許楊潔，曹小吉，2＊

（1．浙江工業(yè)大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院，杭州310014； 2．浙江工業(yè)大學(xué) 分析測(cè)試中心，杭州310014）

酰胺鍵是構(gòu)成多肽和蛋白質(zhì)的基本骨架結(jié)構(gòu)［1］。在25%的藥物分子中都含有酰胺鍵片段。酰胺－亞胺醇互變類似于酮－烯醇互變，區(qū)別在于其C＝N雙鍵代替了烯醇式中的C＝C雙鍵。盡管酰胺的亞胺醇構(gòu)型在通常情況下是不穩(wěn)定的，但是其作為一類特殊的反應(yīng)中間體日益得到人們的關(guān)注。文獻(xiàn)［2］報(bào)道采用量子化學(xué)理論計(jì)算證實(shí)了天冬氨酸殘基的C－端肽鍵在兩個(gè)水分子輔助下可以發(fā)生亞胺醇異構(gòu)化，進(jìn)而觸發(fā)了天冬氨酸殘基向其β構(gòu)型轉(zhuǎn)化。文獻(xiàn)［3］報(bào)道采用紅外多光子解離譜研究了二價(jià)金屬離子誘導(dǎo)的酰胺－亞胺醇異構(gòu)化反應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在氣相中金屬離子可與亞胺醇上的氮原子形成穩(wěn)定的配位鍵。此外，研究還發(fā)現(xiàn)O－（3，5－二硝基苯甲酰）苯甲羥肟酸酯與二甲亞砜共結(jié)晶，其酰胺鍵以亞胺醇式存在［4］。

N－吡啶基苯甲酰胺類化合物具有抗菌、抗腫瘤等生物活性［5］。截至目前，其質(zhì)子化離子碰撞誘導(dǎo)解離產(chǎn)生取代2－羥基吡啶陽(yáng)離子的反應(yīng)機(jī)理研究還未見(jiàn)報(bào)道。碰撞誘導(dǎo)解離（CID）的原理是讓具有一定動(dòng)能的母離子與質(zhì)譜儀中的惰性氣體發(fā)生碰撞，動(dòng)能轉(zhuǎn)化為內(nèi)能，當(dāng)內(nèi)能超過(guò)了母離子的解離能時(shí)，會(huì)發(fā)生碎裂。高能碰撞解離（HCD）技術(shù)是一種新型的質(zhì)譜裂解技術(shù)，與CID技術(shù)相比，HCD技術(shù)具有穩(wěn)定的高能量裂解方式，可產(chǎn)生更多的碎片離子以及無(wú)低質(zhì)量端歧視效應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，與靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)量分析器結(jié)合使用還可以獲得高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)，確定碎片離子的元素組成［6－7］。

本工作采用高分辨的電噴霧電離－高能碰撞解離質(zhì)譜（ESI－HCD－MS／MS）技術(shù)，結(jié)合同位素標(biāo)記試驗(yàn)和量子化學(xué)密度泛函理論計(jì)算，系統(tǒng)探討了酰胺－亞胺醇互變誘導(dǎo)的分子內(nèi)羥基遷移解離產(chǎn)生取代2－羥基吡啶陽(yáng)離子的反應(yīng)機(jī)理。

1 試驗(yàn)部分

1．1 儀器與試劑

Thermo Fisher LCQ Deca XP MAX離子阱質(zhì)譜儀，配電噴霧電離源（ESI）及Xcalibur 2．1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；Thermo Fisher Q Exactive組合型四極桿Orbitrap質(zhì)譜儀（分辨率大于7 000，F(xiàn)WHM），配H－ESI II源及 Xcalibur 2．2數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。

N－（吡啶－2－基）苯甲酰胺、N－（6－溴吡 啶－2－基）苯甲酰胺、N－（6－氯吡啶－2－基）苯甲酰胺、4－甲基－N－（吡啶－2－基）苯甲酰胺、4－溴－N－（吡啶－2－基）苯甲酰胺、4－甲氧基－N－（吡啶－2－基）苯甲酰胺、4－甲基－N－（6－甲基吡啶－2－基）苯甲酰胺等7個(gè)N－（吡啶－2－基）苯甲酰胺類化合物純度均大于95%。

甲醇為色譜純。

1．2 儀器工作條件

1）LCQ Deca XP MAX離子阱質(zhì)譜條件 電噴霧正離子（ESI＋）掃描模式，掃描范圍m／z50～800，流量5μL·min－1；霧化氣為氮?dú)?，流?L·min－1；噴霧電壓4．0kV；金屬毛細(xì)管溫度300℃；碰撞氣為氦氣，碰撞能量為32%。

