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(哈爾濱工業(yè)大學(xué)化工與化學(xué)學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150090)

群體感應(yīng)(quorum sensing,QS)是細(xì)菌進(jìn)行種間或種內(nèi)信息交流的一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制,通過(guò)釋放、感知和響應(yīng)小分子信號(hào)物質(zhì)來(lái)調(diào)控細(xì)菌的一系列的生理生化功能[1],包括毒力因子的產(chǎn)生[2]、抗生素及色素的產(chǎn)生[3]、細(xì)菌素的產(chǎn)生[4]和生物膜的形成[5]等。群體感應(yīng)現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)最早源于Engebrecht等人對(duì)海洋發(fā)光細(xì)菌Vibrio fischeri的光致發(fā)光這一生理現(xiàn)象的研究[6]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),細(xì)菌會(huì)向胞外分泌一種自誘導(dǎo)物作為感知周圍環(huán)境中種群密度大小的信號(hào)分子,進(jìn)而調(diào)控相應(yīng)的基因表達(dá),以對(duì)細(xì)菌的生理生化行為進(jìn)行調(diào)節(jié),這種基于群體密度感知的行為調(diào)節(jié)模式是在細(xì)菌QS系統(tǒng)的調(diào)控下完成的。

乳酸菌是一種革蘭氏陽(yáng)性菌,其作為一種益生菌,具有產(chǎn)酸耐酸[7]、抑制致病微生物生長(zhǎng)繁殖[8]、調(diào)節(jié)腸道微生物群[9]以及增強(qiáng)人體免疫力[10]等多種有益的生理活性功能,因而其在食品加工貯藏和營(yíng)養(yǎng)保健方面得到廣泛的關(guān)注和應(yīng)用。自然界中,絕大多數(shù)細(xì)菌都可以形成生物膜,群體感應(yīng)調(diào)節(jié)機(jī)制也在不同細(xì)菌物種中普遍存在,乳酸菌也不例外。成熟的生物膜可以幫助乳酸菌抵御不利的外界環(huán)境,有助于提高菌體酸性耐受力、維持自身生長(zhǎng)和發(fā)揮益生作用等[11]。目前,對(duì)于不同種細(xì)菌的生物膜形成過(guò)程及其與QS系統(tǒng)之間關(guān)系的研究有很多,但大部分集中在如何控制致病菌生物膜的形成等。本文以QS系統(tǒng)為出發(fā)點(diǎn),對(duì)QS系統(tǒng)調(diào)控乳酸菌生物膜的形成機(jī)制進(jìn)行闡述,對(duì)于高效發(fā)揮益生菌的益生作用具有重大意義。

1 乳酸菌QS系統(tǒng)組成及調(diào)節(jié)機(jī)制

細(xì)菌的QS系統(tǒng)按照信號(hào)分子種類的不同而分為不同的類型。在革蘭氏陰性菌的QS系統(tǒng)中,普遍以一種?；呓z氨酸內(nèi)酯作為信號(hào)分子去感知菌群密度,最終達(dá)到對(duì)細(xì)菌行為方式進(jìn)行調(diào)節(jié)的目的[12]。乳酸菌作為革蘭氏陽(yáng)性菌,擁有一套不同于革蘭氏陰性菌的QS系統(tǒng),其QS系統(tǒng)以一種自誘導(dǎo)信號(hào)(antoinduction,AI)感知胞間訊息,此外還包括一個(gè)用于感應(yīng)自誘導(dǎo)信號(hào)的雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)(two-component system,TCS)。

1.1乳酸菌QS系統(tǒng)信號(hào)分子

乳酸菌的信息交流模式以細(xì)胞密度依賴性方式進(jìn)行,大體分為種內(nèi)信息交流和種間信息交流兩種。

種內(nèi)信息交流以一種特異性自體誘導(dǎo)物1(antoinduction-1,AI-1)小分子信號(hào)肽(autoinducing signalling peptides,AIPs)作為信號(hào)分子,這些AIPs的產(chǎn)生通常經(jīng)過(guò)翻譯后修飾:首先,具有保守殘基的可識(shí)別前導(dǎo)肽對(duì)細(xì)胞質(zhì)中的寡肽類物質(zhì)進(jìn)行切割;隨后將其加工成可分泌到胞外的成熟AIPs;最后,通過(guò)專用運(yùn)輸系統(tǒng)ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體轉(zhuǎn)運(yùn)輸出[13]。不同菌體及不同的QS系統(tǒng)的AIPs具有一定的差異,這種特異性主要是由氨基酸排列順序的不同以及空間結(jié)構(gòu)的差異決定的[14]。

