藺凌云，潘曉藝，袁雪梅，姚嘉赟，徐 洋，尹文林，沈錦玉

（浙江省淡水水產(chǎn)研究所，浙江省魚(yú)類(lèi)營(yíng)養(yǎng)與健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江湖州 313001）

1 淡水魚(yú)蝦主要細(xì)菌病

1.1 淡水魚(yú)主要細(xì)菌病

1.1.1 細(xì)菌性敗血?。ū┌l(fā)性出血?。?該病是危害最大、流行地區(qū)最廣、流行季節(jié)最長(zhǎng)、造成損失最嚴(yán)重的一種淡水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)急性傳染病。已報(bào)道的病原包括嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌和維氏氣單胞菌等[1-3]。根據(jù)以下臨床癥狀和病理變化，可初步作出診斷：病魚(yú)全身廣泛性充血、肛門(mén)紅腫，腹部膨大；肝、脾、腎、膽囊腫大充血，部分魚(yú)可見(jiàn)嚴(yán)重肌肉充血。

1.1.2 細(xì)菌性腸炎 這里的腸炎病專(zhuān)指腸道致病菌所引起的一種傳染性疾病，草魚(yú)和青魚(yú)最易發(fā)病。報(bào)道的病原有嗜水氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌和腸型點(diǎn)狀氣單胞菌等[4-5]。可根據(jù)以下兩點(diǎn)做出初步判斷：一是腸道充血發(fā)紅，尤以后腸段明顯，肛門(mén)紅腫、外突，腸腔內(nèi)有很多淡黃色黏液；二是從肝、腎或血中可以檢出產(chǎn)氣單胞菌。

1.1.3 細(xì)菌性爛鰓 此病發(fā)病季節(jié)長(zhǎng)，流行范圍廣，在各養(yǎng)殖階段都易發(fā)生，常造成大批魚(yú)種死亡。其病原為柱狀黃桿菌[6]。根據(jù)魚(yú)體發(fā)黑、鰓絲腫脹、黏液增多、鰓絲末端腐爛缺損、軟骨外露等癥狀，可進(jìn)行初步診斷。

1.1.4 鏈球菌病 該病是養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)重要的細(xì)菌性疾病之一，是近年來(lái)羅非魚(yú)的主要病害。其病原有海豚鏈球菌、無(wú)乳鏈球菌、副乳房鏈球菌和格氏乳球菌[7-8]。主要診斷依據(jù)為魚(yú)在水面做螺旋狀或旋轉(zhuǎn)游動(dòng)，身體呈“C”形或逗號(hào)形彎曲；慢性感染的魚(yú)以眼球突出、渾濁等癥狀作出初步診斷依據(jù)。

1.1.5 遲緩愛(ài)德華氏菌病 該病是由遲緩愛(ài)德華氏菌引起的魚(yú)類(lèi)和牛蛙等水生動(dòng)物疾病的統(tǒng)稱(chēng)?？筛鶕?jù)患病魚(yú)的癥狀和流行情況，作出初步診斷：用解剖針刺穿病魚(yú)病灶部位有膿狀物流出，腎臟和肝臟明顯腫大，并大多伴有膿腫病灶，肛門(mén)周?chē)t腫。

1.1.6 鮰類(lèi)腸敗血癥 鮰類(lèi)腸敗血癥是由鮰愛(ài)德華氏菌引起的一種細(xì)菌性疾病，臨床上以頭蓋穿孔或腸道敗血為特征，主要感染鮰科魚(yú)類(lèi)?？筛鶕?jù)病魚(yú)頭蓋穿孔、腸道敗血和其他內(nèi)臟器官有出血、壞死等典型癥狀作出初步診斷。

1.1.7 諾卡氏菌病 病魚(yú)大體上分為軀干結(jié)節(jié)和鰓結(jié)節(jié)2種類(lèi)型。諾卡氏菌可用選擇性培養(yǎng)基分離培養(yǎng)。另在病魚(yú)結(jié)節(jié)處取少許膿汁制成涂片，革蘭氏染色，如鏡檢發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性絲狀菌，可初步診斷。

