鄧光輝，羅珍連

（廣西民族大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院 廣西林產(chǎn)化學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧530006）

金釵石斛（Dendrobium nobile Lindl）為蘭科屬多年附生草本植物，其入藥始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，享有“仙草”之美譽(yù)，是名貴中藥材石斛的來(lái)源之一［1］。金釵石斛的主要有效成分有生物堿類(lèi)化合物、酚類(lèi)化合物、多糖等［2］，其中，生物堿類(lèi)成分是最早從石斛屬植物中分離得到的物質(zhì)［3］。石斛堿為金釵石斛的特征性成分，具有止痛、解熱、降低心率和血壓、減慢呼吸、解巴比妥毒等作用［4－5］，有較高的研究開(kāi)發(fā)價(jià)值。2010年版《中國(guó)藥典》以石斛堿含量作為金釵石斛的質(zhì)量控制指標(biāo)［6］。

石斛堿的測(cè)定方法有氣相色譜法［7－8］和高效液相色譜法［9－10］。與高效液相色譜法相比，毛細(xì)管電泳－電化學(xué)發(fā)光法（CE－ECL）是一種高效快速、樣品消耗少、成本低的分離檢測(cè)技術(shù)［11－12］。CE－ECL已經(jīng)成功應(yīng)用于生物堿研究［13－17］，但尚未見(jiàn)到 CEECL測(cè)定金釵石斛堿的報(bào)道。本工作對(duì)金釵石斛中具有藥理活性成分的石斛堿進(jìn)行提取，采用CEECL測(cè)定其含量。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

MPI－A型毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)，配未涂層石英毛細(xì)管（50μm×55cm）、直徑500μm鉑工作電極、Ag／AgCl參比電極和鉑輔助電極；PHS－3E型酸度計(jì)；KQ－100DB型數(shù)控超聲波清洗器；1810－B型自動(dòng)雙蒸餾器。

Ru（bpy）32＋溶液：5mmol·L－1，稱(chēng)取適量三聯(lián)吡啶氯化釕六水合物，用水溶解配制成20mmol·L－1溶液，再用70mmol·L－1磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH 8.10）稀釋配制成5mmol·L－1。

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：500mg·L－1，稱(chēng)取石斛堿對(duì)照品5.0mg置于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，搖勻，使用時(shí)用pH 8.10PBS進(jìn)行稀釋。

石斛堿標(biāo)準(zhǔn)品純度99%，三聯(lián)吡啶氯化釕六水合物、甲醇、乙醇為分析純，試驗(yàn)用水為二次蒸餾水，其他試劑均為分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

稱(chēng)取金釵石斛粉末1.000 0g置于100mL錐形瓶中，加入乙醇50mL，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲提取30min，冷卻，再稱(chēng)定質(zhì)量，用無(wú)水乙醇補(bǔ)足失重，濾液經(jīng)0.45μm乙酸纖維膜過(guò)濾備用。

依次 用 0.1mol·L－1NaOH 溶 液、水、10mmol·L－1PBS（pH 5.13）運(yùn)行緩沖溶液將石英毛細(xì)管沖洗10min，將工作電極依次用0.3，0.05μm Al2O3粉末拋光，用水沖洗，再用水超聲清洗干凈，吹干，將電極與毛細(xì)管安裝在檢測(cè)池上，用光學(xué)顯微鏡調(diào)節(jié)毛細(xì)管與工作電極之間的距離為（100±5）μm。

在檢測(cè)池中加入5mmol·L－1Ru（bpy溶液，測(cè)定時(shí)將毛細(xì)管進(jìn)樣端插入10mmol·L－1PBS（pH 5.13）中，待發(fā)光信號(hào)穩(wěn)定后，采用電動(dòng)進(jìn)樣，進(jìn)樣電壓為10kV，進(jìn)樣時(shí)間為10s，光電倍增管高壓為800V，檢測(cè)電位為1.17V，施加分離電壓為15kV進(jìn)行分離檢測(cè)。

