哈力旦·依克熱木，周安定，蘆 靜，曹俊梅，劉聯(lián)正，張新忠

(新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】小麥?zhǔn)切陆钪饕募Z食作物之一，小麥粉的主要成分為淀粉，由直鏈和支鏈淀粉組成，二者的含量是影響小麥面條品質(zhì)的重要因素之一[1-3]；Waxy蛋白亞基是通過(guò)對(duì)小麥籽粒中直鏈淀粉含量在一定程度上影響以面粉為原料面條的食品品質(zhì)[4-6], 分析和鑒定Wx蛋白亞基在新疆現(xiàn)有小麥品種和骨干親的分布規(guī)律，對(duì)選育和改良優(yōu)質(zhì)面條小麥品種具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來(lái)淀粉特性與小麥面制品品質(zhì)的關(guān)系已成為各國(guó)研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域之一[7-9]，國(guó)內(nèi)外對(duì)小麥糯蛋白(Waxy蛋白)和糯基因(Waxy 基因)進(jìn)行了一系列研究，普通小麥含有Wx-A1、Wx-B1和Wx-D1 等3種 Wx 蛋白亞基，其基因分別位于染色體 7AS、4AL 和 7DS 上[10-12]，研究表明，Wx 蛋白缺失可降低小麥直鏈淀粉含量導(dǎo)致淀粉糊化和膨脹特性的改變影響面條品質(zhì)[13-15]，缺失個(gè)別或全部Wx蛋白都會(huì)影響小麥籽粒的直鏈淀粉含量； 在3種Wx蛋白中，Wx-B1蛋白缺失(Wx-Blb)對(duì)直鏈淀粉合成的影響最大，Wx-A1蛋白缺失(Wx-Alb) 對(duì)直鏈淀粉合成的影響最小；缺失Wx-B1亞基的小麥品種的直鏈淀粉含量低具有良好的面條品質(zhì)[16-17]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】新疆是重要的小麥生產(chǎn)基地 ，新疆育種者主要以產(chǎn)量和蛋白品質(zhì)為研究著眼點(diǎn)，幾乎未對(duì)小麥的淀粉品質(zhì)進(jìn)行深入研究，因此對(duì)新疆小麥材料在Wx等位基因的變異與分布情況不甚清楚。但多數(shù)育種者對(duì)自己掌握的小麥種質(zhì)資源的矮稈基因及組成類型尚不清楚，在小麥育種過(guò)程中，存在著一定的盲目性。利用已開(kāi)發(fā)的Wx-A1、Wx-B1和Wx-D1分子標(biāo)記，對(duì)新疆小麥育種品種材料淀粉品質(zhì)基因Wx-A1、Wx-B1和Wx-D1進(jìn)行鑒定和評(píng)價(jià)，了解和分析為新疆小麥品質(zhì)資源中Wx-A1、Wx-B1和Wx-D1的分布情況。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】鑒定和評(píng)價(jià)新疆小麥品種材料中Wx基因類型，了解Wx-A1、Wx-B1和Wx-D1的分布狀況和變異類型，篩選出一些Wx基因缺失的育種材料，為該區(qū)選育優(yōu)質(zhì)面條小麥品種提供理論依據(jù)和快速有效的方法，為新疆選育優(yōu)質(zhì)面條小麥品種奠定基礎(chǔ)。提高小麥淀粉品質(zhì)評(píng)價(jià)和選育的效率。

1 材料與方法

1.1 材 料

所用小麥材料均來(lái)自新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所小麥課題組，共169份，冬小麥品種75份，春小麥品種94份，其中新疆當(dāng)?shù)仄贩N25份，其他國(guó)內(nèi)內(nèi)地品種46份，下同，國(guó)外品種98份。

