宓捷波，張 然，王 飛，許 泓，葛寶坤，何 佳

（1.天津出入境檢驗(yàn)檢疫局，天津300461； 2.天津科技大學(xué)，天津300222）

阿維菌素類（AVMs）藥物是從鏈霉菌的發(fā)酵菌絲中提取分離的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，其對(duì)動(dòng)物體內(nèi)外寄生的線蟲(chóng)、節(jié)肢動(dòng)物以及農(nóng)作物上的害蟲(chóng)、螨類都有極強(qiáng)的驅(qū)殺作用，在農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛［1－2］。但由于其毒性與硫磷農(nóng)藥相仿，屬高毒化合物，我國(guó)、歐盟以及日本均規(guī)定了阿維菌素類藥物的最高殘留限量（MRLs）［3－5］。我國(guó)規(guī)定阿維菌素在牛、羊組織及奶中的 MRLs為20～100μg·kg－1，伊維菌素在豬、牛、羊組織及奶中的MRLs為10～100μg·kg－1；日本規(guī)定在豬、牛、羊中阿維菌素的MRLs為10～100μg·kg－1；歐盟則規(guī)定肉及可食用水中阿維菌素的MRLs為10μg·kg－1。

目前，動(dòng)物源食品中阿維菌素類藥物的測(cè)定多采用 高效 液 相 色 譜－串 聯(lián) 質(zhì) 譜 法［6－8］（HPLC－MS／MS），與 液 相 色 譜 法 （HPLC）［9－11］、酶 聯(lián) 免 疫 法（ELISA）［12－13］相比，HPLC－MS／MS無(wú)需衍生化反應(yīng)，靈敏度高、定性定量準(zhǔn)確。但HPLC－MS／MS的前處理技術(shù)通常為離線的固相萃?。╫ffline－SPE），操作繁瑣、耗時(shí)。近年來(lái)，在線前處理技術(shù)以其快速、高通量的特點(diǎn)在生物、醫(yī)藥等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用［14－15］。然而，由于動(dòng)物源食品基質(zhì)較為復(fù)雜，禁限用藥物的檢出限較低，所以在線前處理技術(shù)在動(dòng)物源食品檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用相對(duì)較少。本工作利用雙通道在線固相萃取系統(tǒng)，通過(guò)固相萃取柱、上樣、洗脫等條件的優(yōu)化，建立測(cè)定動(dòng)物源食品中阿維菌素和伊維菌素殘留量的在線凈化－液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1200－API4000型液相色譜－三重四極桿質(zhì)譜儀；Symbiosis Pico雙通道在線SPE液相系統(tǒng)；96 孔－HySphere C18HD 萃 取 柱 （2mm ×10mm，7μm）及方法開(kāi)發(fā)萃取柱；ZORBAX SB－C18色譜柱（2.1mm×15mm，1.8μm）；Ultra－turrax T25型高速均質(zhì)器；Avati J－26XPI型高速離心機(jī)。

混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：分別稱取阿維菌素和伊維菌素標(biāo)準(zhǔn)品10mg，用甲醇溶解并定容至10mL，得1.000g·L－1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，于4℃避光存放。然后移取阿維菌素和伊維菌素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液各10μL于100mL容量瓶中，用甲醇定容，配成的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，于4℃避光保存。

乙腈、甲醇、甲酸均為色譜純；乙酸銨、三乙胺和氨水均為分析純；試驗(yàn)用水為去離子水。

1.2 儀器工作條件

1）色譜條件 乙腈為流動(dòng)相A，含0.2%（體積分?jǐn)?shù)，下同）甲酸的10mmol·L－1乙酸銨溶液為流動(dòng)相B，流量400μL·min－1，柱溫為25℃。梯度洗脫程序：在線SPE活化、上樣和洗滌階段，A保持35%；0～2min，洗脫液轉(zhuǎn)移階段，A保持35%；2～4min，A由35%變化為95%；4～6.5min，A 保持35%。整個(gè)色譜分離時(shí)間為4.5min。

2）質(zhì)譜條件 電噴霧正離子源（ESI＋）模式，氣簾氣壓力為207kPa，輔助氣1的壓力為345kPa，輔助氣2的壓力為379kPa，碰撞氣壓力為69kPa，噴霧電壓為4 500V，離子源溫度為550℃。多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式掃描。

1.3 試驗(yàn)方法

稱取試樣2.50g于50mL離心管中，加入乙腈5mL，均質(zhì)30s，再加入0.15%（體積分?jǐn)?shù)）三乙胺溶液5mL，以5 000r·min－1轉(zhuǎn)速離心5min，取上清液1mL，過(guò)0.22μm微孔濾膜，待分析。

