孫琦 俞一峰

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2010年8月～2012年6月在江陰市人民醫(yī)院行手術(shù)治疔的結(jié)直腸癌患者, 年齡25～85歲, 平均年齡(61.5±10.1)歲。隨訪采用門(mén)診復(fù)查、電話、書(shū)信、電子郵件等方式進(jìn)行。無(wú)病生存期定義根治性治療后到腫瘤復(fù)發(fā)或因各種原因出現(xiàn)死亡的時(shí)間, 以月為單位計(jì)算。至研究終點(diǎn)(2017年5月)。其中具有完整隨訪資料者138例, 隨訪時(shí)間(43.9±21.6)個(gè)月。

1.2 MSI檢測(cè)

1.2.1 核酸提取 血液標(biāo)本：采用新景血液提取試劑盒；DNA無(wú)需稀釋, 直接用于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。石蠟標(biāo)本：采用QIAGEN石蠟提取試劑盒；DNA稀釋至20 ng/μl用于PCR的模板。核酸定量：使用Qubit進(jìn)行核酸定量。

1.2.2 試劑 引物為NR-21、NR-24、NR-27、BAT-25、BAT-26, 產(chǎn)物長(zhǎng)度分別為110 bp、132 bp、154 bp、123 bp、122 bp, 修飾方法分別為5'-FAM、5'-FAM、5'-HEX、5'-TMR、5'-HEX。

1.2.3 操作步驟 反應(yīng)體系的配制：以一個(gè)位點(diǎn)的體系配制為例。從-20℃冰箱中取出試劑以及待檢樣品DNA, 待其融化后, 短暫離心, 將管壁和管蓋上的液體收集到管底。在試劑準(zhǔn)備區(qū)配制20 μl PCR反應(yīng)體系, 各組分及添加量如下。

1.2.4 PCR擴(kuò)增 在擴(kuò)增區(qū)按如下的反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增 ：94℃ 4 min, 94℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 30 s 10 個(gè)循環(huán) ,94℃ 30 s、53℃ 30 s、72℃ 30 s 30 個(gè)循環(huán) , 72℃ 30s, 10℃ ∞。

1.2.5 瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果 取3 μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物混合2 μl loading buffer, 在1.5%瓊脂糖凝膠上直接點(diǎn)樣, 120 V電泳20 min, 于凝膠成像儀下觀察結(jié)果。

1.2.6 混合各位點(diǎn)PCR產(chǎn)物送毛細(xì)管電泳分析 將血液和石蠟樣本五個(gè)位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物分別混合成一管約15 μl的混合物, 各位點(diǎn)PCR產(chǎn)物的添加量視電泳條帶亮度而定, 若五個(gè)位點(diǎn)條帶亮度一致, 則添加比例為1∶1∶1∶1∶1；若條帶亮度有差異, 則根據(jù)實(shí)際情況適當(dāng)調(diào)整添加比例, 條帶較亮的可適當(dāng)減少添加量, 反之, 條帶較暗的則可適當(dāng)增加添加量。將混合好的產(chǎn)物外送進(jìn)行毛細(xì)管電泳分析, 送上海生工生物測(cè)序。

1.3 免疫組化檢測(cè)四種MMR蛋白 10%中性磷酸緩沖福爾馬林固定24～48 h, 常規(guī)脫水、固定、石蠟包埋, 免疫組化檢測(cè)四種MMR蛋白。①M(fèi)LH1, 兔單抗, 克隆號(hào)ES05, 即用型；②PMS2, 兔單抗, 克隆號(hào)EP51, 即用型；③MSH2, 兔單抗,克隆號(hào)FE11, 即用型；④MSH6, 兔單抗, 克隆號(hào)EP49, 即用型；上述一抗均為SANTA CRUZ公司。所用二抗是DAKO EnVision TM二步法抗兔、鼠通用型免疫組化試劑, 所用免疫組花儀是DAKO AutostainerLink 48。每張切片含有正常腸黏膜、腫瘤周?chē)M織、炎性組織作為內(nèi)對(duì)照。判斷標(biāo)準(zhǔn)為內(nèi)對(duì)照細(xì)胞核陽(yáng)性而癌組織全陰性(即沒(méi)有1個(gè)細(xì)胞核染色)時(shí), 表面該蛋白表達(dá)缺失［1,2］。兩名病理科主治以上醫(yī)師閱片,如果有分歧, 請(qǐng)第三名高年資病理科醫(yī)師裁決。

1.4 觀察指標(biāo) 比較138例患者基因檢測(cè)同免疫組化檢測(cè)結(jié)果, MSI-H腫瘤的影響因素, MSI與術(shù)后化療的關(guān)系。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( x-±s)表示, 采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率(%)表示, 采用χ2檢驗(yàn)。用Kaplan-Meierk生存曲線進(jìn)行生存率估計(jì), 以Log-rank進(jìn)行生存率的比較, P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基因檢測(cè)同免疫組化結(jié)果 基因檢測(cè)103例MSS, 4例為MSI-L, 而免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)MSI-H, 免疫組化顯示4例中PMS2缺失2例, MSH2缺失1例, MSH6缺失1例。

