, ,,,國(guó)安

(河南科技大學(xué),洛陽(yáng)市牡丹生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,牡丹種質(zhì)創(chuàng)新與精深加工河南省工程實(shí)驗(yàn)室,河南洛陽(yáng) 471023)

牡丹是原產(chǎn)中國(guó)的特色花卉,傳統(tǒng)上主要用于觀賞和入藥,被人們認(rèn)為是富貴吉祥、繁榮昌盛的象征,在全國(guó)各地廣泛種植,其中以河南洛陽(yáng)、山東菏澤種植最多。近年來(lái),牡丹籽油開(kāi)發(fā)呈現(xiàn)良好態(tài)勢(shì),油用牡丹做為新型木本油料作物在全國(guó)的種植面積迅速擴(kuò)大,對(duì)滿足我國(guó)對(duì)優(yōu)質(zhì)食用油需求和防范食用油安全風(fēng)險(xiǎn)具有重要意義[1-2]。牡丹籽油生產(chǎn)產(chǎn)生的大量牡丹籽粕副產(chǎn)物,包含有豐富的活性成分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),如多糖、糖蛋白、蛋白質(zhì)和礦質(zhì)元素等[3]。

植物多糖來(lái)源廣泛,從植物的根、莖、葉、花、果實(shí)、種子及其他器官[4],均有成功提取活性多糖的報(bào)道。尤其是提取植物油脂后的大量餅粕副產(chǎn)物,成為植物多糖最為重要的來(lái)源,如油茶、大豆、花生等餅粕[5-6]。生物多糖具有清除自由基的作用,補(bǔ)充多糖具有明顯的抗氧化功能[7-9]。植物多糖是極性大分子化合物,其提取工藝多以熱水法為基礎(chǔ)。在多糖提取的研究中采用溶劑提取法、酸提法、堿提法、酶解法、超濾法、超聲波法、微波法等多種方法。隨著微波技術(shù)和設(shè)備的日趨完善,微波輔助法提取植物多糖的工藝優(yōu)化為生產(chǎn)應(yīng)用奠定了良好基礎(chǔ)[10-12]。張利霞等[13]通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化測(cè)得牡丹皮多糖提取率為3.727%,王洪政等[14]、路祺等[15]分別測(cè)得牡丹果莢多糖提取率為8.77%和8.34%,湛志偉等[16]通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)測(cè)得牡丹種仁的提取率為3.825%,表明牡丹果莢、種皮和種仁中均含有多糖成分。王洪政等[14]用DPPH法證明牡丹莢果多糖有明顯的抗氧化活性。因此,對(duì)牡丹籽粕多糖在醫(yī)藥保健品和天然抗氧化劑等領(lǐng)域的深入研究,具有重要的理論和應(yīng)用價(jià)值。

目前,對(duì)牡丹籽油提取工藝研究較多[17-18],而對(duì)籽粕綜合利用研究的報(bào)道較少。本研究采用微波法輔助提取牡丹籽粕中粗多糖,通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)對(duì)提取多糖的工藝參數(shù)(微波處理時(shí)間、功率、籽粕粒度和料液比)進(jìn)行了優(yōu)化,并分析了牡丹籽粕多糖的體外抗氧化活性,以期為牡丹籽粕的綜合利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

‘鳳丹’牡丹籽 經(jīng)超臨界萃取牡丹籽油后的籽粕,密封保存于4 ℃冰箱備用;三氯甲烷、正丁醇、無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚、鹽酸、氫氧化鈉、酚酞、葡萄糖、3,5-二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、結(jié)晶酚、亞硫酸鈉、碘、碘化鉀、硫酸亞鐵、三氯乙酸、抗壞血酸(VC)、二丁基羥基甲苯(BHT)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、硫代巴比妥酸(TBA) 均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

格蘭仕WD800G-BL20微波爐 順德市格蘭仕電器實(shí)業(yè)有限公司;RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;JA8102電子天平 上海精密電子儀器有限公司;TU1810 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;HH-S2數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市醫(yī)療儀器廠;索氏抽提器 上海瀚赫國(guó)際貿(mào)易有限公司;LD4-2低速離心機(jī) 北京醫(yī)用離心機(jī)廠;XH-B渦旋混合器 無(wú)錫沃信儀器制造有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 多糖的提取