種間信號(hào)交流是不同種細(xì)菌的細(xì)胞間信號(hào)通訊方式,以不同于種內(nèi)信號(hào)交流的另一種自體誘導(dǎo)物2(antoinduction-2,AI-2)呋喃酮酰硼酸二酯作為信號(hào)分子,現(xiàn)已報(bào)道在革蘭氏陰性菌和陽(yáng)性菌中都存在以AI-2感知環(huán)境競(jìng)爭(zhēng)壓力的AI-2/LuxS QS系統(tǒng)調(diào)節(jié)機(jī)制[15],這個(gè)QS系統(tǒng)在多種細(xì)菌種內(nèi)和種間的信息交流中都發(fā)揮著重要作用[16-17]。在AI-2/LuxS QS系統(tǒng)中,由luxS基因介導(dǎo)AI-2的信號(hào)傳導(dǎo),luxS基因是一種高保守性基因,在革蘭氏陰性菌和陽(yáng)性菌中都廣泛存在,現(xiàn)已證明參與群體感應(yīng)的luxS基因控制乳酸菌的不同行為[18-19]。AI-2是由甲硫氨酸作為起始物,經(jīng)過(guò)四個(gè)酶促反應(yīng)步驟產(chǎn)生的:首先,甲硫氨酸在甲硫氨酸合成酶的催化作用下產(chǎn)生S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM);然后,SAM作為甲基供體在SAM依賴性甲基轉(zhuǎn)移酶作用下生成S-腺苷同型半胱氨酸(S-adenosylhomocysteine,SAH);接下來(lái),SAH被SAH核苷酸酶催化分解成腺嘌呤和S-核糖同型半胱氨酸(S-ribosylhomocysteine,SRH);最后,SRH在LuxS蛋白的催化下生成同型半胱氨酸和4,5-二羥基-2,3-戊二酮,前者進(jìn)一步生成甲硫氨酸,AI-2則作為副產(chǎn)物由后者衍生而來(lái)。4,5-二羥基-2,3-戊二酮自發(fā)重排使得AI-2分子具有特異性[20]。在整個(gè)過(guò)程中,LuxS蛋白作為催化AI-2合成的關(guān)鍵酶,由luxS基因表達(dá)得到,如果細(xì)菌的LuxS蛋白失活或luxS基因未表達(dá),則無(wú)法產(chǎn)生AI-2進(jìn)行細(xì)胞間信號(hào)傳遞。Buck等人通過(guò)位點(diǎn)特異性整合,在嗜酸乳酸桿菌的luxS基因位點(diǎn)處中產(chǎn)生同基因突變,所得的luxS突變體不產(chǎn)生AI-2,證明了luxS基因在AI-2的產(chǎn)生中起到重要作用[21]。

1.2乳酸菌群體感應(yīng)中的雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)(QS-TCS)

微生物具有感測(cè)環(huán)境信號(hào)和響應(yīng)環(huán)境變化的能力,TCS是監(jiān)測(cè)和轉(zhuǎn)導(dǎo)環(huán)境信號(hào)最重要的機(jī)制之一,這一系統(tǒng)作為乳酸菌QS系統(tǒng)的重要組成部分,在對(duì)群體感應(yīng)信號(hào)分子的轉(zhuǎn)導(dǎo)方面發(fā)揮著重要作用。QS-TCS的主要作用是對(duì)輸出到胞外的QS系統(tǒng)的信號(hào)分子進(jìn)行感知進(jìn)而達(dá)到調(diào)控菌體行為的目的[22]。一個(gè)典型的TCS由檢測(cè)特定環(huán)境信號(hào)的膜相關(guān)組氨酸蛋白激酶(histidine protein kinase,HPK)和細(xì)胞質(zhì)應(yīng)答調(diào)節(jié)子(response regulator,RR)組成。HPK通常由一個(gè)可變的N端信號(hào)輸入結(jié)構(gòu)域和一個(gè)保守的C端自激酶結(jié)構(gòu)域兩部分組成,自激酶結(jié)構(gòu)域又可以分為兩個(gè)亞結(jié)構(gòu)域:組氨酸磷酸轉(zhuǎn)移酶亞結(jié)構(gòu)域和ATP結(jié)合亞結(jié)構(gòu)域。 RR通常由調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域兩部分組成,其中調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域位于N端,含有一個(gè)可接受的磷酸基團(tuán)的天冬氨酸殘基,作為信號(hào)接收位點(diǎn);DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域位于C端,作為信號(hào)輸出位點(diǎn)。在TCS中,信號(hào)分子的信息傳遞過(guò)程如下:通過(guò)組氨酸蛋白激酶的輸入結(jié)構(gòu)域檢測(cè)到信號(hào)分子,使其自身被激活。具有活性的組氨酸蛋白激酶通過(guò)ATP水解在組氨酸殘基上發(fā)生自磷酸化,然后將該磷?；D(zhuǎn)移至RR的受體結(jié)構(gòu)域中的天冬氨酸殘基,進(jìn)而激活調(diào)節(jié)蛋白并促進(jìn)轉(zhuǎn)錄反應(yīng)[23]。大量研究通過(guò)基因敲除構(gòu)建的QS-TCS突變型菌株與野生型菌株相比,出現(xiàn)耐酸性下降[23]、自溶率升高[24]等表現(xiàn),證明了TCS在微生物適應(yīng)環(huán)境中的重要作用。

