張 玲，田洪濤，劉錦濤，劉艷萍

(塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木盆地生物資源保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆阿拉爾 843300)

0 引 言

【研究意義】胡楊(Populuseuphratica)是國(guó)家3級(jí)珍稀瀕危植物，具有較強(qiáng)的抗干旱、抗鹽堿能力，是荒漠綠洲地區(qū)的主要造林樹種。對(duì)荒漠綠洲地區(qū)的防風(fēng)固沙及水土保持有著重要作用。胡楊林種群自然更新能力低，應(yīng)采取合適的措施對(duì)胡楊種質(zhì)資源進(jìn)行保存[1-3]。建立適合胡楊休眠莖尖的冷凍保存方法，對(duì)保存珍稀瀕危植物胡楊種質(zhì)資源具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】液氮冷凍保存植物種質(zhì)操作簡(jiǎn)單，不需要復(fù)雜的設(shè)備，且保存時(shí)間較長(zhǎng)，保存后的材料遺傳穩(wěn)定性不受影響[4-7]。胡楊種子在常溫常濕條件下，7 d種子活力即大幅下降，15 d即失去萌發(fā)能力[8]，因此實(shí)驗(yàn)嘗試對(duì)胡楊休眠芽進(jìn)行液氮冷凍保存的研究。包埋玻璃化液氮冷凍法兼具包埋脫水法和玻璃化法的優(yōu)點(diǎn)，保存后的材料有較高的存活率，且可以直接成苗[9-12]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前采用該法保存了多種植物[7，13-18]，但是采用包埋玻璃化法冷凍保存胡楊休眠莖尖的研究尚未見報(bào)道。研究適合胡楊休眠莖尖的冷凍保存方法?！緮M解決的關(guān)鍵問題】研究采用包埋玻璃化法對(duì)胡楊深冬休眠莖尖進(jìn)行了液氮冷凍保存的研究，確定預(yù)培養(yǎng)過(guò)程中蔗糖濃度、預(yù)培養(yǎng)時(shí)間及不同玻璃化保護(hù)液及處理時(shí)間對(duì)胡楊休眠莖尖存活率的影響，在優(yōu)化的條件下，研究建立適合胡楊休眠莖尖的冷凍保存方法。對(duì)保存后的莖尖采用相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性(Sequence—related amplified polymorphism，SRAP)進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材 料

取深冬胡楊休眠枝條，自來(lái)水浸泡24 h后，自來(lái)水沖洗1 h，然后用10%NaClO浸泡10 min后，75%酒精浸泡20 min，用無(wú)菌水沖洗2～3遍。超凈工作臺(tái)上剝?nèi)?～3 mm莖尖進(jìn)行包埋。

1.2 方 法

1.2.1 制膠

用50 mL燒杯，量取10 mL純凈水，置于磁力攪拌器上，慢速旋轉(zhuǎn)。稱取0.3 g褐藻酸鈉粉末緩慢倒入燒杯中，持續(xù)攪拌約4 h，直至膠體均勻無(wú)氣泡。

1.2.2 包埋

將胡楊莖尖與制好的褐藻酸鈉混勻，用不帶針頭的注射器將莖尖滴入0.1 mol/L CaCl2溶液中固定，30 min后即成直徑約為4 mm的褐藻酸鈣膠球。

1.2.3 蔗糖預(yù)培養(yǎng)

將膠球投入滅菌的0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mol/L的蔗糖溶液中振蕩培養(yǎng)(120 r/min,25℃)，培養(yǎng)時(shí)間為6、12、24、48和60 h。

1.2.4 玻璃化溶液處理

用不同配方的玻璃化保護(hù)液進(jìn)行保護(hù)劑毒性實(shí)驗(yàn)，選取最優(yōu)配方:

