉素鏈霉素雙抗、β-甘油磷酸鈉、地塞米松購(gòu)自美國(guó)Sigma公司； pmiR-RB-REPORTTM質(zhì)粒載體、ribo FECTTMCP轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒及Trizol購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司。Spe I、Hind Ⅲ、T4 DNA連接酶和SYBR Premix ExTaqTM定量PCR試劑均為大連寶生物公司產(chǎn)品。實(shí)時(shí)定量PCR miR檢測(cè)試劑盒購(gòu)自廣州天根生物公司。miR-124模擬物(mimics)及抑制物(inhibitors)為美國(guó)Ambion公司產(chǎn)品。定點(diǎn)突變?cè)噭┖匈?gòu)自美國(guó)Stratagene公司。雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司。Smad4抗體和GAPDH抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司。NFATc1小干擾RNA(siRNA)由美國(guó)Invitorgen公司合成，引物合成及測(cè)序由深圳達(dá)生生物科技公司完成。

二、方 法

1.細(xì)胞培養(yǎng)與軟骨誘導(dǎo)分化

以離心法進(jìn)行軟骨微團(tuán)的構(gòu)建，具體操作步驟參照文獻(xiàn)[7]進(jìn)行。小鼠C3H10T1/2細(xì)胞株經(jīng)復(fù)蘇后室溫離心收集沉淀，用含10%胎牛血清的高糖型DMEM培養(yǎng)液混懸于37℃、5%CO2靜置培養(yǎng)，待細(xì)胞融合至80%～90%，在胰酶消化下進(jìn)行傳代，每3 d更換培養(yǎng)液1次。將培養(yǎng)的C3H10T1/2細(xì)胞分為對(duì)照組與成軟骨誘導(dǎo)組，分別加入含2%胎牛血清的DMEM和軟骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)培養(yǎng)。每3 d換液1 次，于第0、7、10、14日收集細(xì)胞微球進(jìn)行基因表達(dá)檢測(cè)。

2.雙熒光素酶報(bào)告基因構(gòu)建及檢測(cè)

使用在線靶基因預(yù)測(cè)軟件(PicTar、TargetScan、miRanda、miRDB)，預(yù)測(cè)NFATc1 mRNA的3’UTR上173～185 nt為miR-124的結(jié)合位點(diǎn)(GCACTTT)。人工合成NFATc1 mRNA 3’UTR 區(qū)的靶點(diǎn)野生型序列(Wt)以及定點(diǎn)突變的突變序列(Mut, GCACTTT→CGTGAAA)； XhoⅠ及NotⅠ雙酶切pmiR-RB-REPORTTM 質(zhì)粒，再將Wt和Mut基因片段分別克隆到酶切后的pmiR-RBREPORTTM載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pNFATc1-Wt或pNFATc1-Mut；基因測(cè)序確認(rèn)重組質(zhì)粒載體構(gòu)建成功。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)突變NFATc1 3’UTR上miR-124結(jié)合位點(diǎn)，構(gòu)建突變型pGL3-Mut-NFATc1真核表達(dá)載體。

取培養(yǎng)的C3H10T1/2細(xì)胞，根據(jù)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的不同分為4組：①pNFATc1-Wt質(zhì)粒對(duì)照組，為轉(zhuǎn)染pNFATc1-Wt質(zhì)粒及miR-124 mimics對(duì)照；②pNFATc1-Wt質(zhì)粒實(shí)驗(yàn)組，為轉(zhuǎn)染pNFATc1-Wt質(zhì)粒和miR-124 inhibitors；③pNFATc1-Mut質(zhì)粒對(duì)照組，為轉(zhuǎn)染pNFATc1-Mut質(zhì)粒與miR-124 mimics對(duì)照；④pNFATc1-Mut質(zhì)粒實(shí)驗(yàn)組，為轉(zhuǎn)染pNFATc1-Mut質(zhì)粒與miR-124 inhibitors。各組轉(zhuǎn)染24 h后收集細(xì)胞，用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)各組細(xì)胞的熒光素酶活性。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。另外，將NFATc1的3’UTR用XhoI/NotI點(diǎn)雙酶切，插入到psiCHECKTM-2質(zhì)粒中復(fù)制，與此相關(guān)的NFATc1 3’UTR片段被融合到熒光素酶中，并被轉(zhuǎn)移到C3H10T1/2細(xì)胞，根據(jù)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒分為不轉(zhuǎn)染對(duì)照組(空白對(duì)照組)、miR-124 mimics組、miR-124 inhibitors組、pNFATc1-Wt質(zhì)?；騪NFATc1-Mut組(正常對(duì)照組)、pNFATc1-Wt質(zhì)?；騪NFATc1-Mut質(zhì)粒加miR-124 inhibitors組(正常對(duì)照inhibitors組)，分析miR-124對(duì)NFATc1熒光素酶活性的影響。

