劉曉婷，朱曉慶，馬 昭，喬彥杰，張保軍，谷新利，商云霞

(石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子 832003)

0 引 言

【研究意義】禽流行性感冒(Avian Iafluenza，AI)簡(jiǎn)稱(chēng)禽流感，是由 A 型流感病毒引起的烈性傳染病，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)列為 A 類(lèi)傳染病[1]，我國(guó)將禽流感列為重大動(dòng)物疫病和一類(lèi)傳染病[2]。近年來(lái)，由于抗生素的濫用，禽流感病毒的變異及強(qiáng)毒株的出現(xiàn)等原因[3]，在家禽生產(chǎn)中普遍存在疫苗接種效果不佳或免疫失敗等問(wèn)題[4]。有臨床實(shí)踐表明，疫苗與免疫佐劑或免疫增強(qiáng)劑配合使用，是疫苗發(fā)揮良好防疫效果的有效手段之一[5,6]。中藥多糖是從中草藥中提取出的具有免疫增強(qiáng)[7]、抗感染[8]、抗病毒[9]、調(diào)節(jié)造血功能[10]等多種生物活性作用的成分之一，它毒副作用小，殘留量低，具有開(kāi)發(fā)成療效確定、性質(zhì)穩(wěn)定、毒副作用小的免疫增強(qiáng)劑的前景[11]。【前人研究進(jìn)展】多糖類(lèi)物質(zhì)是一種T細(xì)胞依賴(lài)性抗原，能被MHC II類(lèi)分子處理和呈遞，進(jìn)而被TCR識(shí)別，參與機(jī)體細(xì)胞免疫，亦能有效激活B淋巴細(xì)胞，誘導(dǎo)特異性抗體產(chǎn)生[12]。主要組織相容性復(fù)合體(MHC)參與機(jī)體內(nèi)、外抗原的呈遞，影響機(jī)體對(duì)疾病的抵抗力，是動(dòng)物抗病育種的主要候選基因群之一[13]。有研究表明，雞MHC B-Lβ基因多態(tài)性對(duì)機(jī)體免疫反應(yīng)具有廣泛調(diào)節(jié)作用[14,15]，且與禽類(lèi)對(duì)傳染性疾病的抗性高度相關(guān)[16]。有關(guān)和禽流感病毒的相關(guān)性研究目前很少，Boonyanuwat等對(duì)泰國(guó)禽流感爆發(fā)中心的抗病型雞群和易感型雞群進(jìn)行單倍型驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)部分具有抗病性的泰國(guó)地方雞種得以存活，其抗病特性與免疫遺傳有關(guān)，特別是與MHC I類(lèi)和MHC II類(lèi)分子有關(guān)，MHC可作為與禽流感抗病相關(guān)的候選基因，也可作為提高雞流感抗病性的遺傳標(biāo)記[17]。【本研究切入點(diǎn)】由于雞MHCB-LβII基因的多態(tài)性的存在，使得MHC II類(lèi)分子接納與遞呈抗原肽有一定的選擇性，導(dǎo)致不同基因型個(gè)體對(duì)同一抗原表現(xiàn)出免疫應(yīng)答強(qiáng)弱的差異。而中醫(yī)藥自古講求用藥個(gè)體化，因此中藥多糖作為調(diào)節(jié)機(jī)體免疫的外源性抗原之一，根據(jù)機(jī)體遺傳變異的特性給予不同劑量的中藥多糖，對(duì)保障疫苗效力、增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體免疫力及提高其存活率有著重要意義?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】試驗(yàn)擬排除因MHCB-LβII基因多態(tài)性而導(dǎo)致的不同基因型個(gè)體免疫應(yīng)答能力的差異，確定中藥復(fù)方多糖對(duì)蛋雞禽流感免疫效果的影響，為中草藥復(fù)方多糖在蛋雞重大動(dòng)物疫病防治工作方面提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 藥物