2）Q Exactive組合型四極桿Orbitrap質(zhì)譜條件 正離子模式，流量為3μL·min－1；霧化氣為氮?dú)?，流?L·min－1；噴霧電壓3．0kV；金屬毛細(xì)管溫度240℃；碰撞氣為氮?dú)?，碰撞能量?5%；采用標(biāo) 準(zhǔn) 校 正 液 （caffenine，MRFA and Ultramark 1621）對(duì)質(zhì)量軸進(jìn)行校正。

1．3 試驗(yàn)方法

1．3．1 樣品制備

稱取樣品2～3μg溶于1mL甲醇中，過(guò)0．45μm濾膜，用注射泵輸送至質(zhì)譜儀分析。

1．3．2 計(jì)算條件

采用Gaussian 03軟件，密度泛函理論（DFT），在B3LYP／6－31G（d）水平上對(duì)分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行模擬和優(yōu)化。在構(gòu)型優(yōu)化過(guò)程中，忽略對(duì)稱性限制。對(duì)所有的優(yōu)化結(jié)構(gòu)進(jìn)行振動(dòng)頻率分析，其中過(guò)渡態(tài)有且僅有一個(gè)虛頻。計(jì)算所得的能量為電子能和內(nèi)能之和。過(guò)渡態(tài)結(jié)構(gòu)優(yōu)化完成后通過(guò)反應(yīng)內(nèi)稟坐標(biāo)（IRC）進(jìn)行驗(yàn)證。

2 結(jié)果與討論

2．1 N－（吡啶－2－基）苯甲酰胺的ESI－MS／MS分析

7個(gè)N－（吡啶－2－基）苯甲酰胺類化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式見(jiàn)表1。

表1 N－吡啶基苯甲酰胺類化合物的結(jié)構(gòu)式Tab．1 Structural formulae of the N－pyridinyl benzamides

在ESI＋下，表1中的化合物均產(chǎn)生質(zhì)子化離子［M＋H］＋，其質(zhì)子化離子碰撞誘導(dǎo)解離（CID－MS／MS）裂解所產(chǎn)生的主要碎片離子見(jiàn)表2。

由表2可知：這類化合物的質(zhì)子化離子碰撞誘導(dǎo)解離，裂解模式相同。

化合物1～7的質(zhì)子化離子及碎片離子的高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。

由表3可知：高分辨ESI－HCD－MS／MS得到的碎片離子的精確質(zhì)量數(shù)的誤差均小于4×10－6，確證主要生成了取代2－羥基吡啶陽(yáng)離子a、取代苯甲酰陽(yáng)離子b以及中性丟失一分子水產(chǎn)生的碎片離子c，它們的豐度隨著取代基的變化而變化。

表2 N－吡啶基苯甲酰胺類化合物質(zhì)子化離子CID－MS／MS產(chǎn)生的主要碎片離子數(shù)據(jù)Tab．2 CID－MS／MS data of major fragement ions from protonated N－pyridinyl benzamides

表3 化合物1～7的高分辨HCD－MS／MS數(shù)據(jù)Tab．3 High－resolution HCD－MS／MS data of compounds 1－7

2．2 酰胺－亞胺醇互變誘導(dǎo)的1，3－OH－遷移裂解反應(yīng)

試驗(yàn)以化合物7為例探討碎片離子a的具體形成機(jī)理。

化合物7的高能碰撞解離二級(jí)質(zhì)譜（HCD－MS／MS）圖見(jiàn)圖1（a），化合物7的［M＋H］＋離子（m／z227．117 9）碰撞解離產(chǎn)生6－甲基－2－羥基－吡啶陽(yáng)離子am／z110．060 4（元素組成C6H8NO＋，理論m／z110．060 0，相對(duì)誤差3．63×10－6）；活潑氫完全氘代的化合物7的［M－d1＋D］＋離子（m／z229．2）碰撞誘導(dǎo)解離則產(chǎn)生活潑氫完全氘代的a－d2碎片離子（m／z112．2）見(jiàn)圖1（b），表明酰胺上的活潑氫參與了6－甲基－2－羥基吡啶陽(yáng)離子的生成；為了推導(dǎo)碎片離子a中氧原子的來(lái)源，試驗(yàn)還研究分析了18O標(biāo)記的化合物1的質(zhì)子化離子（m／z201．090 8）的HCD－MS／MS圖，圖1（c）中m／z98．048 5的信號(hào)（元素組成C5H6N18O＋，相對(duì)誤差為－1．04×10－6）為18O標(biāo)記的2－羥基吡啶陽(yáng)離子，說(shuō)明2－羥基吡啶陽(yáng)離子中的氧原子來(lái)自于苯甲酰基上的?；酢Ｒ陨蠑?shù)據(jù)表明：化合物7的質(zhì)子化離子必須通過(guò)分子內(nèi)的骨架重排反應(yīng)，將酰胺鍵上的氧原子和活潑氫原子遷移到吡啶環(huán)上才能裂解產(chǎn)生碎片離子a。