3.實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)

在成軟骨誘導(dǎo)分化第0、7、10、14日收集C3H10T1/2細(xì)胞微球，按RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA，并檢測(cè)總RNA的含量及純度，再按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，合成模板DNA第一鏈，實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增目的基因，引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)條件為95℃10 min，95℃15 s，60℃ 30 s，72℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)，內(nèi)參為18 s。一步加A法逆轉(zhuǎn)錄miR，反應(yīng)條件為95℃ 30 s，95℃ 3 s，60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)，內(nèi)參為U6。上下游引物序列分別為5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’和5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’，使用2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。記錄軟骨分化的相關(guān)標(biāo)志基因Aggrecan、Ⅱ型膠原蛋白(Col2a1)和Ⅹ型膠原蛋白(Col10a1)及Sox9 mRNA表達(dá)水平。另外，取成軟骨誘導(dǎo)7 d的C3H10T1/2細(xì)胞轉(zhuǎn)染pNFATc1-Wt質(zhì)粒(Control組)、pNFATc1-Wt質(zhì)粒及miR-124 mimics(miR-124組)、經(jīng)siRNA干預(yù)的pNFATc1-Wt質(zhì)粒(si-NFATc1組)，按前述方法檢測(cè)NFATc1 mRNA表達(dá)水平。此外，取成軟骨誘導(dǎo)7 d的C3H10T1/2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染miR-124 mimics和(或)pNFATc1-Wt質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染成功后分別加入miR-124 mimics 0、50、100 nmol/L miR-124 mimics或inhibitors培養(yǎng)24 h，用前述同樣方法分析各組NFATc1和miR-124 mRNA表達(dá)水平。

4.蛋白免疫印跡法檢測(cè)

提取各組細(xì)胞的總蛋白，測(cè)定蛋白濃度，加4倍SDS上樣緩沖液8 μl和二硫蘇糖醇2 μl混勻沸水浴5 min后作十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺SDS-PAGE凝膠電泳電泳，用電轉(zhuǎn)印儀(100 V電壓)電泳將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)印至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。將蛋白Marker剪下，避光保存，余下膜用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，TBST緩沖液洗滌3次后，一抗4℃孵育過(guò)夜，TBST緩沖液再次洗滌3次，加入二抗室溫孵育2 h，同前洗滌。按體積比1∶1混合ECL試劑盒中A液和B液，混合液鋪在膜表面，凝膠成像系統(tǒng)曝光，Quantity one軟件分析結(jié)果。

表1 PCR引物序列

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、C3H10T1/2軟骨分化相關(guān)基因及蛋白表達(dá)的變化

成軟骨誘導(dǎo)組中，在成軟骨誘導(dǎo)分化第7、10、14日的軟骨分化相關(guān)基因Aggrecan mRNA表達(dá)水平均逐漸升高(與誘導(dǎo)前比較，t分別為30.274、

