鄧鵬輝 黃傳君 趙方正 宮曉丹 李春曉 張才擎

支氣管哮喘(哮喘)是以反復(fù)發(fā)作的呼氣性呼吸困難和可逆性氣流受限為特點(diǎn)的慢性炎癥性疾病，其病理特征為氣道慢性炎癥、氣道高反應(yīng)和氣道重塑。有報(bào)道，氣道重塑在哮喘早期就已出現(xiàn)并呈現(xiàn)進(jìn)行性發(fā)展，致使患者肺功能降低，嚴(yán)重影響患者日常生活，同時(shí)氣道重塑降低了哮喘患者對(duì)腎上腺皮質(zhì)激素(激素)的敏感性，這也是哮喘遷延難愈的原因之一[1]。目前能夠?qū)购途徑庀瓪獾乐厮艿乃幬镙^少。迄今為止，多項(xiàng)研究表明轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)參與哮喘早期氣道重塑過(guò)程，同時(shí)兩者也參與炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)并且相互促進(jìn)，更進(jìn)一步地刺激氣道重塑的形成[2-3]。細(xì)辛腦是從傳統(tǒng)中藥石菖蒲中提取的有效成分，目前在臨床的哮喘治療方面應(yīng)用比較廣泛[4]。細(xì)辛腦具有緩解患者臨床癥狀，改善肺部通氣功能，促進(jìn)痰液排出，減輕氣道黏膜充血水腫并保護(hù)氣道黏膜等作用，但是其具體作用途徑的探索國(guó)內(nèi)外均少有涉及。所以，本研究目的在于通過(guò)制備哮喘模型小鼠，并給予細(xì)辛腦干預(yù)以探討細(xì)辛腦是否能夠影響TGF-β1和VEGF的水平而起到治療哮喘作用，為臨床用藥提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

BALB/C雌性小鼠30只，6～8周齡，體質(zhì)量15～20 g，購(gòu)于山東大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，于室溫20～22℃條件下飼養(yǎng)，自由進(jìn)食及飲水。

二、主要試劑

細(xì)辛腦霧化液由遼寧玉皇藥業(yè)有限公司提供，規(guī)格為10 ml∶24 mg、雞清卵蛋白(OVA)，購(gòu)于美國(guó)Sigma公司； 980超聲霧化儀由上海新天緣醫(yī)療設(shè)備有限公司提供；TGF-β1、VEGF ELISA試劑盒均購(gòu)自上海心語(yǔ)生物科技有限公司；TGF-β1抗體、VEGF抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

三、方 法

1.動(dòng)物分組及哮喘模型的制備

將上述30只小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為3組：哮喘組、細(xì)辛腦組和對(duì)照組，每組各10只小鼠。哮喘組和細(xì)辛腦組每只小鼠分別在第1、8日腹腔注射OVA致敏混懸液(0.1 mg OVA加1 mg氫氧化鋁溶于2 ml生理鹽水)0.5 ml，對(duì)照組每只小鼠給予注射含有氫氧化鋁凝膠的生理鹽水0.5 ml。第15日起，將哮喘組和細(xì)辛腦組的小鼠置于自制箱中(30 cm×25 cm×30 cm)霧化吸入2 ml 25%OVA溶液，每日1次，連續(xù)1周，對(duì)照組給予等量(2 ml)生理鹽水代替。細(xì)辛腦組分別在霧化OVA溶液2 h前霧化吸入50%細(xì)辛腦霧化液10 ml[5]，霧化40 min。對(duì)照組在此同時(shí)給予等量生理鹽水霧化吸入[6]。

2.標(biāo)本的采集

第21日最后1次完成致敏后，用10%水合氯醛麻醉小鼠后，將小鼠固定在解剖臺(tái)上，解剖胸頸部組織，暴露氣管并連接留置針，緩慢地將生理鹽水注入兩肺，回收灌洗液，置于冰上保存，隨后以4 ℃、1 500 轉(zhuǎn)/分離心5 min，收集上清液。取出支氣管和肺組織，置于4%多聚甲醛中固定，用于制片后蘇木素-伊紅(HE)染色和圖像采集。

3.細(xì)胞計(jì)數(shù)

肺泡灌洗液(BALF)離心后，取上清液并存于-80℃冰箱，ELISA檢測(cè)備用；將沉淀物制作涂片染色，在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和分類，排除上皮細(xì)胞及紅細(xì)胞，記錄細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞(EOS)、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞分類情況。