1.2.1.1 多糖微波法提取工藝流程 稱取粉碎、過(guò)篩分級(jí)的牡丹籽粕適量,乙醚回流脫脂3 h(固液比1∶3,W/V),40 ℃烘干。準(zhǔn)確稱取合適粒度的牡丹籽粕2.00 g放入三角瓶,加入適量的蒸餾水,經(jīng)一定的微波功率下間歇處理一段時(shí)間,50 ℃保溫振蕩30 min,然后4000 r/min離心25 min,取上清液,再加入25%體積的Sevag試劑(V氯仿∶V正丁醇=4∶1),劇烈振蕩20 min,4000 r/min離心20 min,取上清液重復(fù)脫蛋白,直至離心后無(wú)蛋白中間層出現(xiàn)。然后將上清液減壓濃縮至適量,再加入3倍體積的無(wú)水乙醇,靜置過(guò)夜。4000 r/min離心25 min,沉淀部分經(jīng)無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚依次洗滌,靜置沉淀離心,棄上清后40 ℃干燥箱中干燥,即可獲得牡丹籽粕粗多糖(PS)。

1.2.1.2 多糖含量測(cè)定 以葡萄糖為對(duì)照品,采用3,5-二硝基水楊酸比色法測(cè)定牡丹籽粕還原糖含量。將提取的牡丹籽粕粗多糖用蒸餾水溶解,定容至250 mL。準(zhǔn)確吸取稀釋液10 mL,加入6 mol/L HCl溶液5 mL,沸水浴中水解0.5 h,冷卻后用6 mol/L NaOH溶液中和至pH呈中性,然后用蒸餾水定容至100 mL。分別取1 mL糖提取液和糖水解液,測(cè)定還原糖含量。按下列公式計(jì)算樣品多糖提取得率:

還原糖(%)=C1V1/m×100

總糖(%)=C2V2N/m×0.9×100

多糖提取得率(%)=總糖-還原糖

式中:C1為還原糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(mg/mL),V1為樣品總糖溶液的體積(mL),C2為水解后還原糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(mg/mL),V2為樣品總糖水解液的體積(mL),N為稀釋倍數(shù),m為樣品的質(zhì)量(mg)。

1.2.2 牡丹籽粕多糖提取單因素實(shí)驗(yàn) 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,影響牡丹籽粕多糖微波輔助提取的主要因素有微波處理時(shí)間、微波功率、籽粕粒度、料液比等。

1.2.2.1 微波處理時(shí)間 分別為1、2、3、4、5、6、7、8和9 min,在微波功率160 W、物料粒度60目、料液比1∶15 g/mL條件下提取一次,考察微波處理時(shí)間對(duì)多糖得率的影響。

1.2.2.2 微波功率 分別為160、320、480、640和800W,在微波處理時(shí)間7 min、物料粒度60目、料液比1∶15 g/mL條件下提取一次,考察微波功率對(duì)多糖得率的影響。

1.2.2.3 物料粒度 分別為20、40、60、80、100和120目,在微波處理時(shí)間7 min、微波功率480 W、料液比1∶15 g/mL條件下提取一次,考察物料粒度對(duì)多糖得率的影響。

1.2.2.4 料液比 分別為1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35,在微波處理時(shí)間7 min、微波功率480 W、物料粒度80目條件下提取一次,考察料液比對(duì)多糖得率的影響。

1.2.3 牡丹籽粕多糖提取正交實(shí)驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)確定的條件范圍,進(jìn)行微波處理時(shí)間、功率、籽粕粒度和固液比4因素3水平的正交實(shí)驗(yàn),選用L9(34)正交實(shí)驗(yàn),確定提取多糖的最佳工藝參數(shù),水平因素見(jiàn)表1。結(jié)果由極差分析和SPSS 20.0軟件進(jìn)行方差分析,確定各因素對(duì)多糖提取得率的影響大小和多糖最優(yōu)提取工藝。

表1 微波法提取牡丹籽粕多糖正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 The orthogonal test factors and levels of tree peony seed meal by Microwave extract

1.3體外抗氧化活性

1.3.1 DPPH自由基體系 按彭長(zhǎng)連等[19]和Larrauri等[20]的方法加以改進(jìn)。將1 mL不同濃度的多糖水溶液加入2 mL 100 μmol/L DPPH乙醇溶液中,以等體積的雙蒸水代替多糖溶液作為對(duì)照,用乙醇溶液為空白對(duì)照調(diào)零。室溫放置30 min后,用分光光度計(jì)測(cè)定517 nm處的吸光值,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。清除DPPH自由基活性用抑制率(%)表示。

抑制率(%)=(對(duì)照管A517-樣品管A517)/對(duì)照管A517×100。

以脂溶性BHT(200 μg/mL)與水溶性VC(80 μg/mL)的乙醇溶液做陽(yáng)性對(duì)照,繪制清除DPPH自由基的時(shí)間效應(yīng)曲線,對(duì)比60 μg/mL牡丹籽粕多糖(PS)溶液的作用時(shí)間效應(yīng)曲線,以此推斷牡丹籽粕多糖的抗氧化劑的作用特性。

