羅千江 李林 魏振宇 劉慧玲 江潔 尉秀清

敗血癥是臨床上較為常見的危重疾病，病死率可高達50%以上，其原因主要是與先天免疫系統(tǒng)中的巨噬細胞以及內(nèi)皮細胞所產(chǎn)生大量的細胞因子如TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8等相關(guān)[1-2]。其中內(nèi)毒素血癥是由于血中細菌或病灶內(nèi)細菌死亡溶解或用人工方法破壞菌細胞后釋放出大量內(nèi)毒素至血液，或輸入大量內(nèi)毒素污染的液體而引起的一種病理生理表現(xiàn)。內(nèi)毒素本質(zhì)是革蘭陰性菌細胞壁上的脂多糖，是誘發(fā)機體內(nèi)炎癥反應的主要致病因子。肝臟既是清除內(nèi)毒素的場所，也是內(nèi)毒素血癥易受損的靶器官之一。內(nèi)毒素誘導的肝臟損傷是多種肝病的主要病理生理基礎[3-4]。目前很多研究發(fā)現(xiàn)，肝臟枯否細胞內(nèi)激活多種信號通路，產(chǎn)生大量的細胞因子誘發(fā)的炎癥反應是內(nèi)毒素誘導的肝臟損傷的關(guān)鍵機制[5]。

短鏈脂肪酸(SCFA)是指由腸道菌群通過發(fā)酵食物中未被小腸吸收消化的膳食纖維而產(chǎn)生的碳鏈為1-6的有機脂肪酸，主要包括乙酸、丙酸、丁酸等[6]。大量研究表明，通過調(diào)節(jié)炎癥因子的生成，SCFA可以干預炎癥反應，它們還可以參與改變嗜中性粒細胞的功能和遷移，抑制TNF-α和1L-1β誘導的細胞黏附分子表達[7]。此外，SCFA還能通過阻斷INF-γ通路調(diào)節(jié)炎癥性腸病的炎癥反應[8]。因此SCFA在炎癥反應的發(fā)生過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用，研究其是否能夠抑制肝臟枯否細胞過量產(chǎn)生致炎因子從而緩解內(nèi)毒素誘導的肝臟損傷具有重要意義。

材料與方法

一、實驗動物

無特定病原體(SPF)C57/bl6小鼠40只，雌性，6～8周齡，體質(zhì)量20～25 g，購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心(動物合格證號：44007200037958)，嚴格按照SPF級要求，飼養(yǎng)于中山大學附屬第三醫(yī)院疫苗研究所動物中心，所有的程序均按照實驗室動物的護理和使用指南進行。

二、實驗試劑和儀器

1.主要實驗試劑及抗體

丁酸鈉(Sigma，美國)，脂多糖(Sigma，美國)，ALT試劑盒(Cusabio，武漢)，AST試劑盒(Cusabio，武漢) ，Trizol試劑盒(Magen，北京)，qPCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TOYOBO，上海)，蘇木素-伊紅染料(中杉金橋,北京)，EDTA抗原修復液(pH6.0)(中杉金橋，北京)，TUNEL試劑盒(Roche，瑞士)，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)試劑盒(DAKO，Denmark/上?；蚩萍脊?等。

2.主要儀器

低溫高速冷凍離心機(Eppendorf公司，德國)， PCR 儀(Labnet，美國)，Nanodrop 2000 微量紫外分光光度計(Thermo Scientific，美國)，Real-time PCR專用儀CXFconnet(Bio-RAD公司，美國)，酶標儀(BIO-TEK，EXL-800，美國)，熒光倒置顯微鏡(Leica，德國)，正置顯微鏡(Leica，德國)，免疫組織化學(組化)筆(上?；蚩萍脊?等。

三、實驗方法

1.建立內(nèi)毒素誘導的肝臟損傷模型

40只雌性小鼠隨機分成丁酸鈉+內(nèi)毒素組、內(nèi)毒素組、丁酸鈉組、正常對照組，每組10只。丁酸鈉+內(nèi)毒素組：預處理予腹腔注射丁酸鈉500 mg/kg，30 min后腹腔注射內(nèi)毒素5 mg/kg[1]。內(nèi)毒素組：預處理予腹腔注射相對應量的生理鹽水，30 min后腹腔注射內(nèi)毒素5 mg/kg。丁酸鈉組：預處理予腹腔注射丁酸鈉500 mg/kg，30 min后相對應量的生理鹽水。正常對照組：2個時間點分別腹腔注射等量的生理鹽水。

