趙立娜 劉子會(huì) 段碩楠 張園園,2 李國良,* 郭秀林,*

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小麥熱激轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆和特性及其對(duì)耐熱性的調(diào)控

趙立娜1,2,**劉子會(huì)1,**段碩楠1張園園1,2李國良1,*郭秀林1,*

1河北省農(nóng)林科學(xué)院遺傳生理研究所 / 河北省植物轉(zhuǎn)基因中心重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 河北石家莊 050051;2河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 河北石家莊 050024

植物熱激轉(zhuǎn)錄因子(heat shock transcription factor, Hsf)是響應(yīng)熱脅迫的主要調(diào)節(jié)因子, 通過調(diào)節(jié)熱激蛋白基因表達(dá)進(jìn)而增強(qiáng)植物耐熱性。小麥Hsf家族至少含有56個(gè)成員, 其中B族11個(gè), 含B2亞族5個(gè)。本研究采用同源克隆技術(shù), 從37°C熱處理的二葉一心小麥幼葉中克隆獲得(序列號(hào)為AK331994) cDNA序列, 序列長(zhǎng)1191 bp, 編碼396個(gè)氨基酸。蛋白序列包括DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域DBD和核定位信號(hào)序列NLS。同源分析表明, TaHsfB2d蛋白與大麥未知蛋白的相似性最高, 為92%。熒光定量分析表明,在小麥多個(gè)組織器官中組成型表達(dá), 其中在成熟植株根系中表達(dá)量較高。37°C熱脅迫、外源水楊酸(SA)和H2O2處理均能不同程度上調(diào)的表達(dá), 熱激能顯著增強(qiáng)SA和H2O2對(duì)表達(dá)的誘導(dǎo)。H2O2合成抑制劑DPI和羥自由基清除劑DMTU聯(lián)合處理顯著抑制熱激對(duì)表達(dá)的上調(diào)作用、完全抑制SA對(duì)表達(dá)的上調(diào)。通過在洋蔥內(nèi)表皮瞬時(shí)表達(dá)并觀察GFP熒光發(fā)現(xiàn), 正常條件下, TaHsfB2d蛋白定位于細(xì)胞核。酵母中耐熱性鑒定表明, 正常條件下, 轉(zhuǎn)的酵母細(xì)胞與轉(zhuǎn)空載體對(duì)照酵母細(xì)胞的長(zhǎng)勢(shì)沒有明顯差異, 熱激處理同時(shí)降低, 但前者的長(zhǎng)勢(shì)相對(duì)更強(qiáng),的導(dǎo)入不影響細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育。推測(cè)通過水楊酸途徑介導(dǎo)植株耐熱性調(diào)控過程, 該過程依賴于H2O2存在。

小麥;; 定量表達(dá); 亞細(xì)胞定位; 耐熱性

植物熱激蛋白(heat shock protein, Hsp)與植株耐熱性密切相關(guān), 而植物熱激轉(zhuǎn)錄因子(heat shock transcription factor, Hsf)是熱激蛋白基因及耐熱性相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控的中心環(huán)節(jié), 是植物對(duì)高溫脅迫反應(yīng)的關(guān)鍵因子。自20世紀(jì)80年代后期酵母Hsf被首先克隆以來, 動(dòng)植物多個(gè)物種的基因被相繼獲得[1-3]。熱激轉(zhuǎn)錄因子在植物中普遍存在, 首個(gè)植物基因來自番茄[4]。與其他生物體相比, 植物是一個(gè)多基因家族, 依據(jù)結(jié)構(gòu)分為A、B、C族和多個(gè)亞族。家族基因在不同物種中數(shù)目差異較大, 果蠅和酵母中只有1個(gè), 而小麥中至少有56個(gè)[5], 遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于已知的其他生物體。對(duì)該基因家族研究主要集中于模式植物的A1和A2亞族[6-8]。