1.3.2 卵黃脂蛋白PUFA過(guò)氧化體系中抗氧化活性的測(cè)定 按張爾賢等[21]和史國(guó)安等[22]方法,建立以Fe2+誘發(fā)卵黃磷脂C-2上的極低密度脂蛋白和低密度脂蛋白PUFA的過(guò)氧化模型。

取新鮮的雞蛋黃加等體積的無(wú)菌蒸餾水,制備蛋黃懸浮液。 配制100 μg/mL PS水溶液和30%乙醇溶液,及80 μg/mL VC和 200 μg/mL BHT的乙醇溶液做陽(yáng)性對(duì)照。反應(yīng)體系:0.2 mL蛋黃懸浮液,0.2 mL 25 mmol/L FeSO4,1.5 mL磷酸鹽緩沖液(pH7.0),0.1 mL 樣品溶液,將試管置于 37 ℃水浴中溫浴 60 min,然后加入 2.0 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.5% TBA-20% TCA 溶液,沸水浴15 min,迅速冷卻,于 3500 r/min離心5 min,以空白管調(diào)零(以等量的蒸餾水代替),測(cè)定 532 nm處的吸光值。對(duì)照管以等量的提取介質(zhì)代替,其他同樣品管。樣品抗氧化活性(AOA)用卵黃脂蛋白脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制率(%)表示。

AOA(%)=(對(duì)照管A532-樣品管A532)/對(duì)照管A532×100。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用鄧肯氏新復(fù)極差法檢驗(yàn),以p<0.05為差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1牡丹籽粕多糖的單因素提取實(shí)驗(yàn)

2.1.1 微波處理時(shí)間對(duì)牡丹籽粕多糖得率的影響 由圖1可知,相同條件下,牡丹籽粕多糖得率隨微波處理時(shí)間延長(zhǎng)而升高,當(dāng)微波處理時(shí)間超過(guò)7 min時(shí),牡丹籽粕多糖得率反而略有下降?？赡苡捎谠跇O性溶劑水中,植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)受到微波輻射的破壞,使細(xì)胞內(nèi)滲透壓升高更容易破壁,而微波處理時(shí)間長(zhǎng)導(dǎo)致較多雜質(zhì)溶出和多糖水解的緣故。由于微波處理時(shí)間7 min 時(shí)優(yōu)勢(shì)顯著,因此選擇微波處理時(shí)間7 min為最佳處理時(shí)間。

圖1 微波處理時(shí)間對(duì)多糖得率的影響Fig.1 Effect of microwave time on polysaccharide yield

2.1.2 微波功率對(duì)牡丹籽粕多糖得率的影響 由圖2可知,牡丹籽粕多糖隨微波功率的提高呈現(xiàn)升高趨勢(shì),當(dāng)微波功率480 W時(shí),多糖得率最高,之后反而下降?？赡苡捎诠β蔬^(guò)大加速了提取液的流動(dòng)和物料的溫度,在提高多糖浸出的同時(shí)加速了多糖的水解。故選擇微波功率320～640 W范圍內(nèi)進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

圖2 微波功率對(duì)多糖得率的影響Fig.2 Effect of microwave power on polysaccharide yield

2.1.3 物料粒度對(duì)牡丹籽粕多糖得率的影響 由圖3可知,隨著物料粒度的增大粒徑減小,牡丹多糖得率迅速升高。當(dāng)粒度20～80目范圍內(nèi),多糖得率增加明顯,而物料粒度超過(guò)80目,則多糖得率反而下降?？赡芰竭^(guò)大則細(xì)胞壁破壞困難,多糖溶出擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)阻力也隨之增加;粒度過(guò)小多糖容易溶出,但也亦導(dǎo)致提取液粘度增大的緣故。故選擇物料粒度60～100 目范圍內(nèi)進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

圖3 物料粒度對(duì)多糖得率的影響Fig.3 Effect of material size on polysaccharide yield

2.1.4 料液比對(duì)牡丹籽粕多糖得率的影響 由圖4可知,當(dāng)料液比由1∶15 g/mL增加到1∶30 g/mL時(shí),牡丹籽粕多糖得率不斷升高,當(dāng)料液比大于1∶30 g/mL時(shí),多糖得率趨于穩(wěn)定不再升高。在一定范圍內(nèi),提取液用量越大,多糖得率越高;但當(dāng)提取液用量過(guò)多時(shí),多糖的浸出趨于完全,可能由于此時(shí)細(xì)胞壁破壞徹底,多糖溶出較完全的原因。故此選擇料液比為(1∶20～1∶30) g/mL進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

圖4 料液比對(duì)多糖得率的影響Fig.4 Effect of material to liquid ratio on polysaccharide yield