1.2 方 法

1.2.1 基因組DNA提取

用CTAB方法，葉片(約1～2 g)充分研磨后分別放入2.0 mL離心管；加入1.0 mL CTAB提取液(20 g CTAB，1M Tris-HCl(pH 8.0)100 mL，0.5M EDTA(pH 8.0)100 mL，5 M NaCl 280 mL)，用蒸餾水定容至1 000 mL，滅菌后加 β-巰基乙醇至10 mM)，置于65℃水浴30 min,水浴過(guò)程中混勻數(shù)次；然后在4℃下12 000 r/min離心15 min；移上清至一新的2.0 mL離心管中，加入等體積的酚/氯仿(1∶1)，輕搖5～10 min；4℃下12 000 r/min，離心15 min；移上清至一新的1.5 mL離心管中，加入等體積的氯仿/異戊醇(24∶1)，輕搖5～10 min；4℃下12 000 r/min，離心10 min；移上清至一新的1.5 mL離心管中，加入0.6倍體積的異丙醇沉淀DNA，置于-20℃冰箱30 min；4℃下12 000 r/min，離心15 min，去上清，加0.5 mL乙醇(70%)，靜置5 min；4℃下12 000 r/min，離心5 min，去乙醇(70%)，室溫干燥后，溶于400 μL的1×TE中備用。

1.2.2 特異性分子標(biāo)記引物序列(5’～3’)

利用劉迎春等[18]開(kāi)發(fā)的Wx-A1，Wx-D1標(biāo)記 F-5′CCAAAGCAAAGCAGGAAACC R-3′TACCTCGGAGATGACGCTGG、F-5′CGAGCGGCTACTCAAGAGC、R-3′GGCGGTCATCTGTCATTTCC Nakamura等[19]研發(fā)的Wx-B1標(biāo)記 F-5′ CTGGCCTGCCTACCTCAAGAGCAACT ,

R- 3′ CTGACGTCCATGCCGTTGACGA。 PCR體系20 μL，含模版DNA 3 μL，TaqDNA polymerase(2.5 u/uL) 酶(北京天根生化科技公司)，上下游引物(5 μL/l)各1.0 μL，用ddH2O補(bǔ)充反應(yīng)體系至20 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min，94°變性30 s，56°退火1 min，72°延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分離，采用緩沖體系0.5×TBE溶液， 200 V電壓電泳45 min，0.5%溴化乙錠(Ethidium bromide，EB)染色10 min，蒸餾水漂洗后在GelDoc XR System成像系統(tǒng)上用紫外燈掃描成像并存入計(jì)算機(jī)。分析特異性條帶。

2 結(jié)果與分析

2.1 Wx-A1等位基因的類型分布

利用MAG264標(biāo)記檢測(cè)Wx-A1位點(diǎn)，可擴(kuò)增獲得2種片段，擴(kuò)增出336 bp片段的為野生型Wx-A1a，擴(kuò)增出317 bp片段的為突變型Wx-A1b；含有Wx-A1a基因的材料均能擴(kuò)增出336 bp片段，含有Wx-A1b基因的擴(kuò)增出317 bp的片段，擴(kuò)增出條帶清晰，以中國(guó)春為對(duì)照，重復(fù)性好。材料品種中Wx-A1a基因的頻率為74.56%，Wx-A1a基因類型在國(guó)內(nèi)品種占主位，頻率為84.78%。Wx-A1b基因的頻率為25.44%，在新疆品種占主位，頻率為44%。表1，圖1

注：M：DL 2000；1：新春34號(hào)；2：新春39號(hào)；3：新春14號(hào)；4：新春27號(hào);5：新春41號(hào);6：隴麥15號(hào);7：蘇麥3號(hào);8:隴17號(hào);9:dollar bird;10:阿夫;11:中國(guó)春

Note: M:DL2000; 1: Xinchun34; 2: Xinchun39; 3: Xinchun14; 4: Xinchun27; 5: Xinchun41; 6: Longmai15; 7: Sumai3; 8: Long17; 9: dollarbird; 10: Afu:; 11: Chinese spring

圖1 特異性 PCR標(biāo)記MAG264對(duì)供試材料的擴(kuò)增結(jié)果
Fig.1 PCR products amplified by specific PCR labeled MAG264 tested materials

