羅 云 馬 璇 谷俊辰 閆海芳

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津田蕪菁基因克隆、定位及表達(dá)

羅 云 馬 璇 谷俊辰 閆海芳*

東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 黑龍江哈爾濱 150040

SIZ1是植物細(xì)胞蛋白質(zhì)翻譯后修飾SUMO化的E3連接酶, 參與植物蛋白相互作用、定位和抗逆反應(yīng)。為研究BrSIZ1在津田蕪菁中的表達(dá)特性, 本研究克隆了津田蕪菁基因全長cDNA序列, 命名為(GenBank登錄號為KY441465), 該基因全長2754 bp, 其ORF全長2571 bp, 編碼856個(gè)氨基酸殘基的多肽。構(gòu)建了BrSIZ1-GFP表達(dá)載體進(jìn)行亞細(xì)胞定位研究, 結(jié)果顯示BrSIZ1-GFP定位于細(xì)胞核內(nèi), 可能在細(xì)胞核中發(fā)揮其功能。利用熒光定量PCR檢測表明, 該基因表達(dá)量在葉片中最高, 在幼苗和紅色根皮中次之, 表達(dá)具有組織特異性。而且在蕪菁根皮中的表達(dá)受長波紫外線(UV-A)誘導(dǎo), 在4°C、37°C脅迫的幼苗中, 表達(dá)量增加。

津田蕪菁;; 基因克隆; 亞細(xì)胞定位; 表達(dá)分析

蛋白質(zhì)小泛素類似修飾(small ubiquitin-related modifier, SUMO)是一種植物蛋白質(zhì)翻譯后修飾, 是蛋白質(zhì)發(fā)揮生物學(xué)功能的重要調(diào)節(jié)機(jī)制。SUMO是一種小分子多肽, 修飾蛋白的過程稱為SUMO化[1-2]。SUMO化途徑與泛素化一樣也有3種酶參與, SUMO活化酶(SUMO-activating enzyme, SAE/E1, 又名Ubc9), SUMO結(jié)合酶(SUMO-conjugating enzyme, SCE/E2)和SUMO E3連接酶(SUMO-E3, ligase)[3]。E3連接酶的主要作用是識別底物和提高靶蛋白的修飾效率, 在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用[4]。

目前在擬南芥中發(fā)現(xiàn)有兩類SUMO E3連接酶, 分別為SIZ/PIAS (SAP and MIZ/protein inhibitor of activated STAT)和NES/MMS21 (non-SMC element/ methyl methanesulfonate sensitive)。SIZ/PIAS蛋白家族的特點(diǎn)是含有保守的結(jié)構(gòu)域, 包括SAP、PINIT、SP-RING、SXS和核定位信號NLS, 還有植物所特有PHD[5-6]。SAP區(qū)域由一個(gè)螺旋-延伸-螺旋結(jié)構(gòu)組成, 主要與DNA結(jié)合有關(guān)[7]。PHD是一個(gè)C4HC3的鋅指結(jié)構(gòu), 只存在于植物SIZ/PIAS蛋白中, 與E3連接酶活性有關(guān)[6]。PINIT (Pro-Ile-Asn-Ile-Thr)區(qū)對于SIZ/PIAS蛋白存在于細(xì)胞核是必需的, 鋅指結(jié)構(gòu)域SP-RING賦予SUMO E3連接酶的活性[5]。SXS是SUMO結(jié)合區(qū)域[8]。由于SIZ1具有對底物識別的特異性功能, 使得它對植物的生長具有多種影響。目前研究表明: SIZ1參與調(diào)控植物根的生長、花期、花藥發(fā)育及生物與非生物脅迫, 如抗病、抗寒、抗熱、抗旱等[9-18]。津田蕪菁(ssp.‘Tsuda’)膨大的肉質(zhì)根不見光部分呈白色, 無花青素的合成; 而見光部分呈紫色, 有花青素的合成。單色光中只有在UV-A誘導(dǎo)下可合成花青素[19]。UV-A誘導(dǎo)后蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)SIZ1蛋白表達(dá)量增加。本研究根據(jù)已經(jīng)報(bào)道的擬南芥序列, 通過RT-PCR結(jié)合RACE技術(shù)克隆了蕪菁基因, 并研究了該基因的定位和表達(dá), 以期為深入探討SIZ1在UV-A誘導(dǎo)花青素合成和溫度脅迫響應(yīng)中的功能提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料處理

