朱曉華，王 凱，夏麗萍，梁 倩，孟 勇

（1．江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，水產(chǎn)質(zhì)量檢測(cè)中心，農(nóng)業(yè)部漁業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心（南京），南京210017；2．譜尼測(cè)試集團(tuán)股份有限公司，北京100080）

五氯苯酚（PCP）是一種有毒農(nóng)藥，曾在全球范圍內(nèi)被廣泛用作除草劑、木材防腐劑和生物殺傷劑等，其鈉鹽形式－五氯酚鈉（PCP－Na）在我國(guó)曾作為殺滅血吸蟲中間宿主釘螺的藥物和水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中作清塘藥物在水體大量使用［1］。PCP為環(huán)境荷爾蒙，微量即對(duì)人體有害［2］，美國(guó)環(huán)境保護(hù)署（EPA）、歐盟、加拿大等相繼限制其使用［3－5］。我國(guó)農(nóng)業(yè)部2002年發(fā)文明確規(guī)定了食品動(dòng)物生產(chǎn)中禁用五氯酚鈉。水產(chǎn)品中PCP及其鈉鹽殘留量一直是近年政府監(jiān)測(cè)的重點(diǎn)參數(shù)，結(jié)果顯示，以往施用的PCPNa在環(huán)境中的殘留［6］和個(gè)別漁民的違規(guī)使用對(duì)漁業(yè)產(chǎn)品的食品安全性造成一定的威脅。

關(guān)于PCP及其鈉鹽的測(cè)定方法主要有分光光度法［7］、毛細(xì)管區(qū)帶電泳法［8］、免疫學(xué)方法［9－10］、氣相色譜 法［1，11－20］、氣 相 色 譜－質(zhì) 譜 法［21－25］、液 相 色 譜法［26］及 液 相 色 譜－質(zhì) 譜 法［27－28］，主 要 涉 及 水 質(zhì)、土壤、木材和皮革等。目前水產(chǎn)品中五氯苯酚及其鈉鹽的主要測(cè)定方法為氣相色譜法，在實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)水產(chǎn)品基質(zhì)復(fù)雜，對(duì)目標(biāo)峰有干擾，同時(shí)前處理方法均采用碳酸鉀溶液反萃取凈化，因兩相性質(zhì)差異大，如河蟹等高脂、高蛋白的樣品在兩相之間會(huì)形成嚴(yán)重的乳化，造成回收率低，定量不準(zhǔn)確。本工作通過(guò)固相萃取前處理方法和負(fù)化學(xué)離子源下二級(jí)質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)的研究，建立了水產(chǎn)品中五氯苯酚（PCP）及其鈉鹽殘留量的固相萃?。瓪庀嗌V－串聯(lián)質(zhì)譜法，以13C6－PCP作為內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行定量。

1 試驗(yàn)部分

1．1 儀器與試劑

Thermo Fisher TSQ－45000Quantun型氣相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜儀；12通道固相萃取裝置；Waters Oasis HLB固相萃取小柱（60mg／3mL）；AE 200型電子天平，感量0．000 1g；JY 5002型電子天平，感量0．01g；AllegraTM21R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)；XW－80A微型渦旋混合儀；DK－8D型數(shù)顯恒溫水浴鍋。

PCP及13C6－PCP標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：稱取 PCP標(biāo)準(zhǔn)品（純度99．0%）、13C6－PCP標(biāo)準(zhǔn)品（純度99．0%）各0．010 0g，分別用0．1mol·L－1碳酸鉀溶液溶解并定容于100mL容量瓶中，配制成100μg·L－1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，于4℃冰箱中保存。

正己烷、環(huán)己烷為色譜純；乙酸酐、硫酸、碳酸鉀、無(wú)水硫酸鈉均為分析純。

1．2 儀器工作條件

1）色譜條件 TR－5MS色譜柱（30m×0．25mm，0．25μm）；進(jìn)樣口溫度250 ℃；載氣為99．999%高純氦氣；流量1．0mL·min－1；進(jìn)樣量1μL；不分流進(jìn)樣。柱升溫程序：初始溫度140℃，保持2min；以10℃·min－1速率升溫至240℃，保持2min；再以35℃·min－1速率升溫至280℃，保持5min。

2）質(zhì)譜條件 負(fù)化學(xué)離子（NCI）源，離子源溫度150℃；選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)（SRM）模式；燈絲電流100μA；傳輸線溫度250℃；反應(yīng)氣為甲烷；五氯苯乙酸酯（PCP－OAc）母離子m／z 307．7，子離子 m／z 233．1，265．7，定量離子 m／z 265．7，碰 撞 能量8V；13C6－PCP－OAc母離子m／z313．8，子離子m／z 238．8，271．4，定量離子m／z271．4，碰撞能量8V。