2.2 MSI檢測(cè)基本特征 31例(22.5%)為MSI-H, 36例(26.1%)為MSI-L, 71例(51.4%)為MSS。通過(guò)MSI分析, MSI-H男女比例為11∶20；18例≤65歲, 13例＞65歲；腫瘤分期Ⅱ期19例, 腫瘤分期ⅢA期10例, 腫瘤分期ⅢB期2例；有無(wú)癌結(jié)節(jié)比例為0∶31；有無(wú)脈管侵犯比例為3∶28；有無(wú)神經(jīng)侵犯比例為2∶29；有無(wú)淋巴結(jié)有無(wú)轉(zhuǎn)移比例為12∶19；右半結(jié)腸9例, 左半結(jié)腸3例, 直腸 19例；組織學(xué)類(lèi)型：非黏液癌23例, 黏液癌8例；CEA：26例≤5, 5例＞5。MSIL+MSS的男女比例為46∶61；63例≤65歲, 44例＞65例；腫瘤分期Ⅱ期73例, 腫瘤分期ⅢA期22例, 腫瘤分期ⅢB期12例；有無(wú)癌結(jié)節(jié)比例為7∶100；有無(wú)脈管侵犯比例為8∶99；有無(wú)神經(jīng)侵犯比例為3∶104；有無(wú)淋巴結(jié)有無(wú)轉(zhuǎn)移比例33∶74；右半結(jié)腸18例, 左半結(jié)腸4例, 直腸85例；組織學(xué)類(lèi)型：非黏液癌81例, 黏液癌 26例；CEA：90例≤5, 17例＞5。MSI-H腫瘤在性別、年齡、腫瘤分期、組織學(xué)分型、CEA升高與否、腫瘤部位、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移、神經(jīng)侵犯與否、脈管侵犯與否、有無(wú)癌結(jié)節(jié)同MSI-L和MSS腫瘤相比, 差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.3 MSI與術(shù)后化療的關(guān)系 Ⅱ期MSI-H化療9例, 未化療10例；Ⅱ期MSI-L或MSS化療44例, 未化療29例。Ⅲ期化療38例, 未化療8例。Ⅱ期中MSI-L或MSS患者卡培他濱(希羅達(dá))單藥化療、FOLFOX4、XELOX方案, 5年生存率分別為66.7%(6/9)、57.7%(15/26)、77.8%(7/9), 比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；Ⅲ期患者希羅達(dá)單藥化療、FOLFOX4、XELOX方案,五年生存率分別為27.3%(3/11), 26.1%(6/23), 50.0%(2/4), 比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。MSI-H 31例, MSI-L、MSS共107例, 兩組患者5年無(wú)病生存率分別為71.0%(22/31)和44.9%(48/107), 比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。Ⅱ期MSI-L或MSS患者化療后5年生存率為63.6%(28/44)明顯高于未化療41.4%(12/29), 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

3 討論

本次研究中, Ⅱ期中MSI-L或MSS患者中有7例有神經(jīng)脈管侵犯、癌結(jié)節(jié)等多種高危因素行化療, 僅有2例存活高于5年, 1例有高危因素者未化療。說(shuō)明Ⅱ期結(jié)直腸惡性腫瘤有相關(guān)高危因素預(yù)后不佳［3-5］。如果去除有該高危因素, 將剩下的Ⅱ期檢測(cè)為MSI-L或MSS病例進(jìn)行統(tǒng)計(jì), Ⅱ期MSI-L或MSS患者化療后5年生存率為63.6%(28/44)明顯高于未化療41.4%(12/29), 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。本研究納入的化療方案有三種, 分別為希羅達(dá)單藥化療、FOLFOX4、XELOX, 研究顯示Ⅱ期和Ⅲ期三種化療方案間比較, 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。既往研究認(rèn)為5-FU 聯(lián)用其他化療藥物時(shí), 會(huì)改變 MSI 對(duì)化療藥物的預(yù)測(cè)價(jià)值, 尤其是加入 dMMR 結(jié)直腸癌敏感的奧沙利鉑, FOLFOX 化療方案的結(jié)直腸癌中 MSI 可能是預(yù)后良好的一種標(biāo)志, 尤其是Ⅲ期。但因?yàn)楸狙芯恐孝笃诨颊呖偣灿?6例, 其中XELOX方案化療僅4例, 樣本量較少, 與相關(guān)研究結(jié)果不符, 結(jié)果不一定客觀準(zhǔn)確, 需進(jìn)一步增加樣本量, 以作進(jìn)一步研究。

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