2 乳酸菌生物膜形成機(jī)制

生物膜是是細(xì)菌粘附于惰性物體或活體生物表面生長(zhǎng)、繁殖,由其自身分泌的胞外多聚基質(zhì)所包被起來(lái)形成的一種具有高度組織化的微菌落聚集體[25],是菌體為抵御不良環(huán)境而發(fā)展形成的一種自我保護(hù)模式。在自然界中,除了極少部分細(xì)菌以浮游形式存在外,絕大多數(shù)細(xì)菌都是以生物膜形式存在的[26]。乳酸菌作為益生菌,促進(jìn)健康和發(fā)揮最佳功能的關(guān)鍵因素就在于它的存活能力和生物膜的形成可以提高乳酸菌的耐酸、耐滲透壓等能力,提高抗菌活性[27-28]，同時(shí),也會(huì)大大提高乳酸菌作為食品添加劑摻入食品,或是作為益生菌提高在機(jī)體腸道存活率。

2.1乳酸菌生物膜的組成

成熟的生物膜中包含多種成分,其中主要是有機(jī)基質(zhì)和細(xì)菌生命體。有機(jī)基質(zhì)是外膜蛋白質(zhì)以及一些分泌到胞外的多糖和核酸等,這些胞外多聚基質(zhì)參與細(xì)菌的粘附,它們相互連結(jié)成細(xì)胞間質(zhì),包裹在細(xì)菌微菌落外部或存在于細(xì)菌單細(xì)胞之間,為細(xì)菌提供了天然的“屏障”,以減少外界不良環(huán)境對(duì)菌體的侵害[29]。另外,有機(jī)基質(zhì)除了提供菌體粘附性之外,還可以賦予生物膜表面疏水性功能[30]。生物膜內(nèi)的細(xì)菌生命體與浮游細(xì)菌在形態(tài)和生理特性等方面具有明顯的差異,生物膜表層的細(xì)菌與內(nèi)部的細(xì)菌也具有一定的差異。位于生物膜表層的細(xì)菌更容易接觸和利用到環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)成分,因此分裂速度快,代謝也比較活躍,菌體的體積相對(duì)較大,與浮游細(xì)菌類似。而處在生物膜內(nèi)部的細(xì)菌,其獲得營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的傳送及排泄物的運(yùn)輸途徑只能是通過(guò)由有機(jī)基質(zhì)粘連形成的間質(zhì)間水通道進(jìn)行,因此代謝物排出緩慢,代謝率較低,菌體多處于不活躍的休眠狀態(tài)[31]。