A:PVS2保護(hù)液[30%甘油+15%乙二醇(EG)+15%二甲基亞砜(DMSO)+0.5 mol/L蔗糖]。

B:40%甘油+ 45%(0.4 mol/L)蔗糖+10%聚乙二醇(分子量4 000)(PEG)+5%二甲基亞砜。

C:聚乙二醇(4 000)+葡萄糖+二甲基亞砜(10∶8∶10, V/V)。

D:15%(0.4 mol/L)蔗糖+25%甘油+15%乙二醇+13%二甲基亞砜+2%聚乙二醇(分子量4 000)(V/V)。

E: 50%甘油+50%蔗糖。

1.2.5 化凍

在超凈工作臺(tái)上，將凍存管從液氮中取出擰開，將膠球倒入30℃無(wú)菌水中，快速震蕩，直至冰晶消失。

1.2.6 胡楊莖尖的培養(yǎng)條件[19,20]

培養(yǎng)基配方為MS+0.3 mg/L BA+ 1.0 mg/L ZT+ 0.1 mg/L NAA。

1.2.7 存活率及遺傳變異的檢測(cè)1.2.7.1 存活率測(cè)定

膠球化凍后接種于適合胡楊莖尖的培養(yǎng)基上，暗處培養(yǎng)24 h后移入光下培養(yǎng)(光強(qiáng)2 000 lx，光周期12∶12)，15 d后統(tǒng)計(jì)其存活率。

1.2.7.2 遺傳變異的檢測(cè)

(1)植物基因組DNA的獲得

采用CTAB法提取保存后胡楊莖尖單株DNA，提取的DNA用RNase進(jìn)行消化RNA，檢測(cè)純度后，調(diào)至20 ng/μL備用。

(2)SRAP體系的建立

優(yōu)化Li等已發(fā)表的SRAP反應(yīng)體系[21]，擴(kuò)增程序?yàn)?4℃ 3 min，94℃ 1 min，37℃ 1 min，72℃ 2 min，5個(gè)循環(huán)；94℃ 1 min，50℃ 1 min，72℃ 2 min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min[15]。擴(kuò)增后的產(chǎn)物用聚丙烯酰胺凝膠電泳法進(jìn)行分離(電泳條件：恒定功率85 W，預(yù)電泳30 min，電泳時(shí)間2 h)，銀染。

(3)遺傳穩(wěn)定性

合成30對(duì)SRAP引物，對(duì)保存前后胡楊莖尖的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，分析其遺傳穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 蔗糖濃度和預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)胡楊莖尖存活率的影響

研究表明，未經(jīng)蔗糖預(yù)培養(yǎng)的胡楊莖尖冰凍后存活率為0。隨著蔗糖濃度的升高，冰凍后莖尖存活率逐漸升高，當(dāng)蔗糖濃度為0.8 mol/L時(shí)，莖尖存活率最高，當(dāng)蔗糖濃度升高至1 mol/L時(shí)，胡楊莖尖冰凍前后存活率均開始下降。圖1

注：包埋后莖尖預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為24 h，經(jīng)玻璃化保護(hù)液A處理20 min

Note: The dormant shoot tips was precultured for 24 h, and was treated by vitrification solution A for 20 min

圖1 預(yù)培養(yǎng)中不同蔗糖濃度下胡楊休眠莖尖存活率變化
Fig.1 Effect of sucrose concentration on the survival rate of dormant shoot tips in preculture

研究表明，未經(jīng)冰凍的莖尖預(yù)培養(yǎng)48 h后，存活率大幅下降。冰凍后的莖尖，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，莖尖存活率逐漸升高，預(yù)培養(yǎng)24 h后，莖尖存活率最高為67%。預(yù)培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)至48 h，莖尖冰凍后存活率則開始下降。圖2