在雙通道在線固相萃取系統(tǒng)上進(jìn)行固相萃取小柱的相應(yīng)處理，其中活化、上樣和洗滌步驟在一個(gè)通道進(jìn)行，棄去流出液，而洗脫轉(zhuǎn)移步驟在另一通道進(jìn)行，液體直接轉(zhuǎn)移至色譜柱。

對(duì)HySphere C18HD萃取柱采用高壓輸送泵進(jìn)行操作，具體步驟為：以甲醇1mL和2%（體積分?jǐn)?shù)，下同）氨水的甲醇溶液1mL依次進(jìn)行活化處理，流量5 000μL·min－1，進(jìn)樣量100μL；再依次以2%氨水的甲醇溶液－2%氨水（2＋8）混合液1mL、2%氨水的甲醇溶液－2%氨水（5＋5）混合液1mL和水1mL進(jìn)行洗滌，流量5 000μL·min－1；最后以甲酸－甲醇（1＋99）混合液400μL進(jìn)行洗脫轉(zhuǎn)移，流量200μL·min－1，液體全部進(jìn)入液相色譜柱，全程共需要3min。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

阿維菌素類藥物在ESI＋模式下，往往以［M＋Na］＋和［M＋NH4］＋加合準(zhǔn)分子離子峰形式出現(xiàn)，見(jiàn)圖1。

圖1中m／z895.5，897.5分別為阿維菌素和伊維菌素的［M＋Na］＋離子，而m／z 890.5，892.5則為［M＋NH4］＋離子。由圖1可以看出，以［M＋Na］＋形式存在的離子更占優(yōu)勢(shì)。但是，由于［M＋Na］＋離子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不易進(jìn)一步裂解［7，16］，且裂解后產(chǎn)物離子的豐度低，信號(hào)不穩(wěn)定。

圖2為1mg·L－1阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液分別以［M＋Na］＋和［M＋NH4］＋形式進(jìn)一步裂解的質(zhì)譜圖，圖2中顯示［M＋NH4］＋形式的前體離子和產(chǎn)物離子豐度高，信號(hào)穩(wěn)定，而［M＋Na］＋形式的相應(yīng)離子豐度及信號(hào)均較差。因此，試驗(yàn)中采用［M＋NH4］＋作為檢測(cè)的前體離子，具體的質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)表1，其中“＊”為定量離子對(duì)。

圖1 阿維菌素和伊維菌素的［M＋Na］＋和［M＋NH4］＋加合離子峰質(zhì)譜圖Fig.1 Mass spectrum of avermectin and ivermectin in the forms of［M＋Na］＋and［M＋NH4］＋

圖2 阿維菌素的［M＋NH4］＋和［M＋Na］＋加合離子的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.2 Secondary mass spectra of avermectin and in the forms of［M＋NH4］＋and［M＋Na］＋

表1 阿維菌素和伊維菌素的質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 MS parameters of avermectin and ivermectin

2.2 在線SPE柱的選擇

阿維菌素類藥物相對(duì)分子質(zhì)量大，含糖鏈，極性相對(duì)較弱，文獻(xiàn)［5，8，10－11］中多采用 C8、C18、氨基柱作為離線SPE柱進(jìn)行凈化。為了考察不同SPE柱對(duì)動(dòng)物源食品中阿維菌素類藥物凈化效果的影響，試驗(yàn)對(duì) C8、Resin SH、Resin GP和 C18HD 等4種在線SPE柱進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 不同在線SPE柱的萃取效果比較Fig.3 Comparison of the extraction efficiency of different on－line SPE columns

由圖3可知，C8、Resin SH 和 Resin GP對(duì)目標(biāo)物的保留較差，C18HD柱的保留和凈化效果最好，所以試驗(yàn)選擇C18HD柱作為在線SPE柱。

2.3 在線洗脫條件的選擇

與離線SPE相比，在線SPE需要將高比例有機(jī)相的洗脫液直接引入分析柱，如果洗脫液的流量和用量控制不當(dāng)，會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)物的擴(kuò)散和流失。試驗(yàn)在流量固定200μL·min－1的情況下，對(duì)甲酸－甲醇（1＋99）洗脫液的用量進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 洗脫液用量對(duì)阿維菌素和伊維菌素測(cè)定的影響Fig.4 Effect of eluent volume on the determination of avermectin and ivermectin

由圖4可知：洗脫液用量為200μL時(shí)，目標(biāo)物均未檢出，表明洗脫強(qiáng)度不夠；當(dāng)洗脫液用量為400μL時(shí)，阿維菌素和伊維菌素的峰面積最大；但隨著洗脫液體積的增加，目標(biāo)物的峰面積反而減小，這可能由于洗脫時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，目標(biāo)物逐漸在分析柱上擴(kuò)散流失。固定400μL洗脫液用量，試驗(yàn)考察了100，150，200，300μL·min－1流量對(duì)目標(biāo)物分離的影響。結(jié)果表明：當(dāng)流量為200μL·min－1時(shí)，目標(biāo)物峰形最佳。所以，試驗(yàn)選擇流量為200μL·min－1，洗脫液用量為400μL。