津田蕪菁(L. ssp.‘Tsuda’)種植于東北林業(yè)大學(xué)花卉生物工程研究所溫室。長至60 d取其膨大白色根皮(不見光)、紅色根皮(自然光)、去皮后根、葉片和長至5個(gè)月左右開放的花; 以UV-A (352 nm, 15 W m–2)光照處理一直處于土壤中生長的肉質(zhì)根白色表皮3、6、12、24和48 h。取自然光下, 22°C萌發(fā)4天的幼苗, 將其移至4°C和37°C處理3、6、12 和24 h。迅速以液氮冷凍樣品, 于–80°C保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 花青素的測量

準(zhǔn)備色素提取液(含1 % 鹽酸的甲醇溶液), 取1 cm×1 cm的UV-A光照處理的根皮于提取液中, 4°C放置24 h[20]。在530 nm的光吸收下檢測樣品。以O(shè)D值表示花色素苷的含量, 生物學(xué)重復(fù)3 次。

1.3 RNA的提取和第1鏈cDNA的合成

將1.1準(zhǔn)備的材料取出, 提取總RNA (上海寶生生物公司的TRIzol試劑), 取1 μg的總RNA用于cDNA第一鏈的合成。

1.4 BrSIZ1的cDNA克隆與序列測定

使用TaKaRa公司的RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3.0試劑合成cDNA第1鏈。參考GenBank中親緣關(guān)系相近物種擬南芥基因的核苷酸序列, 應(yīng)用PrimerPremier 6.0設(shè)計(jì)引物BrSIZ1-F: 5′-AAA TCACAAGGGCAGACAAGGA-3′和BrSIZ1-R: 5′-A AAGGCTACCATCAGGTGCAT-3′, 克隆部分ORF序列。以cDNA第1鏈為模板。PCR條件為94°C 3 min預(yù)變性, 94°C 30 s, 55°C 30 s, 72°C 1 min, 30個(gè)擴(kuò)增循環(huán), 最后72°C延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0.8% (w/v)瓊脂糖凝膠檢測、回收目的條帶, 與北京全式金公司的pEASY-T5 Zero Vector鏈接, 轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TOP10, 挑選克隆進(jìn)行PCR鑒定, 由華大生物公司測序。測序引物分別為M13正反向引物。

在已獲得部分ORF序列的基礎(chǔ)上利用cDNA 末端快速擴(kuò)增(RACE)法克隆3'-端序列[21], 以紅色根皮1 μg總RNA為模板, 以oligo(dT)17接頭引物5′-GACTCGAGTGCACATCG(T)17-3′為引物, 用反轉(zhuǎn)錄酶III (Invitrogen)合成第1鏈cDNA。參考已獲得的ORF序列設(shè)計(jì)的5’引物BrSIZ1-5’F: 5′-AAATT GAAGTGAAACCTGAT-3′和接頭引物5′-GACTCG AGTGCACATCG-3′進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為94°C預(yù)變性5 min, 隨后30個(gè)循環(huán), 每循環(huán)94°C變性30 s、55°C退火擴(kuò)增30 s、72°C延伸90 s, 完成最后一個(gè)循環(huán)后, 72°C延伸 10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠檢測、回收純化, 測序同cDNA克隆。

根據(jù)獲得的5'-cDNA序列設(shè)計(jì)基因特異性引物, 用5'/3'-RACE試劑盒(Roche)及基因特異性引物BrSIZ1-3’F: 5′-AAGCATACCATTGATCTGTAG-3′、oligo(dT)錨定引物5′-GACCACGCGTATCGATGTC GAC(T)16(A/C)-3′、PCR錨定引物5′-GACCACGCGT ATCGATGTCGAC-3′, 通過5'-RACE克隆5'-端序列。擴(kuò)增條件、克隆方法同3'-RACE。