1.2 淡水蝦主要細(xì)菌病

1.2.1 急性肝胰腺壞死病 2010年以來(lái)，該病在我國(guó)迅速擴(kuò)散，只要流行于亞太對(duì)蝦重要養(yǎng)殖區(qū)。目前，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為其病原為攜帶編碼毒素蛋白pirAB質(zhì)粒的特異弧菌，其中報(bào)道最多的是副溶血弧菌[9-11]。此外，歐文斯氏弧菌[12]、坎貝氏弧菌[13-14]及哈維氏弧菌進(jìn)化枝的成員[15]也可引起對(duì)蝦急性肝胰腺壞死病，這些弧菌均攜帶有編碼毒力蛋白pirA和pirB基因的質(zhì)粒。已建立的分子診斷技術(shù)，包括常規(guī) PCR[16-18]、qPCR[19]和 LAMP[20-21]，均是以該毒力蛋白基因?yàn)榘谢蜻M(jìn)行檢測(cè)的。也可采用TCBS平板培養(yǎng)觀察綠色菌落的數(shù)量，作為預(yù)測(cè)和初步診斷的手段。

1.2.2 螺原體病 近年來(lái)，在克氏原螯蝦、南美白對(duì)蝦、羅氏沼蝦及青蝦中相繼發(fā)現(xiàn)了螺原體感染的病例[22-24]。利用螺原體侵染血細(xì)胞后形成包涵體及病原體具游動(dòng)性的特點(diǎn)，通過(guò)光鏡可進(jìn)行快速診斷。

2 淡水魚(yú)蝦主要細(xì)菌病害診斷技術(shù)

2.1 基于病原菌生理生化特征的檢測(cè)方法

從發(fā)病魚(yú)蝦中分離病原細(xì)菌，通過(guò)培養(yǎng)物特征（菌落形態(tài)、菌體形狀等）及生理生化實(shí)驗(yàn)進(jìn)行細(xì)菌病害的初步診斷，是最常用和最基本的檢測(cè)方法。劉杰等[25]采用API 20 NE生理生化檢測(cè)試劑盒與16S rDNA基因序列比對(duì)，對(duì)導(dǎo)致黃顙魚(yú)暴發(fā)性流行病的病原進(jìn)行了鑒定，確定為嗜水氣單胞菌。

2.2 基于分子生物學(xué)技術(shù)的檢測(cè)方法

2.2.1 常規(guī)定性PCR檢測(cè)方法 該方法特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單，可快速識(shí)別檢測(cè)樣品中的微量病原菌，是水產(chǎn)病害快速檢測(cè)中應(yīng)用最為廣泛和成熟的方法，包括普通PCR、巢式PCR和多重PCR。Dangtip等[18]以副溶血弧菌毒力蛋白基因ToxA和ToxB為靶基因，建立了巢式PCR，可快速檢測(cè)引發(fā)對(duì)蝦急性肝胰腺壞死病的致病性副溶血弧菌，其靈敏度較一步法PCR提高了100倍。艾克特等[26]建立了一種以鮰愛(ài)德華氏菌Ser C基因、肺炎克雷伯菌Khe基因、遲鈍愛(ài)德華氏菌Muk F基因和嗜水氣單胞菌Hly A基因等為目的基因的多重PCR，檢測(cè)出患病黃鱔體內(nèi)感染的細(xì)菌主要是肺炎克雷伯菌和嗜水氣單胞菌。