2.標本采集與處理

腹腔注射脂多糖6 h后，10%水合氯醛麻醉，眼球內(nèi)眥靜脈叢采血，再行開腹手術(shù)，迅速分離取下肝臟組織，將部分肝臟組織保存于液氮中，待提取蛋白質(zhì)或RNA，剩余部分放入10%甲醛固定液中固定制作石蠟標本；血漿在室溫靜置1 h后以1 000轉(zhuǎn)/分離心3 min，取上層血清保存于-80℃冰箱。

3.ELISA檢測ALT、AST水平

根據(jù)各ELISA試劑盒說明書，分別檢測4組血清中ALT、AST水平。

4.肝臟組織RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄

各組取適量肝臟組織，按照Trizol試劑說明書進行提取肝臟組織RNA，并用Nanodrop 2000微量紫外分光光度計測定提取的RNA濃度及純度；按照TOYOBO 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；應用SYBR Green法對目的基因TNF-α、IL-1β、IL-6及內(nèi)參基因β-actin進行Real-time PCR擴增。

5.蘇木素-伊紅染色

石蠟切片，經(jīng)過脫蠟和階梯水化后，蘇木素液染核1～3 min，后于流動的蒸餾水中洗去蘇木素液，PBST返藍，伊紅染色5～60 s，自來水漂洗，顯微鏡下觀察染色效果后用中性樹膠封片。

6.免疫組化染色

石蠟切片經(jīng)過脫蠟和階梯水化后，置于3%H2O2中室溫10 min以消除內(nèi)源性過氧化物酶；將切片放入pH 6.0的檸檬酸鈉緩沖液中進行高溫高壓熱修復抗原3 min；待溫度冷卻至室溫后取出切片，免疫組化筆畫圈；用5%牛血清白蛋白(BSA)封閉，室溫孵育10 min；滴加15～20 μl一抗(1∶200)，4℃孵育過夜; PBST泡洗5 min，滴加15～20 μl辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶400)，37℃孵育2 h；DAB顯色5 s～10 min，自來水漂洗5 min；蘇木素復染；顯微鏡下觀察染色效果，防止過染，中性樹膠封片。正置顯微鏡下進行觀察拍照及結(jié)果分析：雙盲法隨機選取20個視野，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件進行結(jié)果分析。

7.TUNEL 檢測及凋亡指數(shù)

參照Roche公司的TUNEL試劑產(chǎn)品說明書進行凋亡指數(shù)檢測，DAB顯色后細胞核呈棕褐色為陽性。每張切片隨機選取20個視野，計算陽性細胞數(shù)和肝細胞總數(shù)，凋亡指數(shù)= 陽性細胞數(shù)/上皮細胞總數(shù)×100%。

四、統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

一、各處理組別小鼠血清中ALT、AST的含量

與正常對照組的ALT、AST水平比較，丁酸鈉組無明顯差異(P>0.05)；內(nèi)毒素組和丁酸鈉+內(nèi)毒素組均升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P均﹤0.001)；而丁酸鈉+內(nèi)毒素組較內(nèi)毒素組的ALT、AST水平降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P均﹤0.001)，見表1。

表1 各處理組小鼠血清中AST、ALT的含量分析

注：與正常對照組比較，AST丁酸鈉組=0.13,P=0.90；ALT丁酸鈉組=0.43,P=0.68；AST內(nèi)毒素組=16.88,aP﹤0.01；ALT內(nèi)毒素組=22.53,aP﹤0.01；AST丁酸鈉+內(nèi)毒素組=7.93,aP﹤0.01；ALT丁酸鈉+內(nèi)毒素組=8.25,aP﹤0.01；與丁酸鈉組比較，AST內(nèi)毒素組=17.01,bP﹤0.01；ALT內(nèi)毒素組=22.96,bP﹤0.01；AST丁酸鈉+內(nèi)毒素組=8.06,bP﹤0.01；ALT丁酸鈉+內(nèi)毒素組=8.68,bP﹤0.01；與內(nèi)毒素組比較， AST丁酸鈉+內(nèi)毒素組=8.95,cP﹤0.01；ALT丁酸鈉+內(nèi)毒素組=14.27,cP﹤0.01