1.5 蕪菁BrSIZ1基因生物信息學(xué)分析采用的方法

用NCBI的nucleotide BLAST程序(http://www. ncbi.nlm.nih.gov/blast/)進(jìn)行基因序列同源性比對。用NCBI的protein BLAST程序(http://www. ncbi.nlm.nih.gov/blast/)分析BrSIZ1保守性功能域。用http://web.expasy.org/compute_pi/預(yù)測相對分子質(zhì)量和等電點(diǎn)。用http://nls-mapper.iab.keio.ac.jp/cgi- bin/NLS_Mapper_form.cgi程序分析核定位信號(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)。由MEGA5程序完成進(jìn)化樹的構(gòu)建。

1.6 BrSIZ1在洋蔥表皮細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位

用加有酶切位點(diǎn)的引物對測序驗(yàn)證過的含有目的基因的質(zhì)粒DNA進(jìn)行擴(kuò)增, 回收目的基因片段與pA7-GFP載體連接。通過真空滲透方法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入洋蔥表皮細(xì)胞, 培養(yǎng)16 h后, 利用Zeiss 510 nete激光共聚焦掃描顯微鏡觀察[22]。

1.7 熒光定量PCR檢測蕪菁BrSIZ1表達(dá)

用7500 Real-time PCR System (Applied Biosystems)檢測基因的表達(dá)。引物為BrSIZ1-F: 5′-ACGGGCTCAACTCAAA-3′, BrSIZ1-R: 5′-TCTGGCGAGGAAATGAAA-3′, 內(nèi)標(biāo)引物為BrACTIN-F: 5′-GCTCAGTCCAAGAGAGG TATTC-3′, BrACTIN-R: 5′-GCTCGTTGTAGAAAGT GGATC-3′。試劑為SYBRPremix Ex(TaKaRa, 日本)。10 μL反應(yīng)體系含5 μL SYBR Premix Ex, 0.2 μL ROX Reference Dye (50×)(TaKaRa, Japan), 4.5 μL ddH2O (TIANGEN, 中國), 0.17 μL cDNA, 0.33 μL引物混合物(正反向引物, 10 μmol L–1)。Real-time PCR程序?yàn)?5°C 30 s預(yù)變性, 40個(gè)擴(kuò)增循環(huán)(95°C 10 s, 60°C 31 s), 以及從60°C加熱到90°C的溶解過程。表達(dá)水平計(jì)算公式為2–ΔCt, ΔCt = Ct(目的基因)–Ct()。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)試驗(yàn)重復(fù), 生物學(xué)重復(fù)3次。數(shù)據(jù)均用Meas±SE, 用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析,<0.05有意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 蕪菁BrSIZ1基因的cDNA克隆及序列分析

參考擬南芥基因序列設(shè)計(jì)引物, 以津田蕪菁cDNA為模板, 克隆了基因序列, 將該序列用NCBI的BLAST程序檢索數(shù)據(jù)庫, 顯示該序列與擬南芥具有極高的同源性, 高達(dá)90%以上, 命名為, GenBank登錄號為KY441465。基因序列全長2754 bp, 開放閱讀框ORF區(qū)長2571 bp, 該基因序列編碼一種具有856個(gè)氨基酸殘基的多肽。