圖1 ESI－MS／MS質(zhì)譜圖Fig．1 ESI－MS／MS spectra

酰胺鍵的酰胺－亞胺醇互變與酮的酮－烯醇互變類似，其亞胺醇式比酰胺式不穩(wěn)定。試驗(yàn)和量子化學(xué)理論計(jì)算已經(jīng)證實(shí)在氣相肽鍵的互變異構(gòu)化過(guò)程中存在亞胺醇構(gòu)型［8－9］。由量子化學(xué)密度泛函理論計(jì)算可知，當(dāng)外加質(zhì)子加合到化合物7的N1原子上時(shí)，吡啶環(huán)上的N1原子和酰胺鍵上的氧原子通過(guò)氫鍵螯合，產(chǎn)生質(zhì)子化離子MH1，其能量比加合在C2、N3、C4、C5原子上產(chǎn)生的質(zhì)子化離子 MH2、MH3、MH4、MH5的能量分別低89．58，139．96，208．22，203．82kJ·mol－1，由此可以確定吡啶環(huán)上的N1原子是該化合物熱力學(xué)上最穩(wěn)定的質(zhì)子化位點(diǎn)。MH1（0kJ·mol－1）經(jīng)碰撞活化，外加質(zhì)子誘導(dǎo)，發(fā)生酰胺－亞胺醇異構(gòu)化反應(yīng)，產(chǎn)生亞胺醇式中間體 M（56．21kJ·mol－1），亞胺醇上的羥基經(jīng)過(guò)過(guò)渡態(tài) TS（377．85kJ·mol－1），發(fā)生1，3－OH－遷移重排到吡啶環(huán)的C2位上，正電荷誘導(dǎo)C2－N3鍵異裂，中性丟失一分子4－甲基苯腈（e）產(chǎn)生6－甲基－2－羥基吡啶陽(yáng)離子（a），推測(cè)的具體裂解途徑見(jiàn)圖2，勢(shì)能圖見(jiàn)圖3。

圖2 推導(dǎo)的化合物7質(zhì)子化離子產(chǎn)生離子a的裂解機(jī)理Fig．2 Proposed fragmentation mechanism of protonated compound 7to produce ion a

圖3 化合物7生成離子a的反應(yīng)勢(shì)能圖Fig．3 Potential energy diagram for fragmentation of compound 7to produce ion a

為了更準(zhǔn)確地考察整個(gè)裂解反應(yīng)的路徑，試驗(yàn)對(duì)化合物1～7進(jìn)行量子化學(xué)密度泛函理論計(jì)算，數(shù)據(jù)見(jiàn)表4。

表4 化合物1～7的各階段相對(duì)勢(shì)能量Tab．4 Relative potential energies at various stages of compounds 1－7 kJ·mol－1

此外，試驗(yàn)還研究了取代基對(duì)該裂解反應(yīng)的影響。結(jié)果表明：當(dāng)吡啶環(huán)上有吸電子取代基或者苯環(huán)上有推電子取代基時(shí)，不利于該裂解反應(yīng)發(fā)生，產(chǎn)物離子a的豐度減小。

本工作采用高分辨電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，結(jié)合同位素標(biāo)記試驗(yàn)以及量子化學(xué)密度泛函理論計(jì)算，探討了N－（吡啶－2－基）苯甲酰胺類化合物的質(zhì)子化離子解離產(chǎn)生取代2－羥基吡啶陽(yáng)離子的反應(yīng)機(jī)理。研究發(fā)現(xiàn)，外加質(zhì)子首先加合在吡啶環(huán)的氮原子上，隨后誘導(dǎo)酰胺鍵發(fā)生酰胺－亞胺醇異構(gòu)化轉(zhuǎn)變?yōu)閬啺反际?，接著發(fā)生分子內(nèi)的1，3－OH－重排，正電荷誘導(dǎo)異裂產(chǎn)生取代2－羥基吡啶陽(yáng)離子。吡啶環(huán)上有吸電子取代基或苯環(huán)上有推電子取代基不利于該裂解反應(yīng)的發(fā)生。本工作的研究結(jié)果對(duì)多肽以及蛋白質(zhì)中肽鍵的酰胺－亞胺醇互變異構(gòu)化機(jī)理的系統(tǒng)深入研究具有一定的理論指導(dǎo)意義。

感謝萬(wàn)結(jié)平副教授提供研究樣品！

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