吳正海，劉海洋，陳華樂，段達(dá)榮，周鐵麗

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心，浙江 溫州 325015；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心，浙江 溫州 325027；3.臺(tái)州市第一人民醫(yī)院 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心，浙江 臺(tái)州 318020）

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，KP）為條件致病菌，是導(dǎo)致院內(nèi)感染和社區(qū)獲得性感染最常見的病原體之一。隨著碳青霉烯類抗菌藥物的廣泛使用，耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌（carbapenemresistantKlebsiella pneumoniae，CRKP）在全球范圍內(nèi)呈現(xiàn)不斷增多趨勢，給臨床治療帶來極大困難[1]。多粘菌素早期因腎毒性及神經(jīng)毒性被限制使用，近年來由于多重耐藥菌的出現(xiàn)及蔓延被重新啟用，被視為治療多重耐藥革蘭陰性菌感染的“最后一道防線”。但隨著多粘菌素的廣泛使用，部分菌株尤其是CRKP中出現(xiàn)多粘菌素耐藥性，給臨床治療帶來極大挑戰(zhàn)。為了有效控制CRKP所致嚴(yán)重感染，防止耐藥性的進(jìn)一步產(chǎn)生，聯(lián)合用藥成為一個(gè)較好的選擇[2]。本研究采用微量肉湯棋盤稀釋法探究多粘菌素B分別與美羅培南和利福平聯(lián)合用藥對(duì)CRKP的體外抗菌活性，為臨床治療CRKP感染提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源：收集2016年12月至2017年4月臺(tái)州市第一人民醫(yī)院CRKP共20株，菌株收集時(shí)剔除同一患者同一部位分離的重復(fù)菌株。其中分離自尿液、痰液和血液標(biāo)本的菌株分別為9株、10株和1株。所有菌株均由VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物分析儀鑒定并進(jìn)行藥敏檢測，瓊脂稀釋法確認(rèn)藥敏結(jié)果。20株菌經(jīng)改良Hodge實(shí)驗(yàn)證實(shí)均為產(chǎn)碳青霉烯酶菌株，且其中有15株為多重耐藥菌。藥敏質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922和銅綠假單胞菌ATCC 27853，均購自衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心。

1.1.2 儀器和試劑：VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物分析儀、DR100型比濁儀（法國生物梅里埃公司），超凈工作臺(tái)（北京東聯(lián)哈爾儀器公司），96孔平板（上海雷布斯生物科技有限公司）；MH肉湯培養(yǎng)基（濟(jì)南安貝卡有限公司），無菌接種水、多粘菌素標(biāo)準(zhǔn)品（溫州康泰生物公司），利福平（廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司），美羅培南（海正輝瑞藥業(yè)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液配置：從已經(jīng)分純并過夜培養(yǎng)的血瓊脂平板上挑取3～5個(gè)菌落，并接種于無菌0.9%氯化鈉溶液中。菌液用比濁儀調(diào)濁度至0.5麥?zhǔn)蠞岫龋儆肕H肉湯稀釋100倍。

1.2.2 抗菌藥物配置：根據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）標(biāo)準(zhǔn)[3]的要求配置各種抗菌藥物原液，利福平、美羅培南和多粘菌素B原液濃度均為5 120 μg/mL。

1.2.3 微量肉湯稀釋法：將各抗菌藥物用MH肉湯進(jìn)行倍比稀釋，制成10個(gè)稀釋濃度。多粘菌素B濃度為0.5～256 μg/mL，利福平濃度為2.5～1 280 μg/mL，美羅培南濃度為5～2 560 μg/mL。向無菌的96孔平板中每行的第1～第10孔加入100 μL的各濃度藥液，再向各孔加入100 μL稀釋后的菌液，同時(shí)做陰性對(duì)照和空白對(duì)照。37 ℃培養(yǎng)16～18 h，觀察結(jié)果并記錄各種藥物單用時(shí)的最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）值（單藥MIC）。重復(fù)操作3次取平均值。