二、不同處理組小鼠肝臟炎癥因子mRNA的表達情況

與正常對照組相比，丁酸鈉組肝臟炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA水平無明顯差異(P>0.05)；內(nèi)毒素組上述指標的mRNA水平則升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P均﹤0.01)；丁酸鈉+內(nèi)毒素組TNF-α、IL-6 mRNA水平升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P均﹤0.01)，而IL-1β mRNA水平無明顯差異(P>0.05)；丁酸鈉+內(nèi)毒素組較內(nèi)毒素組上述指標的mRNA水平降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P均﹤0.01)，見表2。

三、各處理組小鼠肝臟蘇木素-伊紅染色對肝臟損傷的評估

丁酸鈉組與正常對照組小鼠的肝臟組織無明顯異常(圖1A、B)；內(nèi)毒素組表現(xiàn)為明顯肝內(nèi)淤血，肝細胞腫脹致正常肝竇間隙消失，失去正常的肝索結(jié)構(gòu)，絕大部分肝細胞胞漿疏松化，炎癥細胞浸潤增加(圖1C)；丁酸鈉+內(nèi)毒素組的病理顯示肝內(nèi)淤血，部分肝細胞胞漿疏松化，炎癥細胞浸潤增加(圖1D)。

表2 不同處理組別小鼠肝臟炎癥因子的相對mRNA表達情況分析

注：與正常對照組比較，TNF-α丁酸鈉組=0.02,P=0.98；IL-1β丁酸鈉組=0.93,P=0.38；IL-6丁酸鈉組=0.02,P=0.98；TNF-α內(nèi)毒素組=11.60,aP﹤0.01；IL-1β內(nèi)毒素組=17.03,aP﹤0.01；IL-6丁酸鈉組=13.28,aP﹤0.01；TNF-α丁酸鈉+內(nèi)毒素組=3.89,aP﹤0.01；IL-1β丁酸鈉+內(nèi)毒素組=2.09,P=0.07；IL-6丁酸鈉+內(nèi)毒素組=3.12,bP﹤0.05;與丁酸鈉組比較，TNF-α內(nèi)毒素組=11.58,cP﹤0.01；IL-1β內(nèi)毒素組=17.94,cP﹤0.01；IL-6內(nèi)毒素組=13.30,cP﹤0.01；TNF-α丁酸鈉+內(nèi)毒素組=3.87,cP﹤0.01；IL-1β丁酸鈉+內(nèi)毒素組=3.02,dP﹤0.05；IL-6丁酸鈉+內(nèi)毒素組=3.14,cP﹤0.01；與內(nèi)毒素組比較， TNF-α丁酸鈉+內(nèi)毒素組=7.70,eP﹤0.01；IL-1β丁酸鈉+內(nèi)毒素組=14.92,eP﹤0.01;IL-6丁酸鈉+內(nèi)毒素組=10.15,eP﹤0.01

圖1 各處理組小鼠肝臟蘇木素-伊紅染色(×200)

A：正常對照組；B：丁酸鈉組；C：內(nèi)毒素組；D：丁酸鈉+內(nèi)毒素組

四、各處理組小鼠肝臟免疫組化MPO染色檢測炎癥因子浸潤的情況

丁酸鈉組與正常對照組小鼠的肝臟組織內(nèi)鮮見MPO陽性信號(圖2A、B)，而內(nèi)毒素組肝臟組織內(nèi)MPO陽性信號增多(圖2C)。丁酸鈉+內(nèi)毒素組可見散在MPO信號(圖2D)，每個組織樣品免疫組化染色隨機計數(shù)900個細胞，記錄陽性信號細胞數(shù)。經(jīng)統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，內(nèi)毒素組MPO陽性細胞數(shù)是丁酸鈉+內(nèi)毒素組陽性細胞數(shù)的2.39±0.30倍，2組比較差異有統(tǒng)計學差異(LSD-t=13.56,P<0.01)。