2.2 不同玻璃化保護(hù)液處理不同時(shí)間對(duì)胡楊莖尖存活率的影響

研究表明，玻璃化保護(hù)液處理是保證冰凍莖尖存活的關(guān)鍵因素。未經(jīng)玻璃化保護(hù)液處理的莖尖冰凍后全部死亡。不同的玻璃化保護(hù)液對(duì)莖尖的毒性也不相同。因此，不同的玻璃化保護(hù)液處理的時(shí)間也有較大差別。玻璃化保護(hù)液A和玻璃化保護(hù)液B隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，莖尖存活率逐漸升高，處理30 min后莖尖存活率最高，分別為68%和77%。而玻璃化保護(hù)液C和玻璃化保護(hù)液E在處理20 min存活率達(dá)到最高分別為43%和17%。玻璃化保護(hù)液D在處理40 min后才達(dá)到最高存活率35%。無(wú)論是那種玻璃化保護(hù)劑，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，存活率都開始下降。圖3

注：蔗糖濃度為0.8 mol/L，經(jīng)玻璃化保護(hù)液A處理20 min

Note: The concentration of sucrose was 0.8 mol/L, and was treated by vitrification solution A 20 min

圖2 不同預(yù)培養(yǎng)時(shí)間下胡楊休眠莖尖存活率變化
Fig.2 Effect of preculture time on the survival rate of dormant shoot tips

注：0.8 mol/L蔗糖預(yù)培養(yǎng)24 h

Note: 0.8 mol/L sucrose preculture 24 h

圖3 不同玻璃化保護(hù)液處理時(shí)間下胡楊休眠莖尖存活率變化
Fig.3 Effect of different vitrification solution and treatment time on survival rate of dormant shoot-tips

2.3 冷凍保存后胡楊莖尖存活率的計(jì)算及遺傳穩(wěn)定性評(píng)估

2.3.1保存后胡楊莖尖存活率的計(jì)算

將胡楊莖尖化凍經(jīng)暗恢復(fù)24 h后于光下進(jìn)行培養(yǎng)，前6 d內(nèi)未見有形態(tài)顏色的變化7 d時(shí)部分變?yōu)楹稚?，一部分未見變化?5 d后存活莖尖轉(zhuǎn)變?yōu)榫G色，即可計(jì)算其存活率。30 d即可見到的形成，即可進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)。冰凍前后胡楊莖尖的在形態(tài)上完全沒有差別。圖4

2.3.2 遺傳變異的檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)利用30條SRAP引物對(duì)超低溫保存后胡楊莖尖進(jìn)行了遺傳穩(wěn)定性分析，各SRAP 引物的擴(kuò)增結(jié)果，可以看出，遺傳穩(wěn)定性未發(fā)生變異。圖5

注：(a)冰凍前；(b)冰凍后

Note: (a) before freezing; (b) after freezing

圖4 冰凍前和冰凍后的休眠莖尖
Fig.4 The dormant shoot tip of Populus euphratica before and after freezing was cultured 30 d

圖5 不同SRAP引物的擴(kuò)增結(jié)果
Fig.5 The results of different SRAP primers amplification map

3 討 論

低溫鍛煉和蔗糖預(yù)培養(yǎng)是決定超低溫保存后材料存活率的關(guān)鍵步驟。選取深冬休眠芽作為保存對(duì)象，因?yàn)椴牧弦呀?jīng)適應(yīng)室外寒冷的氣候，因此，可以省去低溫鍛煉。蔗糖預(yù)處理可以減少自由水含量，避免冰凍時(shí)產(chǎn)生冰晶。蔗糖預(yù)培養(yǎng)時(shí)蔗糖濃度和預(yù)培養(yǎng)時(shí)間是決定保存后存活率的關(guān)鍵因素。不同植物對(duì)蔗糖濃度和預(yù)培養(yǎng)時(shí)間的耐受力不同。對(duì)高等植物莖尖一般選用0.3～0.8 mol/L的蔗糖濃度，培養(yǎng)時(shí)間為24 h或者高于24 h[6,10,22]。對(duì)灰楊(PopuluspruinosaSchrenk)莖尖采用包埋玻璃化法進(jìn)行液氮保存時(shí)，用0.8 mol/L蔗糖溶液預(yù)培養(yǎng)24 h獲得了較好的存活率[13]。而采用玻璃化保存白楊(PopulusalbaL.)莖尖時(shí)則采用0.09%的蔗糖MS培養(yǎng)基，在5℃條件下預(yù)培養(yǎng)48 h，保存效果較好[23]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，胡楊與灰楊莖尖的處理?xiàng)l件相似，即用0.8 mol/L蔗糖溶液預(yù)培養(yǎng)24 h獲得了較好的存活率。包埋玻璃化法處理植物莖尖時(shí)應(yīng)采用比玻璃化法稍高的蔗糖溶液，培養(yǎng)時(shí)間則可以稍短。

