張 偉，陳 艷，何豐瑞

（西安市疾病預(yù)防控制中心，西安710054）

堿性橙2、堿性橙21、堿性橙22和堿性嫩黃O都屬于偶氮工業(yè)染料，主要用于腈綸、紡織品、紙張、皮革、家具等的染色［1］。這些染料具有致癌、致畸作用，對(duì)人體健康具有嚴(yán)重的危害?！吨腥A人民共和國食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》及《中華人民共和國食品衛(wèi)生法》規(guī)定，禁止堿性橙作為食品添加劑。由于這些染料在中性及偏堿性的條件下與蛋白質(zhì)吸附牢固，不易褪色，而且成本低廉，一些不法食品生產(chǎn)商使用這些染料對(duì)豆制品進(jìn)行染色，使之色澤光亮，欺騙消費(fèi)者［2］。

目前，豆制品中這幾種堿性染料的測(cè)定方法有高效液相 色 譜 法［3－5］、液 相 色 譜－質(zhì) 譜 法［6－7］、分 光 光度法［8］，我國食品中堿性染料的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)使用直接提取－高效液相色譜法，目前尚未見采用毛細(xì)管電泳法同時(shí)測(cè)定這幾種堿性染料的文獻(xiàn)報(bào)道。

毛細(xì)管電泳作為一種分離方法，具有綠色環(huán)保、儀器簡單、分析快速、分離效率高等優(yōu)點(diǎn)，在實(shí)際樣品分析中應(yīng)用越來越廣泛。本工作采用乙酸銨溶液提取、固相萃取的前處理方法，建立毛細(xì)管區(qū)帶電泳法同時(shí)測(cè)定堿性橙2、堿性橙21、堿性橙22和堿性嫩黃O的分析方法，并應(yīng)用于豆制品中堿性染料的測(cè)定。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

貝克曼P／ACE MDQ型毛細(xì)管電泳儀，配紫外檢測(cè)器；Turbo Vap型自動(dòng)濃縮儀；未涂層熔融石英毛細(xì)管柱（75μm×40cm，有效長度30cm）；Oasis HLB固相萃取柱。

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：1.000g·L－1，分別稱取10.00mg的堿性橙2、堿性橙21、堿性橙22、堿性嫩黃O，用水溶解后，定容至10mL，避光于4℃密封保存。使用時(shí)稀釋至所需質(zhì)量濃度。

磷酸二氫鉀溶液：100mmol·L－1，稱取磷酸二氫鉀1.35g，用水溶解后，定容至100mL。

堿性橙2（純度 99.6%）、堿性橙 21（純度90.2%）、堿性橙22（純度95.4%）、堿性嫩黃 O（純度79.0%）標(biāo)準(zhǔn)品；甲醇、乙腈、氨水為色譜純；乙酸銨、磷酸二氫鉀為分析純；試驗(yàn)用水為超純水（電阻率為18.2MΩ·cm）。

1.2 電泳條件

分離電壓20kV，分離溫度30℃，檢測(cè)波長210nm，進(jìn)樣方式為壓力進(jìn)樣（0.13MPa，0.5s），運(yùn)行緩沖溶液為含20%（體積分?jǐn)?shù)，下同）乙腈的40mmol·L－1磷酸二氫鉀溶液（pH 2.5）。每次進(jìn)樣前按水、甲醇、水的順序清洗毛細(xì)管各1min，然后用運(yùn)行緩沖溶液沖洗2min。

1.3 試驗(yàn)方法

將樣品均質(zhì)后，稱取樣品2.000g置于10mL具塞離心管中，加入50mmol·L－1乙酸銨溶液5.00mL，超聲提取30min，以3 000r·min－1轉(zhuǎn)速離心10min，將上清液取出置于離心管中，再加入50mmol·L－1乙酸銨溶液5.00mL提取一次，合并提取液后，以3 000r·min－1轉(zhuǎn)速離心10min后收集上清液。含油樣品加入正己烷2mL，渦旋振蕩萃取，棄去正己烷層，重復(fù)3次，待過柱濃縮凈化。

分別以甲醇3mL、水3mL活化HLB固相萃取小柱，將上述提取液5mL（用氨水調(diào)至近中性）加入萃取柱中，用3mL水淋洗后，加入氨水－乙腈（5＋95）混合液2mL洗脫，收集洗脫液。上樣和洗脫過程流量控制低于1mL·min－1。將洗脫液于30℃用氮?dú)獯抵两?，加入乙腈－水?5＋75）溶液1.00mL，漩渦混勻30s后，過0.45μm 濾膜后待測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)波長的選擇

將堿性橙2、堿性橙21、堿性22、堿性橙O的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液分別用水稀釋成50mg·L－1。以水為空白，分別在190～800nm內(nèi)對(duì)各標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行紫外－可見吸收光譜掃描，這4種堿性染料在450，210nm處均有較強(qiáng)吸收。由于食品樣品基體復(fù)雜，在可見區(qū)域有較大干擾，并且由于儀器限制，不能在450nm處進(jìn)行檢測(cè)，試驗(yàn)選擇210nm作為檢測(cè)波長。