圖2 各處理組小鼠肝臟免疫組化MPO染色檢測炎癥因子浸潤的情況(MPO免疫組化染色，×200)

A：正常對照組；B：丁酸鈉組；C：內(nèi)毒素組；D：丁酸鈉+內(nèi)毒素組

五、TUNEL染色檢測肝臟細胞凋亡情況

丁酸鈉組與正常對照組小鼠的肝臟組織內(nèi)未見TUNEL陽性信號(圖3A、B)，丁酸鈉+內(nèi)毒素組可見個別TUNEL信號(圖3D)，而內(nèi)毒素組肝臟組織內(nèi)可見些許TUNEL凋亡信號(圖3C)。每個組織樣品染色隨機計數(shù)900個細胞，記錄陽性信號細胞數(shù)。經(jīng)統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，內(nèi)毒素組TUNEL陽性信號是丁酸鈉+內(nèi)毒素組陽性信號數(shù)的4.89±2.17倍，2組比較差異有統(tǒng)計學差異(LSD-t=6.01,P<0.01)。

圖3 各處理組小鼠肝臟TUNEL染色檢測肝臟細胞凋亡情況(×200)

A：正常對照組；B：丁酸鈉組；C：內(nèi)毒素組；D：丁酸鈉+內(nèi)毒素組；紅色指示陽性信號

討 論

SCFA能夠為腸黏膜細胞提供能量，還能調(diào)節(jié)人體腸道菌群，有很多研究表明它可以預防結(jié)腸癌的發(fā)生，具有抗腫瘤的作用，此外還有調(diào)節(jié)炎癥反應的作用[10-11]。Cabezas等[12]就有利用膳食纖維發(fā)酵產(chǎn)生SCFA來抑制大腸炎癥反應的研究。而我們的結(jié)果證明了腹腔注射丁酸鈉可以緩解內(nèi)毒素誘導的急性肝臟炎癥反應，與絕大多數(shù)研究結(jié)果一致。GPR41、GPR43是SCFA的受體，它們位于同一條染色體上，是G蛋白偶合家族的組成成分，具有30%～40%的同源性，但是組織分布不一樣，GPR43主要高表達于造血組織，單核細胞等免疫細胞。Vinolo等[13]采用了SCFA中的乙酸鹽可以減輕機體免疫反應，證明乙酸通過激活免疫細胞GPR43來減輕炎癥。本研究證實了丁酸鈉可以緩解內(nèi)毒素誘導的急性肝臟炎癥反應，其具體機制仍待進一步深入探究。

丁酸是可吸收酸，在正常機體內(nèi)，由腸道菌群發(fā)酵產(chǎn)生的丁酸很少，血液循環(huán)中的丁酸是較微量的，因此刺激免疫細胞發(fā)揮抗炎作用能力較弱。雖然我們的研究是予以腹腔注射500 mg/kg這一較大劑量的丁酸鈉，卻未出現(xiàn)明顯酸中毒等過量表現(xiàn)，而且可以緩解內(nèi)毒素誘導的急性肝損傷。在腸道低劑量的丁酸是受體依賴性的吸收，大劑量時是濃度梯度依賴的自由穿梭吸收[14-15]。因此我們猜測通過外源性給予胃腸道補充丁酸，比如服用丁酸鈉或產(chǎn)丁酸的益生菌如丁酸梭菌，可能可以通過提高血液里的丁酸濃度達到預防和緩解急性炎癥反應的目的，這方面的研究急需開展。

肝硬化、肝功能衰竭等常常出現(xiàn)肝昏迷，而丁酸是酸性物質(zhì)，腸道補充丁酸或產(chǎn)丁酸的益生菌是否可以用于預防肝昏迷值得探討和研究。另外肝硬化、肝衰竭等患者常常發(fā)生內(nèi)源性內(nèi)毒素血癥，而且對內(nèi)毒素滅活能力降低，會進一步加重肝損傷，因此腸道補充丁酸或產(chǎn)丁酸的益生菌是否對此類患者肝功能起到一定的保護作用的研究也非常值得開展。

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