1．3 試驗(yàn)方法

1．3．1 樣品制備

選用河蟹、鱈魚為樣品，河蟹去殼去鰓取可食部分，魚取魚皮與肌肉部分，用高速萬(wàn)能試樣粉碎機(jī)打成勻漿，于－20℃冰箱中冷凍貯存。

1．3．2 樣品前處理

測(cè)定前將樣品室溫解凍，稱取混合均勻的樣品1．000 0g于50mL具塞離心管中，加入1 000μg·L－1的 內(nèi) 標(biāo)13C6－PCP 50μL（添 加 質(zhì) 量 分 數(shù) 為50．0μg·kg－1），加入硫酸（1＋1）溶液8mL，渦旋混勻，于80℃水浴加熱30min，冷卻至室溫后，加入正己烷10mL，渦旋2min，以8 000r·min－1轉(zhuǎn)速離心10min，重復(fù)加正己烷10mL提取1次，合并正己烷。使用HLB固相萃取小柱凈化，依次用乙酸乙酯3mL、乙酸乙酯－正己烷（1＋19）混合液3mL活化小柱，轉(zhuǎn)移樣品提取液至HLB固相萃取小柱中，待上樣液流出后，用乙酸乙酯－正己烷（1＋19）混合液3mL淋洗，甲醇3mL洗脫，接收洗脫液于15mL玻璃管中，于40℃下氮?dú)獯蹈桑?．1mol·L－1碳酸鉀溶液5mL溶解。將待衍生溶液于40～50℃水浴中加熱10min，加入乙酸酐0．2mL，取出渦旋3min并不斷放氣，加正己烷2．5mL萃取，萃取液置于5mL容量瓶中，再加正己烷2．0mL重復(fù)萃取1次，合并萃取液，定容至5mL，加入少量無(wú)水硫酸鈉脫水，溶液移入進(jìn)樣瓶，按儀器工作條件測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2．1 色譜行為

PCP 的 衍生物 PCP－OAc和13C6－PCP 的衍生物13C6－PCP－OAc的總離子流色譜圖見圖1。

2．2 固相萃取柱的選擇與凈化方法的建立

圖1 PCP－OAc和13C6－PCP－OAc的總離子流色譜圖Fig．1 TIC chromatograms of PCP－OAc and 13C6－PCP－OAc

正己烷極性相對(duì)較小，提取出的脂類與未沉淀的蛋白相對(duì)較多，采用碳酸鉀溶液萃取凈化時(shí)，兩相性質(zhì)差異大，在處理河蟹等高脂、高蛋白的樣品時(shí)會(huì)形成嚴(yán)重的乳化［1，11－14］，從底部分層操作困難，造成回收率低，定量不準(zhǔn)確。試驗(yàn)比較了中性氧化鋁、弗羅里硅和HLB等3種小柱的凈化效果。結(jié)果表明：中性氧化鋁小柱、弗羅里硅小柱不能完全負(fù)載所有藥物，對(duì)于高脂樣品除脂肪效果不理想，試驗(yàn)選擇采用HLB固相萃取小柱。

試驗(yàn)進(jìn)一步比較了不同淋洗液、洗脫液體積對(duì)PCP回收率的影響，操作步驟為：空白河蟹樣品（1．000 0g）在硫酸（1＋1）溶液8mL中于80℃水浴加熱30min，用正己烷10mL提取2次，合并提取液；在提取液中加入標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，使樣品中PCP質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為5．0，10．0，20．0μg·kg－1；依次用乙酸乙酯3mL，乙酸乙酯－正己烷（1＋19）混合液或乙酸乙酯－正己烷（1＋9）混合液3mL活化小柱，移取提取液至小柱，用乙酸乙酯－正己烷（1＋19）（淋洗液1）或乙酸乙酯－正己烷（1＋9）混合液（淋洗液2）3mL淋洗，用甲醇洗脫，分2段收集洗脫液，每段收集流出液3mL。每個(gè)階段平行測(cè)定6次，采用文獻(xiàn)［1］報(bào)道的氣相色譜外標(biāo)法定量，結(jié)果見表1。

表1 固相萃取小柱淋洗與洗脫條件比較（n＝6）Tab．1 Comparison of leaching and elution conditions of solid phase extraction column（n＝6）

由表1可知：對(duì)于1．000 0g空白河蟹樣品，試驗(yàn)選用淋洗液1，即乙酸乙酯－正己烷（1＋19）混合液3mL淋洗，甲醇3mL洗脫，效果較好。

2．3 質(zhì)譜條件的選擇

試驗(yàn)分別比較了電子轟擊離子（EI）源和NCI源下PCP的響應(yīng)值，結(jié)果表明：NCI源下PCP的衍生物PCP－OAc的響應(yīng)值比EI源下的響應(yīng)值高數(shù)10倍，且抗干擾能力強(qiáng)，試驗(yàn)選擇采用NCI源對(duì)PCP進(jìn)行測(cè)定。