所有溶液在進(jìn)入毛細(xì)管前經(jīng)0.45μm乙酸纖維素膜過(guò)濾，每2h換一次檢測(cè)池溶液，以保證試驗(yàn)的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與討論

2.1 石斛堿與三聯(lián)吡啶釕發(fā)光體系的電化學(xué)發(fā)光行為

在檢測(cè)池中先加入5mmol·L－1Ru（bpy溶液進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，記錄電極電流和電化學(xué)發(fā)光曲線。加入3.4mg·L－1石斛堿溶液后，再進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，記錄電極電流和電化學(xué)發(fā)光曲線，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 循環(huán)伏安圖（a）和電化學(xué)發(fā)光曲線（b）Fig.1 Cyclic voltammograms（a）and the profile of electrochemiluminescence（b）

由圖1可知：三聯(lián)吡啶釕只有較小的電極電流和弱的電化學(xué)發(fā)光信號(hào)；當(dāng)加入石斛堿后，電極電流和電化學(xué)發(fā)光信號(hào)都得到明顯的增強(qiáng)。基于石斛堿對(duì)三聯(lián)吡啶釕的電化學(xué)發(fā)光的增強(qiáng)作用，可建立毛細(xì)管電泳－電化學(xué)發(fā)光法測(cè)定石斛堿的含量。

2.2 檢測(cè)條件的選擇

2.2.1 檢測(cè)電位

采用恒電位法在1.0～1.35V（vs.Ag／AgCl）內(nèi)考察檢測(cè)電位對(duì)電化學(xué)發(fā)光（ECL）強(qiáng)度的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖2可知：當(dāng)檢測(cè)電位升至1.17V時(shí)，石斛堿的ECL強(qiáng)度最大。因此，試驗(yàn)選擇1.17V作為檢測(cè)電位。

圖3 Ru（bpy濃度對(duì)電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響Fig.3 Effeet of concentration of Ru（bpy on ECL intensity

2.2.3 運(yùn)行緩沖溶液的濃度和酸度

試驗(yàn)考察了5～30mmol·L－1內(nèi)的運(yùn)行緩沖溶液對(duì)ECL強(qiáng)度的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

由圖4可知：隨著運(yùn)行緩沖溶液濃度的增大，ECL強(qiáng)度逐漸增大；當(dāng)其濃度為10mmol·L－1時(shí)，ECL強(qiáng)度達(dá)到最大；濃度高于10mmol·L－1時(shí)，ECL強(qiáng)度逐漸減小。因此，試驗(yàn)選擇10mmol·L－1磷酸鹽緩沖溶液為運(yùn)行緩沖溶液。

緩沖溶液的酸度也會(huì)影響毛細(xì)管電泳的分離效果和ECL強(qiáng)度，影響分析物的電離度，還會(huì)影響電滲流（EOF）的大小。試驗(yàn)考察運(yùn)行緩沖溶液在pH 3.50～8.50內(nèi)對(duì)ECL強(qiáng)度的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖4 運(yùn)行緩沖溶液濃度對(duì)電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響Fig.4 Effect of concentration of the running buffer solution on ECL intensity

圖5 運(yùn)行緩沖溶液酸度對(duì)電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響Fig.5 Effect of acidity of the running buffer solution on ECL intensity

由圖5可知：當(dāng)運(yùn)行緩沖溶液pH為5.13時(shí)，ECL強(qiáng)度最大。因此，試驗(yàn)選擇pH 5.13的10mmol·L－1磷酸鹽緩沖溶液為運(yùn)行緩沖溶液。

2.2.4 檢測(cè)池中緩沖溶液的濃度和酸度

固定檢測(cè)池中磷酸鹽緩沖溶液濃度為60mmol·L－1，考察其 pH 在6.00～9.50內(nèi)對(duì)ECL強(qiáng)度的影響，結(jié)果見(jiàn)圖6。