B族的研究見報(bào)不多, 該族成員因不含激活結(jié)構(gòu)域而不能直接激活下游基因的表達(dá)。早期研究認(rèn)為其作用更多表現(xiàn)為抑制熱響應(yīng)基因的表達(dá)[9-10], 近年來越來越多的功能被報(bào)道。模式擬南芥中有5個(gè)B族, 其中和屬于熱誘導(dǎo)型, 主要在熱激反應(yīng)后期起作用, 但其熱激誘導(dǎo)表達(dá)的前提是與HsfA1a和HsfA1b結(jié)合。和被定位在細(xì)胞核, 正常生長(zhǎng)和熱恢復(fù)階段直接抑制熱激轉(zhuǎn)錄因子的活性, 進(jìn)而抑制一系列基因的表達(dá), 從而鈍化熱激反應(yīng)。但在熱激條件下, HsfB1和HsfB2b可能通過抑制某些干擾HsfA1轉(zhuǎn)移入核的基因的表達(dá), 促進(jìn)HsfA1進(jìn)入核內(nèi)而激活其的活性, 進(jìn)而提高耐熱能力[10], 表現(xiàn)出正向調(diào)控功能。和還參與的表達(dá)和抗病反應(yīng)[11], 過表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞死亡[12]。轉(zhuǎn)鷹嘴豆的擬南芥表現(xiàn)較強(qiáng)的抗旱和耐熱性[13]。組成型表達(dá)可降低節(jié)律相關(guān)基因Pseudo response regulator 7 (PRR7)的表達(dá), 使植株延遲開花, 下胚軸伸長(zhǎng), 在調(diào)控逆境條件下植株生物鐘變化方面起重要作用[14]。番茄作為共激活因子可增強(qiáng)和/或的活性, 熱激條件下可保持和恢復(fù)某些重要基因或持家基因的表達(dá)[15-16]。另外, 過表達(dá)擬南芥可特異性誘導(dǎo)根系發(fā)育[17], 水稻可通過結(jié)合特異HSE (Heat shock elements, HSE)而調(diào)控病程防御反應(yīng)[18]。可見, B族Hsf在植物抗逆、抗病過程中也發(fā)揮著重要的調(diào)控作用, 隨著研究的逐步深入, 越來越多B族的特性和功能將得以解析。

小麥的研究起步晚, 對(duì)其家族基因及個(gè)體特性和功能了解甚少。Qin等[19]利用材料TAM107 (耐熱)和中國春(熱敏感)研究熱脅迫條件下的基因表達(dá)譜, 共鑒定6560個(gè)熱脅迫響應(yīng)基因, 包括７個(gè)熱激轉(zhuǎn)錄因子, 其中一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子在40°C熱脅迫后上調(diào)表達(dá)128倍, 暗示該類基因在小麥耐熱性中的調(diào)控作用。Shim報(bào)道[20]小麥?zhǔn)苕k脅迫上調(diào), 參與小麥耐鎘反應(yīng)。Chauhan等[21]從小麥種子中克隆了基因, 并將其轉(zhuǎn)入擬南芥, 轉(zhuǎn)基因植株耐高溫、耐鹽和抗旱性提高, 中等高溫條件下生長(zhǎng)植株能積累相對(duì)較高的生物量和產(chǎn)量。Zhang等[22]在擬南芥中過表達(dá)小麥基因中發(fā)現(xiàn), 轉(zhuǎn)基因植株耐熱性和抗凍性提高。Xue等[5]利用電子表達(dá)技術(shù), 從小麥中識(shí)別出A、B、C家族的56個(gè)成員, 多個(gè)基因組成型表達(dá), A2、B2和A6亞族基因受熱激顯著上調(diào);直接調(diào)控小麥和類基因, 并增強(qiáng)植株耐熱性。

本實(shí)驗(yàn)室在多年研究玉米的基礎(chǔ)上, 克隆獲得小麥的完整編碼序列, 并研究了該基因的表達(dá)模式、亞細(xì)胞定位以及在高溫脅迫響應(yīng)過程中的作用, 為進(jìn)一步解析的生物學(xué)功能及調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù), 同時(shí)也為小麥耐熱性遺傳改良挖掘優(yōu)異基因資源。