將200．0μg·L－1PCP標(biāo)準(zhǔn)溶液和13C6－PCP標(biāo)準(zhǔn)溶液在色譜條件下，用全掃描方式進(jìn)行分析，根據(jù)PCP離子和13C6－PCP離子強(qiáng)度大小，選定檢測(cè)母離子；比較離子源溫度150，180，200，250℃下母離子強(qiáng)度，選定離子源溫度；設(shè)置碰撞能量水平（3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33V）對(duì)選定的母離子進(jìn)行轟擊，并以子離子全掃描模式監(jiān)測(cè)，初步確定碰撞能量水平范圍，再設(shè)置碰撞能量水平（6，7，8，9V）對(duì)選定的母離子進(jìn)行轟擊，選擇2個(gè)響應(yīng)值高、質(zhì)荷比大的特征子離子碎片，其中響應(yīng)值高的子離子確定為SRM模式下的定量離子，另一個(gè)為定性離子。結(jié)果表明：離子源溫度150℃下母離子響應(yīng)最強(qiáng)，試驗(yàn)選定檢測(cè)離子源溫度為150 ℃；PCP－OAc母離子m／z307．7，子離子m／z233．1，265．7，定量離子m／z265．7，碰撞能量為8V；13C6－PCP－OAc母離子m／z313．8，子離子m／z238．8，271．4，定量離子m／z271．4，碰撞能量為8V。

2．4 工作曲線與檢出限

將PCP與13C6－PCP標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液用0．1mol·L－1碳酸鉀溶液稀釋，配制成PCP的質(zhì)量濃度分別為0．20，1．00，2．00，4．00，10．0，20．0μg·L－1，13C6－PCP的質(zhì)量濃度為10．0μg·L－1的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液系列，按照試驗(yàn)方法衍生后進(jìn)行測(cè)定，以PCP的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，PCP與內(nèi)標(biāo)13C6－PCP的定量離子峰的面積比為縱坐標(biāo)繪制工作曲線。結(jié)果表明：PCP的質(zhì)量濃度在0．20～20．0μg·L－1內(nèi)呈線性，線性回歸方程為y＝0．095x＋0．013，相關(guān)系數(shù)為0．999 5。

當(dāng)空白河蟹、鱈魚樣品中添加水平為1．00μg·kg－1時(shí)，各樣品檢測(cè)離子中響應(yīng)最低離子的信噪比均不小于3，由此得方法的檢出限（3S／N）為1．0μg·kg－1。

2．5 精密度和回收試驗(yàn)

在1．000 0g空白河蟹、鱈魚樣品中分別添加10．0μg·L－1PCP標(biāo)準(zhǔn)溶液100μL，100μg·L－1PCP標(biāo)準(zhǔn)溶液50，100μL和500μg·L－1PCP標(biāo)準(zhǔn)溶液100μL（添加水平分別相當(dāng)于PCP的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1．0，5．0，10．0，50．0μg·kg－1），在每個(gè)樣品中添 加 1 000μg·L－1的13C6－PCP 標(biāo) 準(zhǔn) 溶 液50μL（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50．0μg·kg－1），每個(gè)添加水平平行測(cè)定6次，內(nèi)標(biāo)法定量，計(jì)算PCP的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），其結(jié)果見表2。

表2 精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab．2 Results of tests for precision and recovery（n＝6）

由表2可知：內(nèi)標(biāo)法測(cè)定PCP的加標(biāo)回收率為78．0%～104%，RSD在2．0%～12%之間，說(shuō)明方法具有較好的重復(fù)性，內(nèi)標(biāo)法定量也進(jìn)一步提高了測(cè)定的穩(wěn)定性，解決了外標(biāo)法對(duì)前處理操作嚴(yán)格的問(wèn)題。

2．6 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的穩(wěn)定性

將100mg·L－1五氯苯酚標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液、100μg·L－1五氯苯酚標(biāo)準(zhǔn)溶液避光于4℃冷藏保存3個(gè)月，1個(gè)月后稀釋至10μg·L－1，使用文獻(xiàn)［1］的方法測(cè)定其峰面積，與當(dāng)天配制的相同質(zhì)量濃度溶液的峰面積進(jìn)行比較，以評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)溶液的穩(wěn)定性。經(jīng)Grubbs檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)具有一致性，無(wú)離群值。結(jié)果表明：100mg·L－1五氯苯酚標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液至少可以在4℃避光存放3個(gè)月，100μg·L－1五氯苯酚標(biāo)準(zhǔn)溶液至少可以在4℃避光存放1個(gè)月。

本工作通過(guò)對(duì)固相萃取前處理方法和二級(jí)質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)的研究，建立了測(cè)定水產(chǎn)品中五氯苯酚（PCP）及其鈉鹽殘留量的固相萃取－氣相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法。前處理方法使用HLB固相萃取柱凈化，解決了前處理過(guò)程液液萃取凈化方法的乳化現(xiàn)象而造成回收率低的問(wèn)題。該方法使用NCI源，通過(guò)13C6－PCP作為內(nèi)標(biāo)物定量，SRM模式進(jìn)行質(zhì)譜測(cè)定，實(shí)現(xiàn)水產(chǎn)品中五氯苯酚及其鈉鹽殘留量的定量與定性。檢出限、線性關(guān)系、回收率和重現(xiàn)性等方法學(xué)指標(biāo)均能滿足水產(chǎn)樣品中五氯苯酚及其鈉鹽殘留量的測(cè)定。

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