氨基酸序列分析顯示, BrSIZ1相對分子質(zhì)量為94.3kD, 等電點(diǎn)為5.2。BLAST分析結(jié)果顯示BrSIZ1含有5個(gè)保守的功能域, 分別是N-SAP(I)、PHD(II)、PINIT(III)、SP-RING(IV)功能域、SXS(V)功能域和一個(gè)NLS (圖1和圖2)。將津田蕪菁BrSIZ1氨基酸序列與油菜(; XP_013697486.1)、亞麻芥(; XP_010443841.1)、擬南芥(; OAO90655.1)、遏藍(lán)菜(; JAU05124.1)、甜杏(; ALI97585.1)、甘藍(lán)(var.; XP_013628264.1)、醉蝶花(; XP_010535588.1)、棗(; XP_015874378.1)、葡萄(; XP_01065 1133.1); 胡桃(; XP_018819476.1)、甜瓜(; XP_008463667.1)、梅花(; XP_008225245.1)同源蛋白的氨基酸序列利用MEGA5.0軟件, 根據(jù)鄰位相接法(Neighbor- joining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3)。結(jié)果表明, 津田蕪菁BrSIZ1與油菜的同源蛋白親緣關(guān)系最近, 與同屬十字花科的亞麻芥、擬南芥、遏藍(lán)菜、油菜和甘藍(lán)聚為一支, 而其他的葡萄、甜瓜、棗、胡桃、甜杏和梅花聚在一支。

圖1 BrSIZ1的結(jié)構(gòu)功能域(AtSIZ1: SIZ1OAO90655.1)

功能域包括一個(gè)N-SAP(I), 一個(gè)PHD(II), 一個(gè)PINIT(III, 一個(gè)SP-RING(IV)功能域和一個(gè)SXS(V)功能域。

The domains include: an N-terminal SAP (I, scaffold attachment factor A/B/acinus/PIAS); the PHD (II, plant homeodomain); the putative PINIT core domain (III); the SP-RING (IV, SIZ/PIAS-RING) domain; and the SXS (V, Ser-X-Ser) domain.

2.2 BrSIZ1在洋蔥表皮細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位

對擬南芥、番茄等物種SIZ1蛋白定位研究發(fā)現(xiàn), 該蛋白定位于細(xì)胞核, 所以本研究構(gòu)建了-GFP瞬時(shí)表達(dá)載體(圖4), 在洋蔥表皮細(xì)胞中進(jìn)行了亞細(xì)胞定位研究。將BrSIZ1-GFP轉(zhuǎn)入洋蔥表皮細(xì)胞中, 培養(yǎng)16 h后, 激光共聚焦顯微鏡觀察。結(jié)果如圖5所示, 在融合蛋白表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的洋蔥表皮細(xì)胞中, 綠色熒光集中分布在細(xì)胞核中, 表明BrSIZ1蛋白定位于細(xì)胞核中。

2.3 蕪菁BrSIZ1基因組織特異性表達(dá)

對基因在蕪菁紅色根皮、白色根皮、去皮根、花、葉和幼苗不同組織中的表達(dá)分析(圖6)發(fā)現(xiàn), 津田蕪菁基因在檢測組織中都表達(dá), 白根皮中表達(dá)量最少, 葉子中的表達(dá)最高, 是在白根皮中的2.0倍。在有花青素合成的紅色根皮、幼苗和花中次之, 分別是根皮的1.6、1.6和1.5倍。在白色根皮中表達(dá)量最少, 具有一定的組織表達(dá)特異性。

圖2 津田蕪菁BrSIZ1基因核苷酸序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列(最后框內(nèi)為核定位信號)

圖3 不同植物SIZ1氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖4 pBrSIZ1-GFP表達(dá)載體示意圖

2.4 UV-A光誘導(dǎo)BrSIZ1基因在蕪菁根皮中的表達(dá)

取2個(gè)月齡的蕪菁白色根皮進(jìn)行UV-A光照誘導(dǎo)花青素合成, 分別取照射0、3、6、12、24和48 h檢測根皮中花青素含量表明, 在UV-A光照6 h后花青素含量未見明顯升高, 12 h后有微量花青素開始合成, 并且在24 h和48 h后花青含量持續(xù)增高(圖7)。分別提取UV-A誘導(dǎo)不同時(shí)間后的津田蕪菁根皮總RNA, 對基因進(jìn)行定量PCR分析。結(jié)果顯示UV-A光照6 h時(shí)的表達(dá)開始增加, 12 h時(shí)表達(dá)量最高, 表達(dá)量達(dá)到未處理時(shí)的2.8倍。之后24 h和48 h時(shí)表達(dá)量開始下降, 降低至未處理時(shí)的1.9倍和1.8倍(圖8)。表明在根皮中的表達(dá)受UV-A光誘導(dǎo),基因表達(dá)量與UV-A誘導(dǎo)花青素合成是一致的(圖7和圖8)?；ㄇ嗨睾铣珊突虻谋磉_(dá)趨勢相比存在滯后, 這可能與啟動花青素合成相關(guān)基因表達(dá)需要時(shí)間有關(guān)。