2.2乳酸菌生物膜的形成過(guò)程

乳酸菌生物膜的形成與大多數(shù)細(xì)菌一樣,是一個(gè)動(dòng)態(tài)循環(huán)的過(guò)程。在這個(gè)過(guò)程中要經(jīng)歷以下幾個(gè)階段:首先,菌體通過(guò)鞭毛運(yùn)動(dòng)粘附于物體表面,此時(shí)細(xì)胞的粘附強(qiáng)烈依賴于細(xì)菌細(xì)胞表面的理化性質(zhì),微生物尚未發(fā)生形態(tài)變化,生物膜還未形成,粘附的細(xì)菌還可以成為浮游狀態(tài),因此粘附是可逆的;當(dāng)粘附的細(xì)菌逐漸增多,細(xì)菌與物體表面的可逆弱結(jié)合轉(zhuǎn)變成具有胞外粘性基質(zhì)的永久性不可逆結(jié)合;隨著物體表面的細(xì)菌的大量聚集,分泌到胞外的基質(zhì)也越來(lái)越多,細(xì)菌相互粘附,牢固地貼于物體表面,逐漸形成大量微菌落這時(shí)的粘附是不可逆的;之后,生物膜漸漸成熟并且發(fā)展成由蘑菇狀或株?duì)钗⒕洳粩喽逊e形成的有組織的、不均勻的結(jié)構(gòu);在生物膜成熟后,生物膜中的細(xì)菌通過(guò)部分脫落或釋放等方式游離出來(lái),尋找新的位點(diǎn),開(kāi)啟新一輪生物膜的形成之路[11],這一過(guò)程稱為生物膜的釋放。簡(jiǎn)單地講,生物膜的形成主要就是由多糖細(xì)胞間粘附素、蛋白質(zhì)和核酸等胞外粘性基質(zhì)介導(dǎo)的細(xì)菌的粘附和多層細(xì)菌的積累[32]。在細(xì)菌的粘附積累過(guò)程中,QS系統(tǒng)發(fā)揮著相當(dāng)?shù)淖饔肹29]。

3 QS系統(tǒng)介導(dǎo)乳酸菌生物膜形成

乳酸菌生物膜的形成源于菌體在物體表面逐漸由可逆粘附轉(zhuǎn)變成為不可逆的結(jié)合與積累,其通過(guò)群體感應(yīng)和菌體細(xì)胞間的相互作用來(lái)控制,形成生物膜的細(xì)菌通過(guò)生物膜直接進(jìn)行接觸,這部分菌體與具有的生理活性與浮游狀態(tài)的細(xì)菌相比已發(fā)生了改變[33]。相比于浮游細(xì)菌,生物膜表層細(xì)菌會(huì)分泌更多的有機(jī)基質(zhì)到胞外,以提高菌體的粘附性,進(jìn)一步提高菌體定植于物體表面形成生物膜的能力。

3.1QS系統(tǒng)與細(xì)菌粘附性的關(guān)系

生物膜形成的關(guān)鍵在于細(xì)胞粘附性的提高,其在一定程度上有助于菌體的積累,進(jìn)而促進(jìn)生物膜的形成與成熟。有關(guān)生物膜的形成能力與細(xì)胞粘附性之間的關(guān)系在一些研究中得到證明。有研究表明在沒(méi)有葡萄糖的MRS培養(yǎng)基中添加粘蛋白使鼠李糖乳桿菌的生物膜形成能力提高了20%[34];植物乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌在高濃度膽汁和粘液下形成生物膜[35];Lebeer 等人獲得的含胞外多糖合成相關(guān)基因的鼠李糖乳桿菌突變株與野生型相比,其生物膜形成能力也得到了提高[36]。有關(guān)QS系統(tǒng)的信號(hào)分子能夠影響乳酸菌的粘附性已有相關(guān)報(bào)道,Buck等研究發(fā)現(xiàn),嗜酸乳桿菌luxS 基因缺失突變株相比于野生型菌株,其粘附于腸表皮細(xì)胞的能力下降了58%,而luxS基因是AI-2分子合成的關(guān)鍵酶基因[21]。Sturme等人則在植物乳桿菌WCFS1中發(fā)現(xiàn)了與金黃色葡萄球菌中調(diào)控生物膜形成有關(guān)的QS系統(tǒng)——agrBDCA系統(tǒng)具有同源性的lamBDCA系統(tǒng)[37]。有關(guān)agrBDCA系統(tǒng)調(diào)節(jié)生物膜形成的過(guò)程大致如下:AgrD作為前體產(chǎn)生具有獨(dú)特的硫酯環(huán)結(jié)構(gòu)的八肽型AIPs,并通過(guò)AgrB膜蛋白運(yùn)輸?shù)桨?隨著細(xì)胞密度的增加,AIP的濃度逐漸提高,與組氨酸激酶受體AgrC結(jié)合,使之磷酸化,激活響應(yīng)調(diào)節(jié)劑AgrA,被激活的AgrA與全局調(diào)節(jié)子SarA協(xié)同作用,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的RNAII(與QS擴(kuò)增有關(guān))和RNAIII(與外蛋白產(chǎn)生有關(guān))的轉(zhuǎn)錄[33]。在植物乳桿菌WCFS1的lamBDCA系統(tǒng)中,LamD作為自誘導(dǎo)肽前體由LamB加工蛋白加工成LamD-衍生肽,這兩種蛋白均由lamBD基因表達(dá)而來(lái)。LamD-衍生肽是與agr系統(tǒng)的AIP結(jié)構(gòu)類似的一種環(huán)狀硫內(nèi)酯五肽,命名為L(zhǎng)amD558。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)lam系統(tǒng)參與了植物乳桿菌玻璃表面粘附的調(diào)節(jié),說(shuō)明乳桿菌中agr樣QS系統(tǒng)——lamBDCA系統(tǒng)在提高細(xì)胞粘附方面有著不可忽視的作用,這能夠?yàn)镼S系統(tǒng)介導(dǎo)乳酸菌生物膜的形成提供一定證據(jù)。