46.132、160.752，P均<0.001)；Col2a1 mRNA相對(duì)表達(dá)量在第7、10日升高(與誘導(dǎo)前比較，t分別為10.246、67.202、45.311，P均<0.001)，第14日稍下降(與誘導(dǎo)前比較，t=53.244、P<0.001；與第10日比較，t=2.376、P>0.05)；Col10a1第7、10日增加緩慢(與誘導(dǎo)前比較，P均>0.05)，但第14日大幅上調(diào)(與誘導(dǎo)前比較，t=330.784，P<0.001)。軟骨分化后, 軟骨化基因表達(dá)逐漸穩(wěn)步增加，但并未達(dá)到峰值；Sox 9和NFATc1 mRNA表達(dá)水平隨著軟骨分化進(jìn)展而增加(與對(duì)照組0 d及10 d時(shí)比較，t分別為65.266、80.232，P均<0.001)，見(jiàn)圖1A～D。蛋白免疫印跡法顯示，成軟骨誘導(dǎo)組Col2a1、Sox 9和NFATc1蛋白呈逐漸增強(qiáng)表達(dá)，表明軟骨發(fā)生的進(jìn)展，而肥厚性標(biāo)記Col10a1蛋白顯示較穩(wěn)定表達(dá)(圖1E)。

二、miR-124對(duì)NFATc1的靶向性檢測(cè)

通過(guò)Targetscan和miRanda等在線軟件分析，發(fā)現(xiàn)NFATc1是miR-124的潛在靶基因之一， NFATc1 mRNA的3’UTR與miR-124的種子區(qū)存在理論上的互補(bǔ)堿基配對(duì)序列(圖2A)。轉(zhuǎn)染NFATc1 Wt質(zhì)粒的對(duì)照組熒光素酶活性低于實(shí)驗(yàn)組(t=3.837，P<0.05)；轉(zhuǎn)染NFATc1 Mut質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間熒光素酶活性比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；轉(zhuǎn)染NFATc1 Wt質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)組NFATc1蛋白表達(dá)水平高于對(duì)照組(圖2B)，表明miR-124直接作用于NFATc1。

圖1 C3H10T1/2誘導(dǎo)成軟骨分化的相關(guān)基因表達(dá)水平變化

miR-124組與si-NFATc1組的NFATc1 mRNA表達(dá)水平均低于Control組(LSD-t分別為5.642、4.338，P均<0.01)，miR-124組與si-NFATc1組的NFATc1 mRNA表達(dá)水平接近(P>0.05)；蛋白免疫印跡檢測(cè)結(jié)果與實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果基本一致(圖2C)，表明miR-124能在C3H10T1/2軟骨分化的過(guò)程中靶向調(diào)控NFATc1表達(dá)。

圖2 miR-124 通過(guò)靶向NFATc1促進(jìn)C3H10T1/2細(xì)胞軟骨分化

A：互補(bǔ)堿基配對(duì)序列；B：NFATc1 熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果和NFATc1蛋白表達(dá)；C：miR-124抑制NFAc1 mRNA和蛋白表達(dá)；與共轉(zhuǎn)染NFATc1 Wt質(zhì)粒的對(duì)照組熒光素酶活性比較，*P<0.01；與Control組比較，#P<0.01

三、抑制或過(guò)表達(dá)miR-124時(shí)C3H10T1/2的NFATc1表達(dá)水平變化

與未加入miR124 mimics相比，100 nmol/L的miR-124 mimics加入C3H10T1/2細(xì)胞后，miR-124 mRNA表達(dá)水平約增加60倍，而NFATc1 mRNA表達(dá)水平約降低60%(圖3A)。當(dāng)100 nmol/L miR-124 inhibitors加入C3H10T1/2細(xì)胞時(shí)，與未加入時(shí)相比，miR-124 mRNA表達(dá)水平減少了大約60%，而NFATc1增加了大約1倍(圖3B)。轉(zhuǎn)染NFATc1-Wt質(zhì)粒的miR-124 mimics組NFATc1熒光素酶活性低于其他4組(F=8.256，LSD-t分別為5.436、7.442、3.433、6.282，P均<0.05)，轉(zhuǎn)染NFATc1-Mut質(zhì)粒的miR-124 mimics組NFATc1熒光素酶活性與其他4組相近(P均>0.05)，表明miR-124可作為NFATc1的抑制劑(圖3C)。