2.2.2 實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR） 基 于 對(duì)PCR進(jìn)程進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)的實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，通過(guò)對(duì)水生動(dòng)物的細(xì)菌感染狀況定量分析，可為水生動(dòng)物細(xì)菌病害的早期預(yù)防和控制提供有力的科學(xué)依據(jù)。Su等[27]以無(wú)乳鏈球菌16-23S rRNA基因間隔區(qū)為靶序列，建立了檢測(cè)無(wú)乳鏈球菌的SYBR Green I qPCR，20 μL反應(yīng)體系中最低可檢測(cè)出8.6個(gè)拷貝的目的DNA。該方法為無(wú)乳鏈球菌在被感染魚(yú)體各器官中的分布及增殖情況提供了一種定量工具。

2.2.3 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP） 該方法在恒溫（65 ℃左右）條件下就可以完成核酸擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)果可直接肉眼觀察。目前，LAMP已被用于多種淡水魚(yú)蝦細(xì)菌病原的檢測(cè)，如嗜水氣單胞菌、遲緩愛(ài)德華氏菌、副溶血弧菌、海豚鏈球菌和無(wú)乳鏈球菌等。Zhou等[28]設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)的LAMP芯片，自動(dòng)化程度高，樣本及試劑用量少，30 min內(nèi)可同時(shí)檢測(cè)10種水產(chǎn)病原菌。與傳統(tǒng)的微生物學(xué)方法相比，該LAMP芯片的臨床靈敏度和特異性分別為96.2%和93.8%。

2.2.4 16S rRNA檢測(cè)技術(shù) 16S rRNA基因片段的分析方法主要有克隆測(cè)序、探針雜交和酶切片段多態(tài)性分析。目前，該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖細(xì)菌病原的檢測(cè)。王國(guó)良等[29]從患典型癥狀的烏鱧體內(nèi)分離病原菌，對(duì)其16S rRNA基因序列進(jìn)行測(cè)定，分析了相關(guān)細(xì)菌相應(yīng)序列的同源性，構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)。結(jié)果表明，該菌株的16S rRNA基因序列與諾卡氏菌屬的相似性達(dá)99.9%，據(jù)此鑒定菌株為鰤?mèng)~諾卡氏菌（Nocardia seriolea）。

2.2.5 核酸探針雜交法 利用特異性標(biāo)記DNA或RNA探針同病原微生物中與探針互補(bǔ)的靶核苷酸序列進(jìn)行雜交，以此確定宿主是否攜帶特定病原，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)和診斷快速等優(yōu)點(diǎn)。Soltani等[30]根據(jù)鏈球菌屬和乳球菌屬的16S rRNA保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增菌株靶序列，擴(kuò)增產(chǎn)物與預(yù)先標(biāo)記在膜上的特異性寡核苷酸探針進(jìn)行反向線(xiàn)點(diǎn)雜交、顯影。該技術(shù)能快速、敏感和特異地檢測(cè)海豚鏈球菌、無(wú)乳鏈球菌、副乳房鏈球菌和格氏鏈球菌4種常見(jiàn)水產(chǎn)病原細(xì)菌。

2.2.6 基因芯片技術(shù) 基于核酸雜交技術(shù)發(fā)展起來(lái)的基因芯片技術(shù)，適用于大規(guī)模、高通量的病害檢測(cè)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)多種靶基因的同時(shí)檢測(cè)。Shi等[31]根據(jù)細(xì)菌16S rDNA設(shè)計(jì)寡核苷酸探針構(gòu)建基因芯片，對(duì)包括副溶血弧菌、嗜水氣單胞菌和海豚鏈球菌在內(nèi)的8種常見(jiàn)魚(yú)類(lèi)病原菌進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，該方法與微生物常規(guī)培養(yǎng)和16S rRNA基因測(cè)序方法一致，適用于水產(chǎn)病害的初步診斷及水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)潛在病原菌的快速鑒定。