4.肺臟組織HE染色和圖像的采集

取各組小鼠4%多聚甲醛固定的肺組織，常規(guī)脫水、包埋及石蠟切片，經(jīng)染色、脫水、中性樹膠封片，然后于顯微鏡下觀察各組小鼠氣道管壁損傷程度、炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)情況和基底膜厚度。

5.肺泡灌洗液中TGF-β1和VEGF的測(cè)定

使用ELISA測(cè)定肺泡灌洗液中TGF-β1和VEGF的含量，嚴(yán)格按各試劑盒說(shuō)明書操作，測(cè)出各個(gè)樣本指標(biāo)的OD值，再根據(jù)所測(cè)的OD值換算各自水平。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、 制模結(jié)果

激發(fā)致敏后，哮喘組小鼠毛發(fā)干枯無(wú)澤，煩躁不安，有氣促、憋喘癥狀，飲食差，體質(zhì)量下降；細(xì)辛腦組小鼠生命體征平穩(wěn)，毛發(fā)欠光澤，活動(dòng)輕度受限，未見明顯氣促、憋喘癥狀，飲食一般，體質(zhì)量無(wú)明顯變化；對(duì)照組上述指標(biāo)無(wú)明顯變化。

二、 3組小鼠的肺組織病理檢查結(jié)果

對(duì)照組小鼠支氣管黏膜下及管腔周圍無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，管腔規(guī)則完整，肺泡結(jié)構(gòu)完整清晰，基底膜無(wú)增厚、斷裂情況，無(wú)新生血管形成。哮喘組小鼠支氣管管腔狹窄，管壁增厚，黏膜充血、水腫，伴有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，基底膜增厚不規(guī)則，有新生血管形成。細(xì)辛腦組小鼠也有前述哮喘組的病理特點(diǎn)，但程度輕于較哮喘組，見圖1。

圖1 3組小鼠的肺組織病理檢查結(jié)果(HE染色，×200)

A：哮喘組；B：細(xì)辛腦組；C：對(duì)照組

三、3組小鼠BALF中TGF-β1和VEGF水平比較

哮喘組小鼠BALF中TGF-β1和VEGF水平均高于對(duì)照組(P均<0.01)，細(xì)辛腦組小鼠BALF中TGF-β1和VEGF水平均低于哮喘組(P均<0.01)，見表1。

表1 3組小鼠BALF中TGF-β1和VEGF水平比較 ng/L

注：與對(duì)照組比較，aP<0.01；與哮喘組比較，bP<0.01

四、3組小鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)及分類情況比較

哮喘組的細(xì)胞總數(shù)及各類細(xì)胞計(jì)數(shù)均多于細(xì)辛腦組和對(duì)照組(P均<0.01)，細(xì)辛腦組的中性粒細(xì)胞、EOS計(jì)數(shù)均多于對(duì)照組(P均<0.01)，見表2。

討 論

哮喘是一種可逆性氣流受限的慢性炎癥性疾病，由多種炎癥細(xì)胞及細(xì)胞組分參與并分泌異常炎性因子。在哮喘發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，其病理特征除了表現(xiàn)為氣道慢性炎癥、氣道高反應(yīng)之外，同時(shí)伴隨有氣道管壁結(jié)構(gòu)的變化，即氣道重塑。氣道重塑是哮喘病理發(fā)展的典型特征之一[7]。哮喘的反復(fù)發(fā)作以及伴隨的反復(fù)慢性炎癥刺激，逐步使氣道管壁發(fā)生病理學(xué)改變，如上皮細(xì)胞增生、膠原沉積、基底膜增厚、氣道平滑肌細(xì)胞以及血管增生等氣道重塑性改變[8]。既往研究認(rèn)為，細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)因子失衡是哮喘發(fā)生的重要節(jié)點(diǎn)[9-11]。有研究顯示，TGF-β1及VEGF在氣道重塑方面占據(jù)重要地位，對(duì)炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)也有相應(yīng)的影響[2-3]。本研究也得到類似的結(jié)論。