中藥復(fù)方多糖由石河子大學(xué)中獸醫(yī)學(xué)研究室提供。復(fù)方由當(dāng)歸、黨參、川芎、熟地、山楂、何首烏、淫羊藿、麥冬、茯苓、補(bǔ)骨脂與黃芪11味中藥按一定配比組成，經(jīng)水提-醇沉法得到中藥復(fù)方多糖粗提物后，再由AB-8大孔吸附樹(shù)脂吸附解吸附，最終得到質(zhì)量百分比濃度為77.10%的精制復(fù)方多糖。用滅菌超純水將復(fù)方多糖配制成50 mg/mL(高劑量)、25 mg/mL(中劑量)、12.5 mg/mL(低劑量)3個(gè)質(zhì)量濃度，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑

雞新城疫病毒(La Sota株)、傳染性支氣管炎病毒(M41株)二聯(lián)滅活疫苗，購(gòu)自普萊柯生物工程股份有限公司；雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗(La Sota 株+H120株)及雞傳染性法氏囊病活疫苗(B87株)均購(gòu)自哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司；禽流感二價(jià)滅活疫苗(H5N1 Re-6株+H9N2 Re-2株)、禽流感H9亞型血凝抑制試驗(yàn)抗原、禽流感病毒H9亞型陽(yáng)性血清均購(gòu)自哈爾濱維科生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司；禽流感病毒H5亞型血凝抑制試驗(yàn)抗原(Re-6株)，青島易邦生物工程有限公司；禽流感H5亞型血凝抑制試驗(yàn)陽(yáng)性血清、SPF雞陰性血清均購(gòu)自青島立見(jiàn)診斷技術(shù)發(fā)展中心。

1.2 方 法

1.2.1 試驗(yàn)動(dòng)物及分組

500羽1日齡京紅1號(hào)蛋雞，購(gòu)自新疆昌吉市某孵化場(chǎng)。根據(jù)MHCB-LβII基因第2外顯子PCR-SSCP的檢測(cè)結(jié)果分組，再將各組分為高、中、低劑量中藥多糖組和空白對(duì)照組。分別于8日齡肌肉注射50、25、12.5 mg/mL的中藥復(fù)方多糖和生理鹽水，每只0.2 mL，連續(xù)注射7 d。

所用試驗(yàn)雞1日齡馬立克疫苗噴霧免疫(于孵化場(chǎng)進(jìn)行)，7日齡新、傳二聯(lián)活疫苗點(diǎn)眼免疫，21日齡新、傳二聯(lián)活疫苗點(diǎn)眼與新、傳二聯(lián)滅活苗肌注免疫，14日齡法氏囊疫苗滴口免疫，28日齡禽流感二聯(lián)滅活苗免疫。在相同條件下常規(guī)飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件、營(yíng)養(yǎng)水平和飼養(yǎng)管理均一致，飼養(yǎng)期為7周，整個(gè)試驗(yàn)期雞群健康狀況良好。

1.2.2 PCR-SSCP基因型檢測(cè)1.2.2.1 基因組DNA的提取

翅下靜脈采血0.2 mL/羽，置于肝素鈉抗凝采血管中搖勻，-20℃冷凍保存。用血液基因組DNA提取試劑盒提取DNA，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中收錄的雞MHC B-LβⅡ基因序列(NO.M29763.1)，應(yīng)用Oligo軟件設(shè)計(jì)引物，引物序列為：上游引物：5’-AAACCGACCGTCTGGCGTGCTA-3’，下游引物：5’-TTACCCCACGCCTGGCTGAT-3’，擴(kuò)增片段238 bp，引物由華大基因科技股份有限公司合成。

1.2.2.3 PCR擴(kuò)增

1.2.2.4 PCR-SSCP分析及序列測(cè)定

取3 μL PCR產(chǎn)物加7 μL 變性上樣緩沖液(98%去離子甲酰胺、10 mmol /L EDTA (pH 8.0)、0.05%溴酚藍(lán))，98℃變性10 min，變性結(jié)束后迅速置于冰上冰浴10 min。用10%聚丙烯酰胺凝膠(Acr∶Scr=29∶1)電泳檢測(cè)，300 V電壓預(yù)電泳10 min，120 V電泳14 h后，固定、銀染、顯色，判定基因型，拍照保存。各取3個(gè)不同基因型個(gè)體的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，送華大基因科技股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，對(duì)PCR-SSCP分型結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證。