2.5 BrSIZ1基因在溫度脅迫下的表達(dá)

取4 d齡津田蕪菁幼苗在4°C低溫和37°C高溫處理, 檢測基因的表達(dá)。結(jié)果表明在4°C低溫處理3 h時(shí),基因表達(dá)量開始增加, 24 h內(nèi)基因表達(dá)量持續(xù)增加, 24 h時(shí)的表達(dá)量增加至未處理時(shí)的5.8倍(圖9)。在37°C高溫處理3 h時(shí),基因表達(dá)量也開始增加直到處理12 h時(shí)達(dá)到最高, 達(dá)到未處理時(shí)的4.4倍, 處理24 h時(shí)表達(dá)量開始下降(圖9)。說明基因在津田蕪菁中參與溫度脅迫應(yīng)答。

圖5 GFP和BrSIZ1-GFP在洋蔥表皮細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位

圖6 定量PCR分析津田蕪菁不同組織中BrSIZ1基因的表達(dá)

圖7 UV-A光照誘導(dǎo)津田蕪菁白色根皮花青素合成含量

圖8 定量PCR分析UV-A光照誘導(dǎo)蕪菁白根皮BrSIZ1基因表達(dá)

圖9 定量PCR分析4°C、37°C處理蕪菁4天幼苗BrSIZ1基因表達(dá)

3 討論

本研究克隆了津田蕪菁蛋白質(zhì)翻譯后修飾SUMO化的E3連接酶基因, 該基因cDNA序列含有一個(gè)2571 bp的開放讀碼框, 編碼一個(gè)856個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。該蛋白含5個(gè)保守的功能域一個(gè)NLS。這些特點(diǎn)與已報(bào)道其他物種SIZ1蛋白結(jié)構(gòu)相似[5-8]。BrSIZ1與油菜、亞麻芥、擬南芥進(jìn)化上親緣關(guān)系最近。BrSIZ1氨基酸序列在822~846氨基酸之間存在核定位信號, 該信號為雙分型的NLS (bipartite NLS), 是由兩簇堿性亮氨酸殘基組成, 兩簇堿性亮氨酸之間被10~12個(gè)非保守氨基酸殘基間隔, 序列為KR(X)10-12RRKK[23]。BrSIZ1蛋白被定位于細(xì)胞核(圖5), 與擬南芥、水稻、石斛蘭等物種研究結(jié)果一致[6,11,24]。

SUMO化修飾參與植物生長發(fā)育調(diào)控,基因在蕪菁的各個(gè)組織中都表達(dá), 且在葉子、根皮、幼苗、花中表達(dá)量較高, 具有一定的組織表達(dá)特異性。與在擬南芥、石斛蘭等物種中一樣, 在根、莖、葉、花瓣的各組織中都表達(dá), 參與調(diào)控植物多種組織的生長發(fā)育[16,24]。擬南芥SIZ1蛋白參與調(diào)節(jié)葉片細(xì)胞分裂、根部細(xì)胞增殖、調(diào)控植物開花時(shí)間等過程[9]。擬南芥SIZ1突變體發(fā)育遲緩, 葉序、葉片大小、形狀以及許多生理反應(yīng)上均表現(xiàn)出缺陷型[26]。蕪菁基因在葉子、根表達(dá)量相對高, 可見SUMO E3連接酶在蕪菁葉片和根等器官發(fā)育上發(fā)揮重要作用。最近研究表明SUMO調(diào)控分生組織骨架, 控制有絲分裂細(xì)胞周期到核內(nèi)周期轉(zhuǎn)變、著絲粒解凝、基因轉(zhuǎn)錄與沉默的關(guān)鍵分子開關(guān), 這很可能就是SUMO作為真核生物細(xì)胞與個(gè)體生長發(fā)育重要調(diào)控機(jī)制的原因[25]。