表2 3組小鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)及分類情況 ×104/L

注：與對(duì)照組比較，aP<0.01；與哮喘組比較，bP<0.01

TGF-β1是輔助性T細(xì)胞2型(Th2)細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，具有很強(qiáng)的致纖維化、抗炎及促炎的三重作用，還可調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化，其在肝、肺、腎等臟器的纖維化病理過(guò)程中扮演著重要角色[12]。在哮喘發(fā)病過(guò)程中，TGF-β1可一定程度地抑制炎性細(xì)胞的活化及氣道高反應(yīng)，但是隨著其水平的升高，可引起管壁的纖維化，刺激平滑肌細(xì)胞分裂和增殖，氣道平滑肌增生肥厚，最終導(dǎo)致氣道炎癥反應(yīng)加重和氣道重塑[13]。另外，TGF-β1使Th2型細(xì)胞壽命延長(zhǎng)，刺激VEGF等相關(guān)炎癥因子釋放過(guò)多，進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng)，進(jìn)而促進(jìn)氣道重塑的發(fā)生[14]。VEGF又稱血管滲透因子，能夠刺激血管增生，增加肺部血管的通透性，致使血漿蛋白滲出，進(jìn)一步導(dǎo)致基底膜變厚和上皮下組織纖維化,并且促進(jìn)氣道平滑肌增殖肥大，加重氣道重塑[15-16]。此外，VEGF對(duì)哮喘的炎癥反應(yīng)亦有影響。Feistritzer等(2004年)研究發(fā)現(xiàn)，VEGF能夠刺激EOS的活化、趨化而增加氣道炎癥反應(yīng)，VEGF亦可自身分泌VEGF而加重炎癥反應(yīng)。Lopoz-Guisa 等[17]研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β和VEGF 在哮喘兒童氣道上皮細(xì)胞中增高明顯，體外實(shí)驗(yàn)中TGF-β可誘導(dǎo)VEGF mRNA表達(dá)，而又有文獻(xiàn)報(bào)道VEGF能夠活化Th2型細(xì)胞，介導(dǎo)其釋放TGF-β1，從而使哮喘病情進(jìn)一步加重[3]?？梢奣GF-β1、VEGF兩者在功能上相互促進(jìn)，使炎癥反應(yīng)和氣道重塑不斷地強(qiáng)化，這可能是哮喘反復(fù)發(fā)作、持久不愈的原因。 細(xì)辛腦是中藥石菖蒲中提煉出來(lái)的有效成分之一，在臨床上用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療，也多與其他藥物聯(lián)合運(yùn)用治療哮喘，但其作用機(jī)制還不清楚。TGF-β1、VEGF在哮喘發(fā)病和氣道重塑中起著重要作用，因此，我們推測(cè)細(xì)辛腦可能通過(guò)干預(yù)兩者的表達(dá)而影響哮喘的氣道重塑，達(dá)到臨床治療的目的。

多數(shù)學(xué)者的研究已表明，TGF-β1 和VEGF參與了哮喘氣道重塑。本研究中，哮喘組小鼠肺泡灌洗液TGF-β1和VEGF的水平均高于對(duì)照組，這與Lopoz-Guisa等[17]研究結(jié)果類似，同時(shí)HE 染色顯示哮喘組小鼠有明顯的氣道結(jié)構(gòu)改變，細(xì)辛腦組氣道結(jié)構(gòu)的變化較對(duì)照組有明顯好轉(zhuǎn)，TGF-β1和VEGF水平均低于哮喘組，表明細(xì)辛腦干預(yù)可下調(diào)TGF-β1、VEGF水平和抑制炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，進(jìn)而可能在一定程度上抑制了氣道重塑，緩解了哮喘病情進(jìn)展，為臨床用藥和其治療作用機(jī)制的研究提供了理論依據(jù)。

綜上所述，細(xì)辛腦干預(yù)能夠降低哮喘小鼠TGF-β1和VEGF的表達(dá)，并可能通過(guò)降低兩者的表達(dá)間接影響哮喘的氣道重塑，從而達(dá)到治療哮喘的效果。但是鑒于研究條件的局限性，本研究還存在很多不足之處，如TGF-β1、VEGF的表達(dá)對(duì)氣道重塑情況的影響以及細(xì)辛腦干預(yù)后氣道重塑的具體病理改變?cè)诒狙芯可形瓷婕昂吞剿鳎芯拷Y(jié)果尚待進(jìn)一步的研究和驗(yàn)證。

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