2.2 電泳條件的選擇

2.2.1 緩沖試劑和緩沖溶液的酸度

緩沖試劑的選擇主要由所需的酸度決定，而該酸度又因樣品的性質(zhì)和分離效率不同而不同［8－9］。在毛細(xì)管區(qū)帶電泳中，待測(cè)物質(zhì)在離子狀態(tài)下才能實(shí)現(xiàn)分離。這4種堿性染料均有氨基基團(tuán)，在酸性條件下可解離，因此試驗(yàn)選擇磷酸、磷酸二氫鉀作為分析的緩沖試劑。

緩沖溶液的酸度不僅能控制分析物的有效淌度，還控制著電滲流，同時(shí)對(duì)分析物的離子化程度有較大影響，因此是優(yōu)化分離條件的重要因素。試驗(yàn)考察了不同酸度（pH 2.5，3.5，4.5，5.5，6.5）的40mmol·L－1磷酸二氫鉀緩沖溶液對(duì)分離效果的影響，結(jié)果見圖1。

由圖1可知：隨著緩沖溶液pH減小，出峰時(shí)間、峰高和峰面積均增加。在試驗(yàn)范圍內(nèi)，pH越小，4種堿性染料的分離效果越好。因此，試驗(yàn)選擇緩沖溶液的pH為2.5。

2.2.2 緩沖溶液濃度

緩沖溶液濃度通過影響溶液的黏度和電滲流，進(jìn)而影響樣品的分離情況。一般情況下，緩沖溶液的濃度越高，電滲流越低，遷移時(shí)間就會(huì)延長，分離度增加。但是，緩沖溶液濃度的升高卻會(huì)增加焦耳熱，使峰形變寬，峰面積下降。試驗(yàn)分別考察了使用20，40，60，80mmol·L－1磷酸二氫鉀溶液時(shí)，4種堿性染料的遷移時(shí)間和分離度。結(jié)果表明：隨著磷酸二氫鉀溶液濃度的升高，4種堿性染料分離度增加，但電流同時(shí)增加，遷移時(shí)間延長。綜合考慮，試驗(yàn)選擇40mmol·L－1磷酸二氫鉀溶液。

2.2.3 添加劑的種類及其用量

運(yùn)行緩沖溶液中添加有機(jī)溶劑，可以減少毛細(xì)管電泳的電滲流，降低焦耳熱，從而有利于物質(zhì)的分離。有機(jī)添加劑通常具有較高的偶極矩和介電常數(shù)，并對(duì)被測(cè)物質(zhì)有良好的溶解性。一般來說，甲醇、乙腈是比較合適的有機(jī)添加劑。試驗(yàn)對(duì)比了不同有機(jī)溶劑（甲醇、乙醇、乙腈、丙酮）對(duì)4種堿性染料分離效果的影響。結(jié)果表明：添加甲醇、乙醇、丙酮使峰形拖尾，同時(shí)遷移時(shí)間也明顯增加；而添加乙腈能夠明顯改善峰形，增加分離度。試驗(yàn)進(jìn)一步比較了運(yùn)行緩沖溶液中乙腈的體積分?jǐn)?shù)對(duì)4種堿性橙分離效果的影響，結(jié)果見圖2。

結(jié)果表明：隨著乙腈體積分?jǐn)?shù)的增加，峰形明顯改善，分離度增加，遷移時(shí)間減少。但過多的乙腈容易在毛細(xì)管內(nèi)形成氣泡，造成基線波動(dòng)，因此綜合考慮分離效果和基線波動(dòng)等因素，試驗(yàn)選擇添加20%的乙腈。

2.2.4 分離電壓和溫度

試驗(yàn)比較了分離電壓在15～30kV時(shí)對(duì)4種堿性染料的分離效果的影響。結(jié)果表明：隨著分離電壓的升高，遷移時(shí)間縮短，但基線噪聲隨之增大。試驗(yàn)選擇分離電壓為20kV。

圖1 運(yùn)行緩沖溶液酸度對(duì)4種堿性染料分離效果的影響Fig.1 Effect of acidity of the running buffer solution on the separation efficiency of the four basic dyes

圖2 運(yùn)行緩沖溶液中乙腈體積分?jǐn)?shù)對(duì)4種堿性染料分離效果的影響Fig.2 Effect of the volume fraction of acetonitrile in the running buffer solution on the separation efficiency of the four basic dyes

圖3 4種堿性染料混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的電泳圖Fig.3 Electrophorogram of mixed standard solution of the four basic dyes

毛細(xì)管的柱溫對(duì)遷移時(shí)間、電滲流重現(xiàn)性都有一定的影響［10］。試驗(yàn)比較了分離溫度分別為20，25，30，35℃時(shí)4種堿性染料的分離效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在分離溫度為30℃時(shí)，4種堿性染料有較好的分離度并且遷移時(shí)間較短。