3.2QS系統(tǒng)與生物膜形成的關(guān)系

QS系統(tǒng)能夠介導(dǎo)乳酸菌生物膜的形成來(lái)自Lebeer等人的研究,他們發(fā)現(xiàn)鼠李糖乳桿菌luxS基因缺失突變株形成生物膜的能力下降,外源添加AI-2前體分子或野生型菌株則可以部分回補(bǔ)突變株生物膜的形成,但不能恢復(fù)到原始狀態(tài)[38]。乳酸菌QS系統(tǒng)的信號(hào)分子自誘導(dǎo)肽在菌體生長(zhǎng)期間以低水平產(chǎn)生,當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到一定閾值時(shí),與TCS中受體激酶HPK結(jié)合,使之發(fā)生自磷酸化,隨后磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移激活響應(yīng)調(diào)節(jié)劑RR,引起動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)的自身誘導(dǎo)[39]。QS系統(tǒng)介導(dǎo)乳酸菌生物膜的形成主要在膜的生長(zhǎng)期和散播期發(fā)揮作用[29]:生長(zhǎng)期即指細(xì)菌的不可逆粘附與積累時(shí)期,這一階段的特點(diǎn)是由于胞外粘性基質(zhì)的分泌,乳酸菌體大量粘附聚集,信號(hào)分子感知細(xì)胞密度,達(dá)到閾值后引起細(xì)胞內(nèi)特定RNA轉(zhuǎn)錄,促進(jìn)生物膜的成熟。散播期則是在生物膜成熟之后,這一階段由于生物膜內(nèi)部細(xì)菌的代謝廢物只能通過(guò)間質(zhì)水通道排除,大量粘附聚集的細(xì)菌導(dǎo)致有限的空間內(nèi)代謝廢物的累積,出現(xiàn)種內(nèi)或種間競(jìng)爭(zhēng)。在這一過(guò)程中,細(xì)胞QS系統(tǒng)在不利的環(huán)境因素下通過(guò)啟動(dòng)特定基因表達(dá),調(diào)控生物膜內(nèi)細(xì)菌部分脫落,重新成為浮游狀態(tài),避免細(xì)菌過(guò)度生長(zhǎng),出現(xiàn)代謝廢物累積、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)匱乏等不良情況[40]。

4 結(jié)語(yǔ)和展望

乳酸菌在食品工業(yè)中,可作為食品添加劑用于酸奶制品生產(chǎn)、食品保藏等,由于乳酸菌生物膜可以提高乳酸菌在各種環(huán)境中的穩(wěn)定性,將乳酸菌以生物膜形式添加到食品中還可以提高食品的穩(wěn)定性。乳酸菌對(duì)人體的健康具有頗多的益處,如何提高乳酸菌在不利環(huán)境中的存活率,實(shí)現(xiàn)對(duì)菌體的高密度培養(yǎng),一直是現(xiàn)階段研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。許多研究已經(jīng)證實(shí)QS系統(tǒng)對(duì)乳酸菌包括生物膜形成在內(nèi)的各種生理生化行為進(jìn)行著調(diào)控,該系統(tǒng)對(duì)于生物膜的形成能力具有一定的影響,聚焦QS系統(tǒng)的調(diào)控機(jī)理、進(jìn)一步研究QS系統(tǒng)是如何介導(dǎo)生物膜形成的分子機(jī)制對(duì)高效利用乳酸菌具有重大意義。

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