2.2 Wx-B1等位基因的類型分布

利用Nakamura開(kāi)發(fā)的BDFL/BRD標(biāo)記， 檢測(cè)Wx-B1位點(diǎn)基因，攜帶Wx-B1a的材料能擴(kuò)出425 bp的片段，為野生型，不攜帶此片段的類型屬于Wx-B1b基因類型，為缺失突變型。對(duì)供試材料進(jìn)行檢測(cè)，有116份材料擴(kuò)增出425 bp的片段，為Wx-B1a基因類型，頻率為68.64%，Wx-B1a基因類型在國(guó)內(nèi)品種占主位，頻率為82.61%；Wx-B1b基因的頻率為31.36%，在新疆品種與國(guó)外品種占主位。表1，圖2

2.3 Wx-D1等位基因的類型分布

利用MAG269標(biāo)記，檢測(cè)Wx-D1等位基因。攜帶Wx-D1a的能擴(kuò)出1 400 bp的片段，Wx-D1b類型的能擴(kuò)出800 bp的片段。檢測(cè)中，Wx-D1a基因類型的比例為95.27%，新疆品種與國(guó)外品種占主位。Wx-D1b基因類型的比例為4.73%，其他國(guó)內(nèi)品種少部分帶此基因。材料品種的大部分帶Wx-D1a基因。表1，圖3

注：M:DL 2000；1:巴豐5號(hào);2:寧作6號(hào);3:寧春37號(hào):4:寧春4號(hào)；5：新冬12號(hào)；6：新冬16號(hào)；7：新冬2號(hào):；8：中國(guó)春

Note: M:DL 2000; 1: Bafeng5; 2: Ningzuo6; 3: Ningchun37; 4: Ningchun4; 5: Xindong12; 6: Xindong16; 7: Xindong2; 8: Chinese spring

圖2 特異性 PCR標(biāo)記BDFL/BRD對(duì)供試材料的擴(kuò)增結(jié)果
Fig.2 PCR products amplified by specific PCR labeled BDFL/BRD tested materials

注：M：DL 2000；1：農(nóng)大311；2：中優(yōu)9507；3:邯麥11；4:滄麥6002；5:新冬2號(hào)；6:新春13號(hào)；7:寧作6號(hào)；8:新春16號(hào)；9:敖德薩3號(hào)；10:中國(guó)春)

Note: M: DL 2000; 1: Nongda311; 2: Zhongyou9507; 3: Hanmai11; 4: Cangmai6002; 5: Xindong2; 6: Xinchun13; 7: Ningzuo6; 8: Xinchun16; 9: Aodesa3; 10: Chinese spring

圖3 特異性 PCR標(biāo)記MAG269對(duì)供試材料的擴(kuò)增結(jié)果
Fig.3 PCR products amplified by specific PCR labeled MAG269 tested materials表1 供試材料在Wx相關(guān)基因標(biāo)記的分布頻率
Table 1 Allelic frequencies for Wx genes in the materials tested by molecular markers

來(lái)源Origin材料數(shù)AccessionnumberWx-A1a(%)Wx-A1b(%)Wx-B1a(%)Wx-B1b(%)Wx-D1a(%)Wx-D1b(%)新疆當(dāng)?shù)仄贩NXinjianglocalcultivars25564464361000其他國(guó)內(nèi)品種OtherChinesecultivars46847815228261173982611739國(guó)外品種Overseacultivars9874492551632736731000合計(jì)Total16974562544686431369527473

2.4 冬春麥材料中Wx-A1、Wx-B1、Wx-D1基因類型的分布

在169份供試材料中，冬小麥75份，春小麥94份。Wx基因在冬春麥材料中分布不盡相同，缺失Wx-A1b基因類型在冬小麥材料中占18.67%，在春麥材料中占30.85%。缺失Wx-B1b基因類型在冬小麥材料中也是占18.67%，在春麥材料中占41.49%。缺失Wx-D1b基因類型在冬小麥材料中占10.67%，春麥材料中未檢測(cè)出此基因。研究表明：冬春小麥材料中，缺失突變類型基因Wx-A1b和Wx-B1b以春麥為主占主位?？梢?jiàn)，Wx基因的分布在冬春小麥材料中有一定的差異。圖4

圖4 冬、春小麥材料中Wx-A1、Wx-B1、Wx-D1基因分布
Fig.4 Frequency of Wx-A1、Wx-B1 and Wx-D1 genes in winter and spring wheat cultivars