1.2.2.5 檢測(cè)項(xiàng)目

每組隨機(jī)抽取5只試驗(yàn)雞，于27、35、42、49日齡翅下靜脈采集非抗凝血3 mL，37℃靜置1 h，分離血清，用微量血凝抑制試驗(yàn)(HI)檢測(cè)血清中H5與H9亞型禽流感抗體效價(jià)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和多重比較，數(shù)據(jù)以“x±SD”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

用所設(shè)計(jì)的引物對(duì)基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，取所得PCR產(chǎn)物5 μL于2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)，擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果表明，所設(shè)計(jì)引物的擴(kuò)增結(jié)果較好，片段長(zhǎng)度與預(yù)期238 bp大小一致，條帶清晰、無(wú)非特異性條帶，可直接進(jìn)行SSCP分析。圖1

注：M，Trans DNA Marker I；1～7，MHCB-LβIIPCR擴(kuò)增產(chǎn)物

Note: M, Trans DNA Marker I; 1-7, PCR products ofMHCB-LβII

圖1 MHC B-LβⅡ的PCR擴(kuò)增結(jié)果
Fig.1 The PCR amplification results of MHC B-LβII

2.2 SSCP檢測(cè)

對(duì)所有DNA樣本的PCR產(chǎn)物進(jìn)行SSCP多態(tài)性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)所擴(kuò)增片段有3種基因型，分別定義為AA (103羽)、BB(266羽)和BC(131羽)。圖2

注：1、6、8、10：BC型；2、4、7、9：BB型；3、5：AA型

Note: 1、6、8、10:BCgenotype; 2、4、7、9:BBgenotype; 3、5;AAgenotype

圖2 部分試驗(yàn)雞MHC B-LβⅡ基因型的PCR-SSCP檢測(cè)
Fig.2 PCR-SSCP detection of MHC B-LβⅡ genotype in partial hen

2.3 中藥復(fù)方多糖對(duì)不同MHC B-LβⅡ基因型H5亞型禽流感抗體效價(jià)的影響

研究表明，免疫前各劑量中藥復(fù)方多糖組H5N1 Re-6母源抗體平均效價(jià)高于對(duì)照組，且高劑量組AA和BC型雞血清H5N1母源抗體效價(jià)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。AA基因型雞中，免疫后7 d，高、中、低三個(gè)劑量組的H5亞型禽流感抗體效價(jià)均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；免疫后14～21 d，中藥復(fù)方多糖組的抗體效價(jià)略高于對(duì)照組，但無(wú)顯著性差異(P>0.05)。BB基因型雞中，高劑量和中劑量組的H5亞型禽流感抗體效價(jià)較高于對(duì)照組，但無(wú)顯著性差異(P>0.05)。BC基因型雞中，免疫后7 d，高劑量組顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，而中、低劑量組僅略高于對(duì)照組，但無(wú)顯著性差異(P>0.05)；免疫后14 d，各組間無(wú)顯著差異(P>0.05)；免疫后21 d，高、中劑量組顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，而低劑量組僅略高于對(duì)照組，但無(wú)顯著性差異(P>0.05)。表1

表1 中藥復(fù)方多糖下不同MHC B-LβⅡ基因型京紅1號(hào)蛋雞H5亞型禽流感抗體效價(jià)
Table 1 Effects of Chinese Herbal Compound Polysaccharides on Antibody titers of H5 Subtype Avian Influenza in Different MHC B-LβⅡ Genotypes of Jinghong 1 layer

log2

注：同基因型組中，同列數(shù)據(jù)不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)，下同

Notes:In the same genotype group,different lowercase lettters in the same column mean significant difference(P<0.05).The same as below