2.3 基于免疫學(xué)相關(guān)技術(shù)的檢測(cè)方法

2.3.1 免疫酶技術(shù) 該方法利用了抗原-抗體反應(yīng)的高度特異性和酶促反應(yīng)的高度敏感性，通過(guò)肉眼或顯微鏡觀察及分光光度計(jì)測(cè)定，達(dá)到病原鑒定及定量的目的。酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）和斑點(diǎn)雜交（Dot-ELISA）是目前應(yīng)用最廣泛的免疫酶技術(shù)。祝璟琳等[32]建立了無(wú)乳鏈球菌的間接ELISA快速檢測(cè)法，與海豚鏈球菌等其他常見(jiàn)水產(chǎn)病原菌無(wú)交叉反應(yīng)。不僅能夠檢測(cè)已發(fā)病的羅非魚(yú)，而且能夠檢測(cè)無(wú)癥狀的帶菌羅非魚(yú)，該方法的建立有助于快速準(zhǔn)確地診斷由無(wú)乳鏈球菌引起的羅非魚(yú)鏈球菌病。

2.3.2 免疫熒光技術(shù) 利用某些熒光素，通過(guò)化學(xué)方法與特異性抗體結(jié)合制成熒光抗體，產(chǎn)生熒光，借助熒光顯微鏡可檢測(cè)或定位被檢病原。王淑嫻等[33]通過(guò)不同顏色的量子點(diǎn)，標(biāo)記副溶血弧菌抗體和遲緩愛(ài)德華氏菌抗體，加入氧化石墨烯淬滅熒光，構(gòu)建了捕獲目標(biāo)細(xì)菌的探針。副溶血弧菌和遲緩愛(ài)德華氏菌的檢出限分別為1.5×104和2.1×104CFU/mL，在病原的早期診斷中具有良好的應(yīng)用潛質(zhì)。

2.3.3 膠體金免疫層析技術(shù) 該技術(shù)以膠體金為標(biāo)記物，利用特異的抗原抗體反應(yīng)來(lái)放大反應(yīng)，通過(guò)直接觀察顏色變化就可以判定結(jié)果，具有快速、簡(jiǎn)便、不需要專(zhuān)業(yè)儀器設(shè)備和結(jié)果肉眼可辨等優(yōu)點(diǎn)，適用于生產(chǎn)一線(xiàn)養(yǎng)殖戶(hù)臨床及現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。有學(xué)者針對(duì)淡水魚(yú)蝦主要病原菌制備了多種膠體金免疫層析試紙條，如嗜水氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌、遲緩愛(ài)德華氏菌、副溶血弧菌、柱狀黃桿菌和海豚鏈球菌等。

2.3.4 抗體芯片技術(shù) 抗體芯片多采用雙抗夾心法，將多種特異性抗體高密度、有序地固定在處理后的芯片載體上，用于捕獲待檢樣品中的靶抗原?？蓪?duì)多個(gè)樣品中的多種抗原進(jìn)行平行檢測(cè)，操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)結(jié)果肉眼可見(jiàn)。李永芹等[34]制備了針對(duì)6 株魚(yú)類(lèi)常見(jiàn)病原菌的檢測(cè)免疫芯片，可同時(shí)檢測(cè)鏈球菌、鰻弧菌、熒光假單胞菌、遲鈍愛(ài)德華氏菌、殺鮭氣單胞菌和海分支桿菌。

3 淡水魚(yú)蝦細(xì)菌病的防控技術(shù)

3.1 監(jiān)測(cè)預(yù)警防控技術(shù)

水產(chǎn)動(dòng)物病原快速檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，極大地促進(jìn)了水產(chǎn)動(dòng)物重大疫病的監(jiān)測(cè)和預(yù)警工作。目前，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部已啟動(dòng)了國(guó)家水生動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)管理系統(tǒng)，加強(qiáng)了對(duì)重大疫病的監(jiān)測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查，根據(jù)各地上傳的監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)自動(dòng)按照預(yù)警級(jí)別分析形成預(yù)警數(shù)據(jù)。各地可根據(jù)預(yù)警級(jí)別有針對(duì)性地采取相應(yīng)預(yù)防措施。

3.2 免疫防控技術(shù)