玻璃化保護(hù)液的選擇是提高莖尖存活率的關(guān)鍵因素。玻璃化保護(hù)液可以使材料脫水，并使材料發(fā)生玻璃化轉(zhuǎn)變，進(jìn)入玻璃化狀態(tài)，避免產(chǎn)生冰晶對(duì)材料造成傷害。玻璃化保護(hù)液分為兩種：一種為低分子中性物質(zhì)，可以進(jìn)入細(xì)胞使溶液粘性增加，為滲透性保護(hù)劑，例如甘油、二甲基亞砜等；一種為大分子物質(zhì)，溶于水后不能進(jìn)入細(xì)胞，為非滲透性保護(hù)劑例如蔗糖、聚乙二醇等[4,8,9,10]。已有的研究結(jié)果表明，不同的玻璃化保護(hù)液的保護(hù)作用具有協(xié)同和累加效應(yīng)，但是其毒性不累加[4,9]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，非滲透性保護(hù)劑與滲透性保護(hù)劑搭配使用效果較好。在五種玻璃化保護(hù)液配方中，B配方處理后的莖尖冰凍后存活率最高為77%。同其它保護(hù)液相比，B配方中滲透性保護(hù)液含量較少，可能對(duì)材料的毒害作用較少。對(duì)灰楊的研究結(jié)果亦表明經(jīng)B配方處理的莖尖冰凍后存活率較高。五種保護(hù)液配方中，E保護(hù)液配方簡(jiǎn)單，只有甘油和蔗糖組成，用玻璃化保護(hù)液E處理的材料存活率較低，只有17%，該結(jié)果進(jìn)一步表明，玻璃化保護(hù)液混合使用效果較好。

保存植物種質(zhì)資源時(shí)，保持DNA的遺傳穩(wěn)定性是十分重要的。因此對(duì)保存后的材料需要進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)。目前對(duì)保存后材料的遺傳穩(wěn)定性評(píng)價(jià)一般采用分子標(biāo)記的方法，例如ISSR、RAPD 和AFLP 等。研究結(jié)果表明，超低溫保存同其它植物種質(zhì)保存方法相比有較好的遺傳穩(wěn)定性[6,17,18]。相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性(Sequence-related amplified polymorphism，SRAP)是一種顯性分子標(biāo)記技術(shù)，具有簡(jiǎn)便高效、高共顯性等特點(diǎn)[21]。實(shí)驗(yàn)采用SRAP對(duì)保存前后的材料進(jìn)行了遺傳穩(wěn)定性分析，未發(fā)現(xiàn)變異。

4 結(jié) 論

采用包埋玻璃化法在液氮中保存珍稀瀕危植物胡楊的深冬休眠芽是可行的。深冬休眠芽已經(jīng)經(jīng)過(guò)抗寒鍛煉，因此可以不經(jīng)低溫馴化直接保存。保存前對(duì)材料的處理是十分必要的，蔗糖預(yù)培養(yǎng)時(shí)采用0.8 mol/L的蔗糖溶液預(yù)培養(yǎng)24 h可以獲得較好的效果。玻璃化保護(hù)液應(yīng)混合使用，同時(shí)應(yīng)適量增加非滲透性玻璃化保護(hù)液的比例。冰凍后的材料未經(jīng)愈傷組織，直接成芽。對(duì)保存后的材料進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性分析，未發(fā)現(xiàn)變異。該方法是保存胡楊種質(zhì)資源的較好方法。

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