2.2牡丹籽粕多糖的提取工藝優(yōu)化

根據(jù)表2可知,微波法輔助提取工藝中,各因素對(duì)牡丹籽粕多糖提取得率的影響力大小依次為為:料液比>微波功率>籽粕粒度>微波處理時(shí)間。最佳提取工藝條件為A3B2C3D2:微波提取時(shí)間8 min,微波功率480 W,粒度100目,料液比1∶25。

由表3可見(jiàn),微波處理功率、固液比、籽粕粒度對(duì)提取結(jié)果的影響差異極顯著,微波處理時(shí)間對(duì)提取結(jié)果影響差異顯著。

表2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of orthogonal test

由于正交實(shí)驗(yàn)所得的最佳工藝條件A3B2C3D2不在正交實(shí)驗(yàn)表中,故做驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),與正交表中多糖得率最高的工藝條件A1B2C2D2進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)。按照最佳提取工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),牡丹籽粕多糖最高提取得率為9.21%,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明最佳工藝條件仍為A3B2C3D2。

表3 微波法提取結(jié)果的方差分析Table 3 Analysis of variance of microwave extraction results

注:*p<0.05,差異顯著;**p<0.01,差異極顯著。

2.3體外抗氧化活性

2.3.1 清除DPPH自由基活性 從圖5時(shí)間效應(yīng)曲線可以看出,清除DPPH反應(yīng)體系中,水溶性抗氧化劑VC(80 μg/mL)能夠在短時(shí)間內(nèi)達(dá)到反應(yīng)平衡,而脂溶性抗氧化劑BHT(200 μg/mL)達(dá)到反應(yīng)平衡的時(shí)間超過(guò)50 min。牡丹籽粕多糖(60 μg/mL PS)清除DPPH自由基的時(shí)間效應(yīng)曲線與VC類似,由此推測(cè)PS抗氧化作用的類型類似于水溶性抗氧化劑VC。

圖5 不同效應(yīng)物清除DPPH自由基的濃度和時(shí)間效應(yīng)曲線Fig.5 Time curves of scavenging effects of different effectors on DPPH

由圖6可知,牡丹籽粕多糖清除DPPH自由基的能力呈現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系。隨著反應(yīng)體系中牡丹籽粕多糖溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高,清除DPPH自由基的能力逐漸增強(qiáng),當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100 μg/mL時(shí),清除率達(dá)80%以上。PS的IC50為43.22 μg/mL,大于VC的IC50(4.52 μg/mL)和BHT的IC50(21.20 μg/mL)。說(shuō)明PS對(duì)DPPH自由基的亦有較強(qiáng)的清除能力,揭示PS具有較強(qiáng)的抗氧化活性。

圖6 牡丹籽粕多糖對(duì)DPPH自由基的清除效應(yīng)Fig.6 Scavenging effects of crude polysaccharide on DPPH

2.3.2 卵黃脂蛋白PUFA過(guò)氧化體系中抗氧化活性 圖7示出,100 μg/mL PS水溶液的抗氧化活性略高于體積分?jǐn)?shù)30%乙醇多糖溶液,兩種溶液(100 μg/mL)的AOA值為20%～30%,但低于陽(yáng)性對(duì)照VC(80 μg/mL)和BHT(200 μg/mL)。提示PS具有一定的抑制脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物形成的能力,生物抗氧化效應(yīng)明顯。

圖7 牡丹籽粕多糖(PS)抗脂質(zhì)過(guò)氧化活性Fig.7 Antilipoperoxidation activity of polysaccharides from tree peony seed meal

3 結(jié)論

本研究以‘鳳丹’牡丹籽粕為原料,采用微波輔助法提取牡丹籽粕中多糖,在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),優(yōu)化了最佳的提取工藝條件。正交實(shí)驗(yàn)表明,各因素對(duì)多糖得率的影響大小依次為固液比>微波功率>籽粕粒度>微波處理時(shí)間,最佳微波提取工藝條件為:提取時(shí)間8 min,微波功率480 W,粒度120目,固液比1∶25 g/mL。在最佳工藝條件下,一次牡丹籽粕多糖提取率達(dá)到9.21%。微波輔助法是提取牡丹籽粕中水溶性多糖的一種簡(jiǎn)單高效的好方法。

牡丹籽粕含有豐富的生物多糖。體外抗氧化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),牡丹籽粕多糖(PS)對(duì)DPPH的清除能力呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系,抑制卵黃脂蛋白PUFA過(guò)氧化能力明顯,具有較強(qiáng)的抗氧化能力。表明牡丹籽粕多糖有可成為一種新的天然抗氧化劑。本研究結(jié)果為進(jìn)一步探討牡丹籽粕多糖做為食品添加劑、天然抗氧化劑等中的綜合利用提供了科學(xué)依據(jù)。

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