3 討 論

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)對(duì)于Wx蛋白基因類型的分布及淀粉特性進(jìn)行了一定研究。研究表明，不同區(qū)域的小麥材料中，Wx蛋白亞基的類型和分布頻率差異很大[20-23]，研究鑒定的結(jié)果與其一致。而有研究也表明在日本、土耳其等國(guó)小麥品種材料中，缺失Wx-A1蛋白亞基的頻率較高，而在澳大利亞、意大利等國(guó)小麥品種材料中，Wx-B1蛋白亞基缺失的頻率高[23-26]；李式昭等[27]對(duì)澳白麥的Wx基因進(jìn)行了分析，在分析的小麥材料中Wx-B1缺失類型頻率為63.9%；小麥材料中Wx蛋白亞基缺失體的淀粉特性平均表現(xiàn)總體優(yōu)于非缺失體，澳白麥的優(yōu)質(zhì)面條品種都為Wx-B1蛋白亞基缺失類型[28]；對(duì)中國(guó)小麥材料的鑒定分析表明，則以Wx-B1蛋白亞基缺失為主，但Wx基因的缺失比例不高[23,25]。在研究中，小麥材料以Wx-B1蛋白亞基缺失為主，為31.67%，遠(yuǎn)低于澳白麥的缺失體比例；同時(shí)在鑒定材料中缺失Wx-A1、Wx-B1基因類型的品種有14份，其中4份為新疆品種，10份為國(guó)外品種, 同時(shí)缺失Wx-B1、Wx-D1基因類型的有3份，為國(guó)內(nèi)品種，25份新疆當(dāng)?shù)仄贩N中檢測(cè)到11份Wx-A1缺失類型，9份缺失類型Wx-B1蛋白亞基的材料，新疆小麥材料未發(fā)現(xiàn)Wx-D1蛋白亞基缺失類型，同時(shí)還檢測(cè)出8份不缺失Wx-A1、Wx-B1和Wx-D1三種蛋白亞基的材料；說(shuō)明研究檢測(cè)的小麥材料尤其是新疆小麥材料有其豐富的基因資源和遺傳多樣性， 因此，在選育優(yōu)質(zhì)面條品種時(shí)要重視Wx蛋白亞基缺失的利用，來(lái)起到對(duì)新疆小麥品種淀粉糊化特性的改良。

新疆小麥材料中未檢測(cè)出Wx-D1基因的突變類型。因Wx-D1基因的突變可以降低直鏈淀粉含量，可以提高膨脹體積、峰值粘度、進(jìn)而改進(jìn)面條的品質(zhì)；而對(duì)研究篩選到的材料，還需做進(jìn)一步淀粉特性的評(píng)價(jià)和研究，以了解其淀粉品質(zhì)表現(xiàn)，才能在糯性小麥育種中加以利用而提高選育效率。因此，在今后的小麥育種中，需要重視Waxy蛋白亞基的的引進(jìn)與利用，提高新疆材料中的Waxy蛋白亞基基因的突變類型，選育出優(yōu)質(zhì)的、適合于加工面條的優(yōu)質(zhì)小麥品種。

4 結(jié) 論

在冬、春小麥含有Wx-A1、Wx-B1、Wx-D1基因類型分布率有一定的差異。春麥Wx-A1基因突變類型的比例為30.85%，Wx-B1基因的突變類型比例為41.49%。冬麥的Wx-A1基因野生型突變型為18.67%，低于春麥。從小麥材料來(lái)源來(lái)看，新疆當(dāng)?shù)仄贩N的突變類型往往高于國(guó)內(nèi)、國(guó)外品種，含有Wx-A1、Wx-B1基因突變類型的比例分別為44%、36%，突變類型中占主位，表明新疆小麥的淀粉品質(zhì)良好。

新疆品種的缺失Wx-A1、Wx-B1、Wx-D1亞基突變頻率基本上高于其他地區(qū)的品種材料，在Waxy蛋白位點(diǎn)展示了獨(dú)特性，具有較為豐富的遺傳多樣性。Waxy蛋白亞基缺失的頻率大大增加，可篩選出各種變異類型，同時(shí)明確新疆小麥材料淀粉品質(zhì)基因類型，有助于提高優(yōu)質(zhì)面條品質(zhì)的選擇效率。

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