1 材料與方法

1.1 材料培養(yǎng)

滄6005為半冬性小麥品種, 晚熟, 耐熱性較強(qiáng), 由河北省滄州市農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。精選的種子經(jīng)表面消毒, 再用自來水反復(fù)沖洗, 浸泡吸脹12 h后, 播至Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中, 置25°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待二葉一心時(shí)進(jìn)行不同處理, 取樣進(jìn)行表達(dá)分析。另于2015年10月上旬播種于河北省農(nóng)林科學(xué)院大河試驗(yàn)站, 常規(guī)種植, 不同生育期取樣并于液氮中速凍, 用于組織器官表達(dá)分析。

1.2 熱脅迫處理

參照李慧聰?shù)萚23]描述的方法進(jìn)行熱脅迫處理, 方法略有改進(jìn)。將小麥幼苗培養(yǎng)在Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中, 將生長(zhǎng)一致的幼苗分為7組進(jìn)行不同處理, 以25°C正常生長(zhǎng)的幼苗作對(duì)照。第1組熱脅迫處理, 營(yíng)養(yǎng)液于37°C培養(yǎng)箱預(yù)熱, 第2組在培養(yǎng)液中加入水楊酸(0.8 mmol L–1), 第3組在培養(yǎng)液中加入H2O2(10 mmol L–1), 處理時(shí)間為0.5、1、1.5、2和4 h; 第4組先用0.8 mmol L–1水楊酸預(yù)處理1.5 h, 再移至與第2組成分相同培養(yǎng)液中, 37°C熱處理1.5 h; 第5組先用10 mmol L–1H2O2預(yù)處理1.5 h, 然后移入與第3組成分相同營(yíng)養(yǎng)液中, 37°C熱處理1.5 h; 第6組經(jīng)150 μmol L-1二苯基碘(diphenylene iodonium, DPI)和20 mmol L–1二甲基硫脲(dimethylthiourea, DMTU)預(yù)處理2 h; 第7組經(jīng)150 μmol L-1二苯基碘(diphenylene iodonium, DPI)和20 mmol L–1二甲基硫脲(dimethylthiourea, DMTU)預(yù)處理2 h后, 于37°C培養(yǎng)箱中熱激處理1 h; 第8組經(jīng)150 μmol L-1二苯基碘(diphenylene iodonium, DPI)和20 mmol L–1二甲基硫脲(dimethylthiourea, DMTU)預(yù)處理2 h后, 用0.8 mmol L–1水楊酸處理1.5 h。DPI為H2O2合成抑制劑, DMTU為羥自由基清除劑。所有處理均取第2展開葉, 液氮速凍, 用于RNA提取。

1.3 TaHsfB2d的cDNA序列擴(kuò)增與測(cè)序

采用RNArose Reagent Systems試劑盒(上海華舜生物工程公司)提取總RNA, 經(jīng)DNaseI(TaKaRa)處理除去殘留的基因組DNA, 然后取1 μg RNA, 用SuperScript IV First-Strand Synthesis System反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen)合成cDNA第一鏈。設(shè)計(jì)特異引物(F: 5′-ATCGGGAAGCTACTACGGGGTTC-3′; R: 5′-GCTTCTACAACATCGTCCAC-3′), 利用高保真酶Pyrobest (TaKaRa)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR體系25 μL, 含10× Pyrobest buffer 2.5 μL、dNTP mixture (2.5 mmol L-1) 2 μL、1st strand cDNA 2 μL、20 μmol L-1forward primer 0.25 μL、20 μmol L-1reverse primer 0.25 μL、pyrobest DNA polymerase 0.25 μL和ddH2O 17.75 μL。反應(yīng)程序?yàn)?8°C 10 s, 55°C 15 s, 72°C 2 min, 30個(gè)循環(huán)。將擴(kuò)增產(chǎn)物連接T載體(pEasy-Blunt Simple Cloning Kit, TransGen Biotech)后, 送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

