吉 喆，陳 文，王 鉺，楊 捷

（成都理工大學(xué) 材料與化學(xué)化工學(xué)院，成都610059）

三聚氰胺［C3N3（NH2）3］是一種化工原料。因其含氮量高達(dá)66.7%，所以很多不法分子將其加入牛奶或者蛋白飼料中，造成蛋白質(zhì)含量高的假象。由于其具有毒性，被人或動(dòng)物食用后會(huì)導(dǎo)致結(jié)石及腎衰竭［1］。2012年，聯(lián)合國國際食品法典委員會(huì)設(shè)定了牛奶中三聚氰胺含量新標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)定每千克液態(tài)牛奶中三聚氰胺質(zhì)量最大允許值為0.15mg。因此準(zhǔn)確快速地測定食品中三聚氰胺的含量顯得尤為重要。

目前牛奶及蛋白飼料中三聚氰胺的測定方法主要有氣相色譜－質(zhì)譜法（GC－MS）［2－3］、高效液相色譜法（HPLC）［4－6］和 高 效 液 相 色 譜－質(zhì) 譜 法 （HPLCMS）［7－8］等。電 化 學(xué) 檢 測 三 聚 氰 胺 多 見 傳 感 器［9－11］或電化學(xué)發(fā)光［12－13］。文獻(xiàn)［14］使用單掃描極譜法在NaOH－KCl底液中直接測定三聚氰胺，檢出限為1.73×10－3mg·L－1，未進(jìn)行共存物質(zhì)的影響、干擾的消除和樣品的前處理方法等研究。文獻(xiàn)［15］也采用極譜法直接分析經(jīng)NaCl處理過的牛奶樣品，檢出限為0.1mg·L－1，也未做共存物質(zhì)的影響研究，且樣品分析的回收率較低。

采用極譜法間接測定三聚氰胺的報(bào)道鮮見，本工作提出一種利用三聚氰胺對熒光素還原峰的抑制作用，間接測定三聚氰胺的極譜法，研究初步討論檢測三聚氰胺的極譜機(jī)理，對三聚氰胺的極譜檢測具有一定的理論意義。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

JP－3型示波極譜儀，配三電極體系：滴汞電極為工作電極，飽和甘汞電極（SCE）為參比電極，鉑電極為輔助電極。UV－2700型可見分光光度計(jì)；pHS－25型pH計(jì)；BS－2245型電子分析天平。

三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：1.0×10－3mol·L－1，稱取三聚氰胺0.012 6g，用水溶解并定容至100mL容量瓶中，在低溫密封和避光條件下保存。使用時(shí)用水稀釋至所需濃度。

熒光素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：1.0×10－3mol·L－1，稱取熒光素0.033 2g，滴加數(shù)滴0.2mol·L－1NaOH溶液以溶解，用水溶解并定容至100mL容量瓶中，在低溫密封和避光條件下保存。使用時(shí)用水稀釋至所需濃度。

磷酸鹽緩沖溶液（PBS）、乙酸－乙酸鈉緩沖溶液、檸檬酸－檸檬酸鈉緩沖溶液、B－R緩沖溶液均按所需濃度配制。

熒光素為色譜純，其他試劑均為分析純，試驗(yàn)用水為一次蒸餾水。

1.2 儀器工作條件

起始電位－0.4V（vs.SCE），掃描速率0.4V·s－1，靜止時(shí)間5s，掃描次數(shù)為3，量程0～2.5×103nA，恒溫測定。

1.3 試驗(yàn)方法

移取牛奶樣品0.20mL于4mL離心管中，加入乙腈（25＋75）溶液1.8mL，超聲分散10min，沸水浴加熱10min，以10 000r·min－1轉(zhuǎn)速離心8min，取上清液通過0.22μm有機(jī)濾膜，取濾液蒸發(fā)去除乙腈至溶液澄清，得樣品溶液。

依次將0.2mol·L－1B－R 緩沖溶液7.5mL（用0.2mol·L－1NaOH 溶液配制，pH 6.5）、1.0×10－4mol·L－1熒光素標(biāo)準(zhǔn)溶液2.5mL、一系列三聚氰胺的標(biāo)準(zhǔn)溶液或適量樣品溶液加入25mL比色管中，用水稀釋至刻度，搖勻，于45℃恒溫水浴中加熱15min，取適量于10mL小燒杯中，在儀器工作條件下記錄二階導(dǎo)數(shù)波峰的峰電位（Ep）與峰電流（Ip），由ΔIp＝Ip－I0計(jì)算加入三聚氰胺前后峰電流的變化（I0為未加三聚氰胺時(shí)的峰電流）。

2 結(jié)果與討論

2.1 極譜行為

分別對熒光素標(biāo)準(zhǔn)溶液、B－R緩沖溶液、熒光素標(biāo)準(zhǔn)溶液＋B－R緩沖溶液、B－R緩沖溶液＋熒光素標(biāo)準(zhǔn)溶液＋三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行極譜掃描，結(jié)果見圖1。