由圖6可知：pH 為6.00～8.10時(shí)，ECL強(qiáng)度隨檢測(cè)池中磷酸鹽緩沖溶液pH增大而增大；pH為8.10～9.50時(shí)，ECL強(qiáng)度隨pH 增大而減小。因此，試驗(yàn)選擇pH 8.10的磷酸鹽緩沖溶液。

選用pH 8.10磷酸鹽緩沖溶液，考察其濃度在50～90mmol·L－1內(nèi)對(duì)ECL強(qiáng)度的影響，結(jié)果見(jiàn)圖7。

由圖7可知：當(dāng)檢測(cè)池中磷酸鹽緩沖溶液濃度為70mmol·L－1時(shí)，ECL強(qiáng)度達(dá)到最大。因此，試驗(yàn)選擇檢測(cè)池中磷酸鹽緩沖溶液的濃度為70mmol·L－1。

圖2 檢測(cè)電位對(duì)電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響Fig.2 Effect of detection potential on ECL intensity

2.2.5 分離電壓和進(jìn)樣時(shí)間

試驗(yàn)考察了分離電壓在10～18kV內(nèi)對(duì)ECL強(qiáng)度的影響。結(jié)果表明：當(dāng)電壓在10～15kV內(nèi)逐漸升高時(shí)，ECL強(qiáng)度逐漸增大；當(dāng)分離電壓高于15kV時(shí)，基線噪聲大。因此，試驗(yàn)選擇分離電壓為15kV。

采用電動(dòng)進(jìn)樣，選擇進(jìn)樣電壓為10kV，考察了進(jìn)樣時(shí)間在5～15s內(nèi)對(duì)ECL強(qiáng)度的影響。結(jié)果表明：隨著進(jìn)樣時(shí)間的增加，ECL強(qiáng)度逐漸增大；當(dāng)進(jìn)樣時(shí)間超過(guò)10s時(shí)，ECL強(qiáng)度增長(zhǎng)緩慢且偏離線性、有拖尾現(xiàn)象。因此，試驗(yàn)選擇進(jìn)樣時(shí)間為10s。

圖6 檢測(cè)池中磷酸鹽緩沖溶液酸度對(duì)電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響Fig.6 Effeet of acidity of PBS in detection cell on ECL intensity

圖7 檢測(cè)池中磷酸鹽緩沖溶液濃度對(duì)電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響Fig.7 Effeet of concentration of PBS in detection cell on ECL intensity

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

在試驗(yàn)條件下，石斛堿質(zhì)量濃度在1.0～100mg·L－1內(nèi)與其峰面積呈線性關(guān)系，線性回歸方程為y＝374.9 x－85.81（y為ECL信號(hào)的峰面積，x為石斛堿的質(zhì)量濃度），相關(guān)系數(shù)為0.999 7。

以3倍信噪比計(jì)算方法的檢出限（3S／N）為0.045mg·L－1。

2.4 樣品分析與加標(biāo)回收試驗(yàn)

按試驗(yàn)方法測(cè)定金釵石斛樣品中的石斛堿，對(duì)照品及樣品的電泳圖見(jiàn)圖8。

圖8 毛細(xì)管電泳圖Fig.8 Capillary electrophoresis charts

圖8 曲線3為金釵石斛樣品的電泳圖，圖中只有一個(gè)峰，與對(duì)照品的出峰時(shí)間一致，且加入石斛堿標(biāo)準(zhǔn)溶液后峰信號(hào)增強(qiáng)，見(jiàn)圖8曲線2，與石斛堿對(duì)照品電泳圖（圖8曲線1）進(jìn)行比較可知，樣品譜峰為石斛堿。經(jīng)計(jì)算，該批金釵石斛中石斛堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.32%。

取已知含量的樣品提取液，按試驗(yàn)方法進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，測(cè)定值與回收率結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 樣品分析結(jié)果和回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝5）Tab.1 Results of tests for sample analysis and recovery（n＝5）

本工作采用毛細(xì)管電泳－電化學(xué)發(fā)光法測(cè)定金釵石斛中石斛堿的含量，方法簡(jiǎn)單、快速，與藥典規(guī)定的測(cè)定方法相比，本方法具有進(jìn)樣量少、分析速率快、靈敏度高、設(shè)備低廉、裝置及操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。

［1］ 管志斌，李再林.珍稀名貴中藥——金釵石斛［J］.中國(guó)野生植物資源，2002，21（4）：36－37.