1.4 qRT-PCR分析

依據(jù)Xue等[5]對(duì)小麥的分析結(jié)果, 設(shè)計(jì)的特異引物(F: 5′-CGTCTCCATCGGGCT GAA-3′; R: 5￠-CGTCGCCGTCTTCTTCCTC-3′), 內(nèi)參基因?yàn)?F: 5￠-GCACACGTGCTTTGCAGA TAAG-3￠; R: 5￠-GCCCTCAAGCTCAACCATAACT- 3￠)。PCR體系20 μL, 含SYBR Premix ExII 10 μL、10 μmol L–1Forward primer 0.8 μL、10 μmol L–1Reverse primer 0.8 μL、1st strand cDNA 1 μL和ddH2O 7.4 μL。反應(yīng)在7500 Real-time PCR System (Applied Biosystems, USA)上進(jìn)行PCR, 反應(yīng)程序?yàn)轭A(yù)變性95°C 10 min; 變性 95°C 5 s; 退火/延伸60°C 1 min, 45個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后, 采用2–ΔΔCt法分析數(shù)據(jù)。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)生物學(xué)樣本, 每個(gè)生物學(xué)樣本設(shè)3次技術(shù)重復(fù)。數(shù)據(jù)為3個(gè)生物學(xué)重復(fù)平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤, 組織表達(dá)試驗(yàn)以幼根表達(dá)量為1, 其余設(shè)置0 min的表達(dá)量為1。

1.5 TaHsfB2d亞細(xì)胞定位分析

帶有綠色熒光蛋白()基因的植物表達(dá)載體pJIT163-hGFP (由中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所范仁春博士提供)通過35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)目的基因和基因的融合表達(dá)[24], 顯示目的蛋白的亞細(xì)胞定位。通過設(shè)計(jì)特異引物(F: 5′-GAGAACACGGGGG ACTCTAGAATGTCGGCCGAGCAT-3′; R: 5′-GCCC TTGCTCACCATGGATCCCCTCGAGTTGGATCT-3′), 擴(kuò)增編碼區(qū), 產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶d III和H I消化后, 連接到表達(dá)載體pJIT163- hGFP上。參照李慧聰?shù)萚25]描述的方法進(jìn)行金粉包埋和基因槍轉(zhuǎn)化。經(jīng)瞬時(shí)表達(dá)處理的洋蔥表皮細(xì)胞于22°C暗培養(yǎng)16 h, 然后放入濃度為10 μg mL–1的4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)染色液中染色3~5 min, 用生理鹽水沖洗干凈, 于激光共聚焦顯微鏡(Zeiss META510)下觀察熒光。

1.6 構(gòu)建酵母表達(dá)載體

酵母表達(dá)載體pYES2 (Invitrogen, 美國)用于釀酒酵母中目的蛋白的表達(dá), 其特點(diǎn)在于GAL1啟動(dòng)子能夠在釀酒酵母中被半乳糖高水平誘導(dǎo)從而驅(qū)動(dòng)目的蛋白表達(dá), 同時(shí)能夠被葡萄糖抑制表達(dá), 可利用URA3基因篩選帶有基因型的酵母宿主菌株轉(zhuǎn)化子。結(jié)合ClonExpress II重組反應(yīng)系統(tǒng)(諾唯贊生物科技有限公司)設(shè)計(jì)擴(kuò)增特異引物(F: 5￠-GGGAATATTAAGCTTGGTACCATGGCGGCCGAGCATGGC-3￠; R: 5￠-TGATGGATATCTGCAGAATT CTCAACCTCGAGTTGGATCT-3￠), 利用高保真PCR聚合酶擴(kuò)增, 獲得的PCR產(chǎn)物。利用限制性內(nèi)切酶I和R I (NEB公司)對(duì)載體pYES2進(jìn)行酶切, 電泳后回收得到線性化載體。將PCR產(chǎn)物與線性化載體按1∶2的摩爾比混合, 利用ClonExpress II快速克隆技術(shù)進(jìn)行重組反應(yīng)。于冰水浴中配制如下反應(yīng)體系, 即4 μL 5× ClonExpress II buffer, 50~200 ng線性化載體, 20~200 ng插入片段擴(kuò)增產(chǎn)物, 2 μL Exnase II, 加無菌水至總體積2 μL。混勻各組分后, 于37°C反應(yīng)30 min, 之后立即置冰浴中冷卻5 min, 然后利用熱激法將反應(yīng)產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞, 37°C倒置培養(yǎng)過夜。用無菌的牙簽將單個(gè)菌落挑至100 μL新鮮的LB培養(yǎng)基中, 混勻, 取2 μL作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 根據(jù)電泳條帶大小選擇正確的克隆進(jìn)行序列測(cè)定。