圖1 二級導(dǎo)數(shù)極譜圖Fig.1 Second－order derivate polarograms

由圖1可知：熒光素標(biāo)準(zhǔn)溶液、B－R緩沖溶液各自在掃描范圍內(nèi)無峰；當(dāng)上述兩種溶液混合后，在－0.86V處有一個(gè)還原峰，說明熒光素在該緩沖體系的酸度下具有還原性；加入三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液后在－0.86V處的還原峰降低。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)隨著三聚氰胺濃度的增加，峰電流逐漸減小，表現(xiàn)出與三聚氰胺濃度的顯著相關(guān)性，推斷三聚氰胺加入后與熒光素結(jié)合形成了非電化學(xué)活性的物質(zhì)，降低了溶液中游離熒光素的濃度，從而使其峰電流下降。

2.2 試驗(yàn)條件的選擇

2.2.1 緩沖溶液及其酸度和用量

試驗(yàn)選擇在三聚氰胺濃度為1.0×10－5mol·L－1（高）、1.0×10－6mol·L－1（低）時(shí)考察了緩沖溶液酸度對峰電流的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 緩沖溶液酸度對峰電流的影響Fig.2 Effect of acidity of buffer solution on peak current

由圖2可知：pH 6.5是最佳的酸度條件。試驗(yàn)進(jìn)一步研究了最佳酸度下不同的緩沖體系包括PBS緩沖溶液、乙酸－乙酸鈉緩沖溶液、檸檬酸－檸檬酸鈉緩沖溶液、B－R緩沖溶液中熒光素的極譜行為，結(jié)果表明：在0.2mol·L－1B－R緩沖溶液中極譜波峰電流最大最穩(wěn)定，且無雜峰出現(xiàn)。

分別配制 1.0×10－5mol·L－1（高）、1.0×10－6mol·L－1（低）的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照試驗(yàn)方法對B－R緩沖溶液的用量進(jìn)行了選擇，結(jié)果見圖3。結(jié)果表明緩沖溶液的最佳用量為7.5mL。

圖3 B－R緩沖溶液用量對峰電流的影響Fig.3 Effect of B－R buffer solution volume on peak current

綜上所述，最佳底液條件為25mL體積中加入pH 6.5的0.2mol·L－1B－R緩沖溶液7.5mL。

2.2.2 熒光素用量

試驗(yàn)考察了電極反應(yīng)物熒光素的用量對峰電流的影響，結(jié)果見圖4。

由圖4可知：當(dāng)熒光素加入量為1.0×10－5mol·L－1時(shí)，ΔIp較大。因此，試驗(yàn)選擇熒光素濃度為1.0×10－5mol·L－1。

2.2.3 反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間

按照試驗(yàn)方法，在最佳底液的條件下分別配制1.0×10－5mol·L－1（高）、1.0×10－6mol·L－1（低）的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，考察了反應(yīng)溫度（25～50℃）以反應(yīng)時(shí)間（5～30min）對峰電流的影響，結(jié)果見圖5和圖6。

圖5 反應(yīng)溫度對峰電流的影響Fig.5 Effect of reaction temperature on peak current

由圖5和圖6可知：在45℃下反應(yīng)15min反應(yīng)可以達(dá)到平衡，并有較高的峰電流。因此，試驗(yàn)選擇45℃水浴反應(yīng)15min后測定。

2.3 儀器工作條件的選擇

按照試驗(yàn)方法，在最佳底液的條件下分別配制1.0×10－5mol·L－1（高）、1.0×10－6mol·L－1（低）濃度的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別考察了汞柱高度、掃描速率、起始電位、靜止時(shí)間對峰電流的影響。在30～50cm內(nèi)改變汞柱高度，在0.2～0.8V·s－1內(nèi)改變電極掃描速率，在－0.2～－0.7V內(nèi)改變起始電位，在2～8s內(nèi)改變滴汞靜止時(shí)間，選擇出最佳的儀器工作條件為：汞柱高度45cm；掃描速率0.4V·s－1；起始電位－0.4V；靜止時(shí)間5s。

圖4 熒光素濃度對峰電流的影響Fig.4 Effect of fluorescein concentration on peak current

2.4 共存物質(zhì)的影響

在最佳條件下考察一些常見的共存離子對測定1.0×10－6mol·L－1三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的影響，結(jié)果見表1。

表1 干擾試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of interference test

由表1可知：乳制品中常見的K＋、Na＋、Mg2＋、Cl－對三聚氰胺的測定基本無干擾；Ca2＋在低濃度下干擾很小，高濃度時(shí)在測定體系中會(huì)產(chǎn)生沉淀，系鈣離子與緩沖溶液反應(yīng)生成磷酸鹽沉淀所致，但并未和三聚氰胺相互作用，故取上清液進(jìn)行分析，結(jié)果不受影響。三聚氰胺的副產(chǎn)物三聚氰酸在100倍共存量下不產(chǎn)生干擾。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

配制一系列三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照試驗(yàn)方法測定其峰電流，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。三聚氰胺濃度在1.0×10－7～1.0×10－5mol·L－1與峰電流呈線性關(guān)系，線性回歸方程為 ΔIp（×102nA）＝－0.029 5 c＋1.161，相關(guān)系數(shù)為0.996 8。