在最優(yōu)條件下，混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的電泳圖見圖3。

2.3 樣品前處理?xiàng)l件的選擇

2.3.1 提取液

文獻(xiàn)［10－14］中報(bào)道用于提取這4種堿性染料的溶液有乙酸－甲醇（1＋9）溶液、氨水－甲醇（1＋9）溶液、乙醇、乙醇（3＋7）溶液、乙酸銨溶液等。試驗(yàn)在空白豆腐皮樣品中加入標(biāo)準(zhǔn)溶液，考察了以上提取液對(duì)4種堿性染料的提取效果。結(jié)果表明：50mmol·L－1乙酸銨溶液的提取率最高，同時(shí)便于下一步的濃縮凈化過程。因此，試驗(yàn)選擇50mmol·L－1乙酸銨溶液作為提取液。

2.3.2 固相萃取柱

在堿性染料凈化的固相萃取柱的選擇上，HLB柱［15］、C18柱［7］、MCX 柱［16］均有文獻(xiàn)報(bào)道。試驗(yàn)考察了這3種固相萃取柱的凈化效果，結(jié)果表明：MCX固相萃取柱與堿性橙的結(jié)合能力很強(qiáng)，必須使用二氯甲烷、三氯甲烷等溶劑才能洗脫，HLB固相萃取柱在雜質(zhì)的去除和回收率上均優(yōu)于C18固相萃取柱。因此，試驗(yàn)選擇HLB作為固相萃取柱。

2.3.3 洗脫溶劑

試驗(yàn)考察了不同類型洗脫劑（氨水－甲醇溶液、氨水－乙腈溶液、氨水－丙酮溶液）的洗脫效果，結(jié)果表明：氨水－甲醇溶液的洗脫能力差，不能夠?qū)A性嫩黃O完全洗脫下來；氨水－丙酮溶液洗脫能力太強(qiáng)，洗脫雜質(zhì)多，不利于測(cè)定；氨水－乙腈溶液在保證將這4種堿性染料洗脫下來的前提下，洗脫的雜質(zhì)少。試驗(yàn)選擇氨水－乙腈溶液作為洗脫溶劑。

試驗(yàn)進(jìn)一步考察了氨水－乙腈溶液中氨水的體積數(shù)（0，1.0%，2.5%，5.0%，7.5%）對(duì)洗脫效果的影響，結(jié)果見圖4。

由圖4可知：隨著氨水體積分?jǐn)?shù)的增加，堿性橙21、堿性橙22的回收率有明顯上升；當(dāng)氨水體積分?jǐn)?shù)為5%時(shí)，4種堿性染料的回收率達(dá)到最高。試驗(yàn)選擇5%的氨水－乙腈溶液作為洗脫溶劑。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和測(cè)定下限

分別取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液適量，配制5個(gè)濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，在優(yōu)化的電泳條件下，由低濃度到高濃度分別進(jìn)樣測(cè)定，從而得到4種堿性染料的線性回歸方程以及線性相關(guān)系數(shù)，見表1。線性回歸方程中y表示峰面積，x表示質(zhì)量濃度。

將標(biāo)準(zhǔn)溶液按照不同的倍數(shù)稀釋加入樣品中，進(jìn)行測(cè)定，分別根據(jù)3倍信噪比和10倍信噪比對(duì)應(yīng)的樣品中待測(cè)物質(zhì)含量，確定方法的檢出限（3S／N）和測(cè)定下限（10S／N），結(jié)果見表1。

圖4 氨水的體積分?jǐn)?shù)對(duì)洗脫效果的影響Fig.4 Effect of volume fraction of ammonia on the elution efficiency

表1 線性參數(shù)、檢出限和測(cè)定下限Tab.1 Linearity parameters，detection limits and lower limits of determination

2.5 精密度與回收試驗(yàn)

取質(zhì)量濃度為25mg·L－1的4種堿性染料的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按試驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定，在一天內(nèi)連續(xù)測(cè)定6次，以峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）考察方法的日內(nèi)精密度，連續(xù)6d進(jìn)行測(cè)定，考察方法的日間精密度，結(jié)果見表2。

取空白豆腐干樣品，均質(zhì)后稱取12份，其中3份測(cè)定本底值，其余分別加入3個(gè)不同水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)水平測(cè)定3個(gè)平行樣品，并計(jì)算峰面積的RSD，結(jié)果見表3。

表3表明：本法的加標(biāo)回收率為7 3.6%～93.1%，能夠滿足分析的要求。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab.2 Results of test for precision（n＝6）

表3 回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝3）Tab.3 Results of test for recovery（n＝3）

2.6 樣品分析

應(yīng)用本法測(cè)定腐竹和豆腐干等9種豆制品中的堿性染料，結(jié)果均未檢出。圖5為不同種類樣品及其加標(biāo)（20mg·kg－1）后的電泳圖。

圖5 空白樣品與其加標(biāo)后的電泳圖Fig.5 Electrophorograms of blank samples before and after spiking with standard solution

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