免疫防控是控制淡水魚(yú)蝦細(xì)菌性流行病最有效的方法。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，國(guó)外已批準(zhǔn)100余種針對(duì)24種水產(chǎn)病原魚(yú)類(lèi)的疫苗上市。我國(guó)魚(yú)類(lèi)疫苗的研究起步較晚，目前研制的針對(duì)大宗淡水魚(yú)類(lèi)的疫苗也有近20種，多種疫苗在實(shí)驗(yàn)室顯示出良好的免疫保護(hù)效果，部分疫苗進(jìn)入田間試驗(yàn)階段，其中嗜水氣單胞菌滅活疫苗已取得新獸藥證書(shū)。

免疫增強(qiáng)劑能夠提高魚(yú)體產(chǎn)生抗體的能力，同時(shí)也是有效增強(qiáng)魚(yú)蝦非特異性免疫力的有效方法。目前已開(kāi)發(fā)出脂多糖[35]、殼寡糖[36]和植物提取物[37]等免疫增強(qiáng)劑，部分在生產(chǎn)上得到了應(yīng)用。

3.3 藥物防控技術(shù)

目前，抗生素及某些化學(xué)藥物仍然是淡水魚(yú)蝦細(xì)菌病害防治的主要手段。抗生素在有效控制水產(chǎn)病害的同時(shí)，也帶來(lái)了病原菌耐藥性增強(qiáng)、藥物殘留和水產(chǎn)品質(zhì)量安全等問(wèn)題。因此，含有免疫活性物質(zhì)的中草藥[38]被不斷開(kāi)發(fā)運(yùn)用于水產(chǎn)病害的防治，如大蒜、大黃、五倍子、黃連和黃芩等。中草藥不僅具有抗菌、抗病毒和提高魚(yú)蝦免疫功能的作用，且毒性低、毒副作用少、不產(chǎn)生抗藥性，符合綠色漁藥的開(kāi)發(fā)要求，具有巨大的開(kāi)發(fā)前景。

3.4 生態(tài)防控技術(shù)

生態(tài)調(diào)控通過(guò)水質(zhì)調(diào)節(jié)、底質(zhì)改良和科學(xué)混養(yǎng)等措施，增加養(yǎng)殖環(huán)境的生物多樣性，提高養(yǎng)殖生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)的效率，為養(yǎng)殖動(dòng)物營(yíng)造穩(wěn)定、健康的生存和生長(zhǎng)環(huán)境。目前研究最多的是微生態(tài)技術(shù)[39]，通過(guò)在水體中投放有益微生物，主要是光合細(xì)菌、芽孢桿菌、放線(xiàn)菌、蛭弧菌、硝化和反硝化細(xì)菌等，改善水質(zhì)的理化因子、菌相和藻相，為養(yǎng)殖動(dòng)物創(chuàng)造了一個(gè)相對(duì)良好的生態(tài)環(huán)境。有益菌在水產(chǎn)動(dòng)物腸道內(nèi)的定植及新陳代謝產(chǎn)物也對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育起到了一定的促進(jìn)作用。

探索合適的生物防控因子，依據(jù)養(yǎng)殖動(dòng)物的食物鏈耦合效應(yīng)和不同生態(tài)位的配置，建立經(jīng)濟(jì)效益和病害防控同步提升的立體生態(tài)養(yǎng)殖模式。如在浙江一帶應(yīng)用成功的蝦鱉混養(yǎng)，利用中華鱉對(duì)病弱蝦的攝食，可有效防控南美白對(duì)蝦病害的發(fā)生[40]。

3.5 綜合防控技術(shù)

水產(chǎn)病害的發(fā)生是水環(huán)境、病原微生物及養(yǎng)殖動(dòng)物相互作用失衡的結(jié)果，導(dǎo)致病害流行的因素復(fù)雜多變。因此，將病害防治各項(xiàng)技術(shù)進(jìn)行集成以防止病害暴發(fā)，才是最有前途最有效的途徑。

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