對(duì)于洗脫后流動(dòng)相的選擇，試驗(yàn)比較了甲醇和乙腈對(duì)阿維菌素的分離洗脫情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：當(dāng)采用乙腈作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，阿維菌素的響應(yīng)值比甲醇作為流動(dòng)相時(shí)更高。因此，試驗(yàn)選擇乙腈作為流動(dòng)相。

2.4 工作曲線與測(cè)定下限

為了消除基質(zhì)效應(yīng)，以空白豬肉基質(zhì)提取液稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，得到0，0.50，1.0，2.0，5.0，10μg·L－1的工作溶液系列，進(jìn)行在線固相萃取和液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜分析，以化合物的峰面積比（y）為縱坐標(biāo)，其質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)繪制工作曲線。阿維菌素和伊維菌素的質(zhì)量濃度在10μg·L－1內(nèi)呈線性，線性回歸方程分別為y＝1 270 x＋728和y＝396 x＋266，相關(guān)系數(shù)均大于0.99。

通過(guò)在空白樣品中進(jìn)行加標(biāo)測(cè)定，根據(jù)提取離子色譜峰的信噪比（S／N）大于10確定方法的測(cè)定下限，阿維菌素和伊維菌素的測(cè)定下限均為5.0μg·kg－1，可以滿足目前國(guó)內(nèi)外對(duì)阿維菌素類藥物殘留限量的要求。

2.5 精密度與回收試驗(yàn)

依據(jù)歐盟指令2002／657／EC關(guān)于方法確證回收率的要求，分別在空白豬肉、牛肉和香腸樣品中添加5.0，10，15μg·kg－1等3個(gè)濃度水平的阿維菌素和伊維菌素，按試驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定，精密度與回收試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 精密度與回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab.2 Results of tests for precision and recovery（n＝6）

由表2可知：加標(biāo)回收率在74.8%～96.5%之間，測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）不大于11%，可以滿足分析樣品需要。

圖5為豬肉基質(zhì)中添加5.0μg·kg－1阿維菌素類藥物的提取離子色譜圖，與空白基質(zhì)圖比較，目標(biāo)物出峰明顯，不存在干擾。

圖5 豬肉基質(zhì)中添加5.0μg·kg－1阿維菌素和伊維菌素的提取離子色譜圖Fig.5 Extracted ion chromatograms of avermectin and ivermectin in pork spiked with 5.0μg·kg－1

2.6 在線凈化與離線凈化方法的比較

在空白豬肉樣品中添加10μg·kg－1的阿維菌素和伊維菌素，分別采用離線和在線方法進(jìn)行回收率測(cè)定，其中離線方法的提取液過(guò)C18SPE柱，經(jīng)上樣、洗脫、氮吹、復(fù)溶等步驟后上機(jī)測(cè)定，比較結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 離線與在線方法的比較Tab.3 Comparison of offline and online methods

由表3可知，離線和在線試驗(yàn)的回收率相近，均符合測(cè)定要求，但在樣品前處理時(shí)間上在線方法明顯比離線方法短。

2.7 實(shí)際樣品分析

按試驗(yàn)方法對(duì)天津口岸進(jìn)出口的21批次豬肉和5批次香腸中的阿維菌素類藥物的殘留進(jìn)行測(cè)定，所測(cè)樣品中均未檢出阿維菌素類藥物殘留。

本工作利用雙通道在線固相萃取系統(tǒng)，通過(guò)SPE小柱和洗脫條件的優(yōu)化，建立了測(cè)定動(dòng)物源食品中阿維菌素類藥物殘留的在線固相萃取－液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法。與傳統(tǒng)的離線固相萃取方法相比，本方法將固相萃取、復(fù)溶轉(zhuǎn)移和分離測(cè)定等多個(gè)步驟簡(jiǎn)化為一個(gè)環(huán)節(jié)，整個(gè)固相萃?。D(zhuǎn)移－分離－測(cè)定過(guò)程僅需要7.5min，有效地提高了效率，降低了濃縮復(fù)溶等環(huán)節(jié)人為污染的風(fēng)險(xiǎn)。本方法適用于豬肉、牛肉和香腸中阿維菌素和伊維菌素的檢測(cè)，其測(cè)定下限均為5.0μg·kg－1，能夠滿足國(guó)內(nèi)外對(duì)動(dòng)物源食品中阿維菌素和伊維菌素殘留的測(cè)定要求。

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