1.2.4 微量棋盤稀釋法：將各種藥物根據(jù)2倍MIC值用MH肉湯倍比稀釋成8個(gè)濃度梯度。分別取多粘菌素B和美羅培南、多粘菌素B和利福平組合，按照棋盤法設(shè)計(jì)，各取50 μL加入每孔，同時(shí)加入100 μL稀釋后的菌液，37 ℃培養(yǎng)16～18 h后，觀察記錄最佳組合時(shí)的各藥M I C（甲藥聯(lián)用M I C和乙藥聯(lián)用M I C）。并計(jì)算部分抑菌·濃度指數(shù)（f r a c t i o n a l i n h i b i t o r y concentration index，F(xiàn)ICI）值。

1.2.5 FICI計(jì)算與判讀：FICI=MIC甲藥聯(lián)用/MIC甲藥單用+MIC乙藥聯(lián)用/MIC乙藥單用。FICI≤0.5為協(xié)同作用，0.5＜FICI≤1.0為相加作用，1.0＜FICI≤2.0為無關(guān)作用，F(xiàn)ICI＞2.0為拮抗作用。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。2組藥物組合間的協(xié)同率比較采用χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)取α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 藥物單用和聯(lián)用對(duì)CRKP的MIC比較 多粘菌素B和美羅培南聯(lián)用后，兩者的MIC5（0能抑制50%的細(xì)菌所需MIC）與MIC9（0能抑制90%的細(xì)菌所需MIC）明顯下降：多粘菌素B的MIC50與MIC90均為單藥的1/4，美羅培南的MIC50與MIC90為單藥的1/32和1/4；多粘菌素B和利福平聯(lián)用后，多粘菌素B的MIC50與MIC90分別為單藥的1/32和1/8，利福平的MIC50與MIC90分別為單藥的1/2和1/64。表明上述兩種藥物與多粘菌素B之間均具有一定的聯(lián)合效應(yīng)。見表1。

2.2 濃度-累積抑菌百分率曲線 多粘菌素B與美羅培南、利福平聯(lián)合用藥后，各藥物的濃度-累積抑菌百分率曲線均表現(xiàn)為左移，表明各藥物組合后的抑菌所需藥物濃度與單藥時(shí)相比均有所降低。見圖1-2。

表1 多粘菌素B與美羅培南、利福平單用和聯(lián)用對(duì)CRKP的MIC值（n=20，μg/mL）

2.3 藥物聯(lián)用對(duì)CRKP的FICI分布及兩藥物組合間協(xié)同率比較 多粘菌素B與美羅培南聯(lián)用后，協(xié)同作用為55%，相加作用為45%，無關(guān)和拮抗作用均為0；多粘菌素B與利福平聯(lián)用后，協(xié)同作用為65%，相加作用為35%，無關(guān)和拮抗作用均為0。表明上述兩種藥物與多粘菌素B組合均有一定的聯(lián)合效應(yīng)。各組藥物對(duì)CRKP的FICI分布見表2。兩藥物組合間的協(xié)同率（協(xié)同作用+相加作用）差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 多粘菌素B、美羅培南單用和聯(lián)用對(duì)CRKP的濃度-累積抑菌百分率曲線（n=20）

圖2 多粘菌素B、利福平單用和聯(lián)用對(duì)CRKP的濃度-累積抑菌百分率曲線（n=20）

3 討論

KP屬腸桿菌科，為革蘭陰性桿菌，對(duì)外界抵抗力強(qiáng)，可存在于人體腸道和上呼吸道，一般情況下不致病，在機(jī)體抵抗力下降時(shí)引發(fā)尿路感染、肺炎、菌血癥等[4]。碳青霉烯類抗菌藥物是治療多重耐藥KP感染的有效手段，然而據(jù)我國CHINET細(xì)菌耐藥性監(jiān)測報(bào)告[5]，CRKP檢出率逐年上升，耐藥性的獲得途徑多樣，包括產(chǎn)碳青霉烯酶、外膜蛋白的缺失、膜通透性改變和外排泵過表達(dá)等，給臨床抗感染治療帶來巨大的挑戰(zhàn)[6]。因此，以多粘菌素為基礎(chǔ)的針對(duì)耐碳青霉烯類革蘭陰性菌的聯(lián)合用藥方案評(píng)價(jià)對(duì)于臨床應(yīng)用具有重要意義。