2.4 中藥復(fù)方多糖對(duì)不同MHC B-LβⅡ基因型雞H9亞型禽流感抗體效價(jià)的影響

研究表明，免疫前各劑量中藥復(fù)方多糖組H9N2母源抗體平均效價(jià)均高于對(duì)照組，且高劑量組AA和BC型雞血清H9N2母源抗體效價(jià)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。AA基因型雞中，免疫后7 d，高、中、低三個(gè)劑量組H9亞型禽流感抗體效價(jià)均略高于對(duì)照組，但無(wú)顯著性差異(P>0.05)；免疫后14 d，高、中劑量組抗體效價(jià)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，且提前一周達(dá)到7 log2；免疫后21 d，各組間無(wú)顯著差異。BB基因型雞中，除免疫后14 d中劑量組顯著高于對(duì)照組外(P<0.05)，其他日齡各劑量組抗體效價(jià)雖高于對(duì)照組，但無(wú)顯著性差異(P>0.05)。BC基因型雞中，高劑量組中母源抗體效價(jià)顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05)，免疫后7 d，各劑量中藥復(fù)方多糖組均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；免疫后14 d，中劑量組顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，高、低劑量組略高于對(duì)照組，但無(wú)顯著性差異(P>0.05)；免疫后21 d，高劑量組顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，中、低劑量組略高于對(duì)照組，但無(wú)顯著性差異(P>0.05)。表2

表2 中藥復(fù)方多糖下不同MHC B-LβⅡ基因型京紅1號(hào)蛋雞H9亞型禽流感抗體效價(jià)
Table 2 Effects of Chinese Herbal Compound Polysaccharides on Antibody titers of H9 Subtype Avian Influenza in Different MHC B-LβⅡ Genotypes of Jinghong 1 layer

log2

3 討 論

3.1 MHC B-LβⅡ基因多態(tài)性與蛋雞禽流感抗體效價(jià)的關(guān)聯(lián)性

由于MHC 分子的生物特異性和高度多態(tài)性，MHC B-L基因常被作為研究雞抗病能力的候選基因。吳春梅等[18]分析 MHC B-F區(qū)基因外顯子2的多態(tài)性與免疫性狀的相關(guān)性時(shí)，在來(lái)航蛋雞與北京油雞群體中均發(fā)現(xiàn)了多個(gè)SNPs位點(diǎn)與AI和ND抗體滴度相關(guān)，說(shuō)明 MHC B-F 區(qū)基因外顯子2與AI和ND抗原的抗體產(chǎn)生有著較強(qiáng)的相關(guān)性。劉立波等[19]研究了雞MHC B-Lexon2基因多態(tài)性和血清AI抗體滴度相關(guān)性，結(jié)果表明與AI抗體滴度相關(guān)的SNP位點(diǎn)有多個(gè)，且有多種優(yōu)勢(shì)單倍型。研究對(duì)京紅一號(hào)蛋雞MHC B-LβⅡ基因的多態(tài)性與蛋雞H5與H9亞型禽流感抗體效價(jià)進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)在免疫后7 d，H5與H9抗體在AA型組比BB和BC型組產(chǎn)生速度較快，而隨著免疫時(shí)間的增長(zhǎng)，BB和BC型組抗體效價(jià)產(chǎn)生的速度快于AA型組；在免疫后21 d， H9亞型禽流感抗體效價(jià)在BB型組的顯著高于AA和BC型組，而H5亞型禽流感抗體效價(jià)在三個(gè)基因型組間并無(wú)顯著差異，這提示MHC B-LβⅡ基因多態(tài)性與機(jī)體產(chǎn)生禽流感H5與H9抗體的能力可能具有一定的相關(guān)性，MHC B-Lβ Ⅱ基因的多態(tài)性會(huì)引起機(jī)體對(duì)禽流感疫苗產(chǎn)生免疫應(yīng)答能力的個(gè)體差異。