討 論

C3H10T1/2細(xì)胞系是一種小鼠胚胎源性間充質(zhì)干細(xì)胞，具有多向分化潛能，轉(zhuǎn)染效率高且穩(wěn)定，易獲得大量轉(zhuǎn)染成功的活細(xì)胞，現(xiàn)已廣泛用于研究MSC分化潛能的實(shí)驗(yàn)中[8]。miR作為一類重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子，在MSC的分化過(guò)程中參與調(diào)控細(xì)胞的多種生物學(xué)過(guò)程[9-10]。已有研究發(fā)現(xiàn)，miR在調(diào)控MSC或前體細(xì)胞成軟骨、成骨及成脂的分化過(guò)程中發(fā)揮重要生物學(xué)功能[11]。miR-124能抑制MSC向軟骨分化[12]。上述研究證實(shí)，miR可通過(guò)抑制靶基因的表達(dá)參與MSC分化的調(diào)控。然而其中的分子機(jī)制和調(diào)控的靶基因尚不清楚。本課題組前期實(shí)驗(yàn)首先誘導(dǎo)的C3H10T1/2細(xì)胞向軟骨的定向分化，在此過(guò)程中發(fā)現(xiàn)miR-124表達(dá)逐漸下調(diào)，提示其在MSC軟骨分化中可能具有重要的調(diào)控作用；然后通過(guò)生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)出miR-124潛在的其中一個(gè)靶基因NFATc1。本研究亦顯示，軟骨分化后NFATc1和軟骨化相關(guān)基因及蛋白表達(dá)逐漸穩(wěn)步增加。

圖3 干擾NFATc1或過(guò)表達(dá)miR-124時(shí)C3H10T1/2的NFATc1表達(dá)水平變化

與其他4組比較，*P<0.05

本研究將NFATc1 3’-UTR克隆入熒光素酶報(bào)告載體并且與miR-124共轉(zhuǎn)染C3H10T1/2細(xì)胞，結(jié)果顯示miR-124抑制NFATc1 mRNA的3’UTR熒光素酶活性，發(fā)現(xiàn)其特異性與NFATc1 mRNA的3’UTR相結(jié)合。然而在生理狀態(tài)下，靶基因3’UTR序列中的miR結(jié)合位點(diǎn)有可能由于mRNA的構(gòu)象而被掩蓋，導(dǎo)致該miR無(wú)法發(fā)揮抑制靶基因表達(dá)的功能。因此進(jìn)一步檢測(cè)該miR與NFATc1 3’UTR的結(jié)合能力及其對(duì)NFAc1表達(dá)的抑制作用，結(jié)果表明miR-124能抑制軟骨分化過(guò)程中的NFATc1 mRNA及蛋白表達(dá)，并且其強(qiáng)度與NFATc1 siRNA干擾NFATc1內(nèi)源性表達(dá)一致，證明了miR-124直接靶向調(diào)控NFATc1表達(dá)。通過(guò)功能研究siRNA干擾NFATc1表達(dá)能抑制MSC的成軟骨化，它能部分模擬miR-124調(diào)控MSC軟骨分化的功能。另外，蛋白免疫印跡檢測(cè)結(jié)果也顯示轉(zhuǎn)染miR-124 mimics后，NFATc1的蛋白相對(duì)表達(dá)量比對(duì)照組明顯下調(diào)；相反，轉(zhuǎn)染miR-124 inhibitor后NFATc1的蛋白相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組比較則上調(diào)，表明在C3H10T1/2細(xì)胞成骨分化過(guò)程中miR-124通過(guò)調(diào)控靶基因NFATc1介導(dǎo)MSC向軟骨方向分化。

綜上所述，本研究運(yùn)用生物信息學(xué)方法對(duì)miR-124和NFATc1基因的靶向配對(duì)關(guān)系進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)兩者靶向配對(duì)良好，采用熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)、實(shí)時(shí)定量PCR及蛋白免疫印跡法發(fā)現(xiàn)miR-124可靶向抑制NFATc1的表達(dá)而負(fù)向調(diào)控C3H10T1/2細(xì)胞成軟骨分化。鑒于NFATc1是鈣形成信號(hào)通路中的重要轉(zhuǎn)導(dǎo)因子之一，因此miR-124調(diào)控成軟骨分化的作用機(jī)制可能是通過(guò)抑制NFATc1的表達(dá)，因此阻礙其下游信號(hào)通路的激活，進(jìn)而抑制MSC的成軟骨分化。

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