按照試驗(yàn)方法配制不加三聚氰胺的熒光素溶液，并對溶液進(jìn)行10次連續(xù)測定，以3s／k（s為10次測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，k為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率）計(jì)算方法的檢出限為5.1×10－8mol·L－1。

2.6 精密度與穩(wěn)定性試驗(yàn)

在最佳底液的條件下分別配制1.0×10－5mol·L－1（高）、1.0×10－6mol·L－1（低）的兩組（各10個(gè)）三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，在相同條件下進(jìn)行測定，測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為0.83%，0.57%。對兩組三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液考察發(fā)現(xiàn)，在12h內(nèi)都可以穩(wěn)定測定三聚氰胺溶液。

2.7 樣品分析

按試驗(yàn)方法對市售牛奶樣品進(jìn)行分析，樣品中均未檢出三聚氰胺，并進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表2 回收試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of test for recovery

由表2可知：加標(biāo)回收率在91.2%～99.1%之間，說明該方法測定乳制品樣品中的三聚氰胺有較好的準(zhǔn)確度。

3 極譜機(jī)理分析

3.1 反應(yīng)的光譜法表征

在1.0×10－5mol·L－1三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液中加入熒光素，分別在加熱和不加熱的條件下、在可見光波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，同時(shí)在相同條件下對熒光素－B－R溶液也進(jìn)行掃描，結(jié)果見圖7。

圖7 可見光吸收光譜圖Fig.7 Visible light absorption spectra

由圖7可知：在490nm處熒光素－B－R溶液有一特征吸收峰（曲線1）；加入三聚氰胺后吸收峰有明顯降低（曲線2），說明熒光素的濃度降低，這與極譜試驗(yàn)結(jié)果相符；且反應(yīng)時(shí)進(jìn)行加熱的溶液，其吸光度有明顯的降低（曲線3），說明加熱可加快反應(yīng)速率，使得反應(yīng)更快達(dá)到平衡狀態(tài)。

3.2 反應(yīng)的電化學(xué)分析

按照試驗(yàn)方法對1.0×10－6mol·L－1三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行循環(huán)伏安法測試。正向掃描時(shí)有還原峰出現(xiàn)，峰電位與單向掃描極譜法出現(xiàn)還原峰的位置一致，而反向掃描時(shí)對應(yīng)的電位上并無氧化峰，說明該極譜波為不可逆吸附波。

在最佳儀器工作條件下對5.0×10－6mol·L－1三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液于0.1～0.8V·s－1內(nèi)進(jìn)行掃描，改變掃描速率，考察熒光素峰電流（Ip）及峰電位（Ep）隨掃描速率的變化關(guān)系。結(jié)果表明：峰電流與掃描速率（v）呈正比，線性回歸方程為Ip（×10－2nA）＝14.43 v（V·s－1）＋4.586，相關(guān)系數(shù)為0.992 0。說明該電極反應(yīng)受吸附控制。

Ep隨v的增大而負(fù)移，Ep與lnv呈線性關(guān)系，其線性回歸方程為Ep（V）＝－0.027 1lnv－0.857，相關(guān)系數(shù)為0.997 8。

當(dāng)反應(yīng)體系為受吸附控制的不可逆體系時(shí)，符合 Laviron′s公式［16］：

式中：E0為標(biāo)準(zhǔn)電極電位，V；R為熱力學(xué)常數(shù)，8.314J·mol－1·K－1；T 為熱力學(xué)溫度，K；α為電子轉(zhuǎn)移系數(shù)；n為電極反應(yīng)中電子轉(zhuǎn)移數(shù)；F為法拉第常數(shù)，96 485C·mol－1；ks為表面反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)速率常數(shù)；v為掃描速率，V·s－1。

Ep和lnν呈線性關(guān)系，進(jìn)一步說明熒光素在pH 6.5的B－R緩沖溶液中在滴汞電極上發(fā)生了由吸附控制的不可逆電極反應(yīng)。由Laviron′s公式計(jì)算得 αn＝0.995 2；E0＝ －0.796 4V；ks＝0.106 9s－1。若α＝0.5，則n約等于2，故電極過程中有2個(gè)電子參加反應(yīng)。

配制無三聚氰胺的熒光素溶液，在儀器工作條件下，于0.1～0.8V·s－1內(nèi)改變掃描速率，考察熒光素峰電流及峰電位隨掃描速率的變化關(guān)系。由Laviron′s 公 式 計(jì) 算 得 αn＝0.943 0；E0＝－0.794 4V；ks＝0.108 2s－1。若α＝0.5，則n約等于2，可推測電極過程中有2個(gè)電子參加反應(yīng)。

由此可見，加入三聚氰胺與否，體系的相關(guān)電化學(xué)參數(shù)基本相同，從而證明電極反應(yīng)物為熒光素。

本工作建立了一種簡易的間接測定乳制品中三聚氰胺的極譜法，線性范圍寬，檢出限低。并進(jìn)行了熒光素的電化學(xué)行為研究，證明其極譜波為不可逆還原波，電極反應(yīng)物是熒光素。方法用于乳制品中三聚氰胺的測定，結(jié)果滿足分析要求。

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