3.2 中藥復(fù)方多糖對(duì)不同MHC B-LβⅡ基因型蛋雞禽流感抗體效價(jià)的影響

近年來(lái)許多研究發(fā)現(xiàn)，中藥多糖，特別是由補(bǔ)益類(lèi)中草藥中提取的多糖具有增強(qiáng)機(jī)體免疫能力，從而提高機(jī)體抗病力的作用?？贵w效價(jià)是監(jiān)測(cè)機(jī)體免疫狀況、抗感染能力的一項(xiàng)重要指標(biāo)，一般機(jī)體抗體效價(jià)的高低可以直接地反應(yīng)機(jī)體體液免疫的強(qiáng)弱。劉永華等[20]研究表明，一定范圍內(nèi)的高劑量牛膝多糖能夠提高雛雞的禽流感抗體滴度，對(duì)雛雞禽流感免疫有一定的促進(jìn)作用。劉昭等[21]在雛雞飼料中添加不同劑量的生地提取物，連續(xù)給藥一周，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同劑量的生地提取物均可有效增強(qiáng)H9亞型禽流感疫苗的免疫效果，且以中劑量效果最佳。李星艷等[22]在研究復(fù)方中藥多糖、黃芪多糖、當(dāng)歸多糖、淫羊藿多糖對(duì)禽流感抗體效價(jià)的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)復(fù)方中藥多糖可提高雛雞H5亞型禽流感抗體效價(jià)，且效果優(yōu)于其它單味藥多糖組。研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比不同劑量的中藥復(fù)方多糖均能提高各基因型組蛋雞血清中H5和H9亞型禽流感抗體效價(jià)，且對(duì)H9亞型的敏感度要優(yōu)于H5亞型，與劉昭和李星艷等結(jié)果一致。與此同時(shí)，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)除同一時(shí)間同一劑量中藥復(fù)方多糖對(duì)不同基因型的兩種抗體效價(jià)影響不同外，同一時(shí)間不同劑量中藥復(fù)方多糖對(duì)同一基因型的兩種抗體效價(jià)影響也不相同。其中，在免疫后7 d，高、中、低三個(gè)劑量的復(fù)方多糖均可顯著提高AA型組的H9亞型禽流感抗體效價(jià)與BC基因型組的H5亞型禽流感抗體效價(jià)，而對(duì)BB基因型組的H5和H9亞型禽流感抗體效價(jià)雖均有提高，但并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在免疫后14 d，高劑量中藥復(fù)方多糖能夠顯著提高AA型組的H9亞型禽流感抗體效價(jià)，中劑量中藥復(fù)方多糖能夠顯著提高AA、BB和BC型組的H9亞型禽流感抗體效價(jià)，高、中、低三個(gè)劑量的復(fù)方多糖對(duì)AA、BB和BC三個(gè)基因型的H5亞型禽流感抗體效價(jià)雖均有提高，但并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。出現(xiàn)這一現(xiàn)象的可能原因是MHC B-LβⅡ基因多態(tài)性使機(jī)體存在免疫應(yīng)答能力的個(gè)體差異，導(dǎo)致同一時(shí)間段內(nèi)中藥復(fù)方多糖對(duì)提高機(jī)體血清中AI抗體效價(jià)的最適基因型不同；另一方面可能是由于不同MHC B-LβⅡ基因型雞的免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)對(duì)中藥復(fù)方多糖這種外來(lái)抗原在數(shù)量與濃度上存在敏感性的差異，過(guò)高或過(guò)低的中藥多糖均不會(huì)產(chǎn)生較好的免疫應(yīng)答，從而引起抗體效價(jià)的差異；另外，可能也與中藥復(fù)方多糖在機(jī)體內(nèi)的代謝過(guò)程有關(guān)，在此過(guò)程中多糖被降解成寡糖、低聚糖等小分子形式被MHC class Ⅱ類(lèi)分子提呈給T細(xì)胞而發(fā)揮免疫效應(yīng)，多糖濃度的不同與機(jī)體對(duì)多糖降解、吸收和代謝速度的不同，多糖在體內(nèi)被降解成小分子糖的種類(lèi)和數(shù)量的不同，以及不同機(jī)體MHC classⅡ類(lèi)分子提呈多糖分子數(shù)量和能力的不同，這多方面的作用導(dǎo)致機(jī)體血清中AI抗體效價(jià)不同。

4 結(jié) 論

蛋雞MHC B-LβⅡ基因的多態(tài)性與機(jī)體產(chǎn)生禽流感抗體效價(jià)的能力可能具有一定的相關(guān)性，它能引起機(jī)體對(duì)禽流感疫苗產(chǎn)生免疫應(yīng)答能力的個(gè)體差異。通過(guò)對(duì)不同MHC B-LβⅡ基因型雞H5及H9亞型禽流感抗體效價(jià)變化的比較，證明了肌注不同劑量的中藥復(fù)方多糖可以不同程度的提高各基因型組蛋雞血清中H5和H9亞型禽流感抗體效價(jià)，但整體上對(duì)H9亞型的敏感度要優(yōu)于H5亞型，且中劑量和高劑量中藥復(fù)方多糖的效果好。

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