本研究通過多粘菌素B分別與美羅培南和利福平聯(lián)合藥敏的方式，對(duì)20株CRKP進(jìn)行體外抗菌活性的研究。結(jié)果顯示，兩藥與多粘菌素B聯(lián)用后，各藥的MIC50與MIC90值較單用時(shí)有明顯降低，累積抑菌濃度百分率曲線明顯左移。多粘菌素B與美羅培南聯(lián)用后，協(xié)同作用為55%（11/20），相加作用為45%（9/20），無關(guān)與拮抗作用均為0；多粘菌素B與利福平聯(lián)合用藥后，協(xié)同作用為65%（13/20），相加作用為35%（7/20），無關(guān)和拮抗作用均為0。兩種組合均對(duì)CRKP具有良好的抑菌作用，且聯(lián)合抑菌效果相似。BRATU等[7]通過利福平與多粘菌素B聯(lián)合用藥對(duì)KP進(jìn)行抗菌效果評(píng)價(jià)時(shí)發(fā)現(xiàn)，16株菌中有15株出現(xiàn)協(xié)同作用；亞胺培南與多粘菌素B聯(lián)合，有10株出現(xiàn)協(xié)同作用，3株出現(xiàn)拮抗作用。本研究結(jié)果顯示多粘菌素B與利福平聯(lián)合用藥的結(jié)果與BRATU等的結(jié)果基本相同，多粘菌素B與美羅培南聯(lián)合用藥的結(jié)果與其報(bào)道的多粘菌素B與亞胺培南聯(lián)合用藥結(jié)果的差異較大，但與ELEMAM等[8]報(bào)道相似，這可能與藥物的抗菌效果及菌株特異性有關(guān)。TASCINI等[9]研究結(jié)果顯示多粘菌素B和與利福平聯(lián)合用藥同樣對(duì)產(chǎn)碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniaecarbapenemase，KPC）的菌株具有協(xié)同作用；QURESHI等[10]的研究表明，多粘菌素B與碳青霉烯類藥物的聯(lián)合應(yīng)用能降低KPC造成的感染致死率。然而，WAREHAM等[11]體外評(píng)價(jià)多粘菌素B在與利福平、亞胺培南或阿奇霉素聯(lián)合用藥對(duì)多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的活性時(shí)發(fā)現(xiàn)，協(xié)同作用不具有普遍性，這可能與菌株特異性及地區(qū)差異性有關(guān)。

表2 多粘菌素B分別與美羅培南、利福平聯(lián)用對(duì)20株CRKP的FICI分布構(gòu)成[ n（%）]

與此同時(shí)，相關(guān)研究顯示革蘭陰性菌對(duì)多粘菌素的耐藥率已從0.1%增長到31.0%，并出現(xiàn)了碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細(xì)菌對(duì)多粘菌素B耐藥的泛耐藥菌株，尤以KP最為多見[12]。本研究發(fā)現(xiàn)其中兩例多粘菌素B單用時(shí)的MIC值分別為8 μg/mL和4 μg/mL，需引起高度重視。因此，在控制CRKP感染時(shí)需優(yōu)先選擇聯(lián)合用藥，防止多粘菌素耐藥的進(jìn)一步產(chǎn)生。

綜上所述，以多粘菌素B為基礎(chǔ)的聯(lián)合用藥，既對(duì)CRKP產(chǎn)生一定的抑菌效果，又可以降低用藥劑量，延緩細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生，為臨床抗感染治療帶來新的選擇。此外，應(yīng)進(jìn)一步對(duì)多粘菌素B及其聯(lián)合用藥的藥代動(dòng)力學(xué)（pharmacokinetics，PK）/藥效動(dòng)力學(xué)（pharmacodynamics，PD）參數(shù)和腎損傷機(jī)制及危險(xiǎn)因素進(jìn)行研究，解決以其為基礎(chǔ)的聯(lián)合用藥對(duì)于臨床的有效性和安全性的問題，制定科學(xué)合理的用藥措施，促使以多粘菌素B為基礎(chǔ)的聯(lián)合用藥方案切實(shí)成為臨床戰(zhàn)勝嚴(yán)重感染的有力武器。

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