［2］ 江瀅，黃厚今.金釵石斛研究進(jìn)展［J］.云南中醫(yī)中藥雜志，2015，36（1）：77－78.

［3］ 金蓉鸞，孫繼軍，張遠(yuǎn)名.11種石斛的總生物堿的測(cè)定［J］.中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，1981，16（1）：9－13.

［4］ 王憲楷，趙同芳.石斛屬植物的化學(xué)成分與中藥石斛［J］.中國(guó)藥學(xué)雜志，1986，21（11）：666－669.

［5］ 華茉莉，劉全海，莊 賢 韓，等.石 斛 堿的 新 應(yīng) 用：CN101543492［P］.2009－09－30.

［6］ 國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典一部2010版［M］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出社，2010.

［7］ 華茉莉，楊洋，沈志偉.氣相色譜法測(cè)定金釵石斛藥材中石斛堿的含量［J］.中藥材，2006，29（4）：338－339.

［8］ 黃小燕，乙引.氣相色譜法測(cè)定金釵石斛中石斛堿的含量［J］.貴州師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2007，25（4）：92－94.

［9］ 申剛，乙引，張習(xí)敏，等.HPLC法測(cè)定金釵石斛中石斛堿含 量 ［J］.安徽 農(nóng)業(yè)科 學(xué)，2009，37（31）：15248－15249.

［10］ 李墅，王春蘭，郭順星.高效液相色譜法測(cè)定金釵石斛中石斛堿含量［J］.中國(guó)藥學(xué)雜志，2009，44（4）：252－254.

［11］ DENG B，SU C，KANG Y.Determination of norfloxacin in human urine by capillary electrophoresis with electrochemiluminescence detection［J］.Analytical ＆ Bioanalytical Chemistry，2006，385（7）：1336－1341.

［12］ SUN X，LIU J，CAO W，et al.Capillary electrophoresis with electrochemiluminescence detection of procyclidine in human urine pretreated by ion－exchange cartridge［J］.Analytica Chimica Acta，2002，470（2）：137－145.

［13］ GAO Y，XU Y，HAN B，et al.Sensitive determination of verticine and verticinone in Bulbus Fritillariae by ionic liquid assisted capillary electrophoresis－electrochemiluminescence system［J］.Talanta，2009，80（2）：448－453.

［14］ ZHOU M，LI Y，LIU C，et al.Simultaneous determination of lappaconitine hydrobromide and isopropiram fumarate in rabbit plasma by capillary electrophoresis with electrochemiluminescence detection［J］.E－lectrophoresis，2012，33（16）：2577－2583.

［15］ ZHOU M，LI Y J，MA Y J，et al.Determination of ketotifen fumarate by capillary electrophoresis with tris（2，2′－bipyridyl）ruthenium （II）electrochemiluminescence detection［J］.Luminescence，2011，26（5）：319－323.

［16］ LIU H，YUAN R，CHAI Y，et al.A novel solidstate electrochemiluminescence detector for capillary electrophoresis based on tris（2，2′－bipyridyl）ruthenium （II）immobilized in Nafion／PTC－NH2composite film［J］.Talanta，2011，84（2）：387－392.

［17］ YUAN B，ZHENG C，TENG H，et al.Simultaneous determination of atropine，anisodamine，and scopolamine in plant extract by nonaqueous capillary electrophoresis coupled with electrochemiluminescence and electrochemistry dual detection［J］.Journal of Chromatography A，2010，1217（1）：171－174.