津田蕪菁根皮花青素的合成受UV-A光的特異誘導(dǎo)[19,22],基因在有花青素合成的根皮中表達(dá), 且在UV-A光誘導(dǎo)的花青素合成過程中表達(dá)量增加, 說明BrSIZ1蛋白可能間接參與調(diào)控了花青素的合成。E3連接酶可以介導(dǎo)HY5 (ELONGATED HYPOCOTYL 5)、COP1 (constitutively photomorphogenic 1, COP1)在內(nèi)的多種植物光信號通路相關(guān)蛋白的活性[19,22]。在黑暗中COP1蛋白與轉(zhuǎn)錄因子HY5等結(jié)合作用于苯基苯乙烯酮合酶(chalcone synthase, CHS)、葉綠素/結(jié)合蛋白CAB等基因啟動子區(qū), 抑制這些基因表達(dá), 光下則脫離, 基因開始表達(dá)[26]。其中CHS是花青素合成途徑中第一個(gè)關(guān)鍵酶, 津田蕪菁BrSIZ1蛋白可能通過該途徑調(diào)控花青素合成。

此外, SUMO化修飾還參與植物脅迫應(yīng)答反應(yīng), 津田蕪菁BrSIZ1蛋白在4°C低溫和37°C高溫中表達(dá)量增加, 參與溫度脅迫應(yīng)答。這與在擬南芥研究結(jié)果一致[14,18], 但目前還不清楚基因溫度響應(yīng)機(jī)制。

4 結(jié)論

克隆了津田蕪菁基因, 該基因ORF全長2571 bp, 編碼856個(gè)氨基酸多肽。BrSIZ1蛋白定位于細(xì)胞核。基因表達(dá)具有組織特異性, 且在UV-A光誘導(dǎo)的花青素合成和4°C、37°C脅迫的幼苗中, 表達(dá)量增加。

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Cloning, Location, and Expression ofinL. subsp.‘Tsuda’

LUO Yun, MA Xuan, GU Jun-Chen, and YAN Hai-Fang*

College of Life Sciences, Northeast Forestry University, Harbin 150040, Heilongjiang, China

SIZ1, a SUMO E3 ligase involved in post-translation of proteins in plant cells, plays a role in protein interaction, location, and response to environmental stresses. In order to elucidate the expression profile of SIZ1 in Tsuda, cDNA ofgene was isolated from Tsuda. This gene was named(GenBank accession number KY441465).was 2754 bp in full length cDNA and 2571 bp in full length open reading frame (ORF), encoding a peptide with 856 amino acids. A BrSIZ1-GFP expression vector was constructed to analysis the subcellular localization. BrSIZ1-GFP was localized to nucleus, indicating that BrSIZ1 may play an important role in the nucleus. Quantitative-PCR analysis showed that thewas expressed meetly in leaf and secondly in young seedling and red root epidermis, showing tissue specificity. The expression of thewas induced by UV-A light in the root epidermis. The transcript level ofwas up-regulated when treated with temperature of 4°C or 37°C in young seedling.

;; gene cloning; subcellular location; expressing analysis

2017-03-07

2017-07-23;

2017-08-02.

10.3724/SP.J.1006.2018.000075

通信作者(Corresponding author): 閆海芳, E-mail: yanhaifang224@126.com

本研究由中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(DL12CA10)和東北林業(yè)大學(xué)科研訓(xùn)練項(xiàng)目(KY2015053)資助。

This study was supported by the Fundamental Research Funds for the Central Universities (DL12CA10) and the Research Training Program of Northeast Forestry University (KY2015053).

URL:http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20170802.2156.006.html