1.7 TaHsfB2d在酵母中轉(zhuǎn)化及耐熱性鑒定

參照Gietz等[26]的方法, 將測(cè)序正確的重組載體轉(zhuǎn)化酵母INVSc1感受態(tài)細(xì)胞, 然后將細(xì)胞均勻涂抹在SC-Glu-Ura-篩選平板上, 30°C培養(yǎng)2~3 d。采用菌落PCR方法鑒定陽性克隆。

分別以重組載體pYES2-TaHsfB2d和空載體pYES2轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞INVSc1, 篩選陽性酵母克隆。分別挑選2個(gè)菌系的陽性克隆, 在SC-Glu-Ura-液體培養(yǎng)基振蕩(250 r min–1)培養(yǎng)過夜, 檢測(cè)OD600值。用SC-Glu-Ura-液體培養(yǎng)基將酵母菌液稀釋到OD600值為0.2, 重新振蕩(200 r min–1)培養(yǎng)2~3 h, OD600值達(dá)到0.4~0.8之間即酵母指數(shù)生長(zhǎng)期, 離心收集菌體, 無菌水洗滌兩遍, 除去培養(yǎng)基, 然后梯度稀釋到0.1、0.05和0.01共3個(gè)OD值, 分成2組, 一組作為對(duì)照, 另一組于50°C水浴中熱激處理15 min。吸取8 μL, 分別點(diǎn)在加入半乳糖的SC-Gal-Ura-固體培養(yǎng)基上, 30°C生長(zhǎng)2~3 d, 觀察并拍照。另外, 將指數(shù)生長(zhǎng)期的酵母細(xì)胞稀釋到SC-Gal-Ura-液體培養(yǎng)基中, 分成2組, 一組作為對(duì)照, 另一組于50°C水浴中熱激處理45 min, 振蕩(200 r min–1)培養(yǎng)24 h, 期間每間隔3 h測(cè)定一次OD600值, 計(jì)算生長(zhǎng)速率。采用Microsoft Excel軟件分析數(shù)據(jù), 計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)誤差。采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)方法分析差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥熱激轉(zhuǎn)錄因子TaHsfB2d的cDNA序列擴(kuò)增與分析

將二葉一心小麥幼苗于37°C熱脅迫處理1.5 h, 提取葉片總RNA, 以此為模板, 利用特異性引物, 擴(kuò)增獲得基因的cDNA序列(圖1), 序列全長(zhǎng)1191 bp, 編碼396個(gè)氨基酸殘基。通過結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn), TaHsfB2d蛋白序列包含DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA binding domain, DBD, NCBI網(wǎng)站分析, 下畫線部分)和核定位信號(hào)序列KRAR (nuclear localization signal, NLS, NucPred軟件分析)序列。蛋白相似性分析表明, TaHsfB2d蛋白與大麥未知蛋白(序列號(hào)為BAJ85352.1)、大麥HvHsfB2c (序列號(hào)為AEB 26596.1)和二穗短柄草BdHsfB2c (序列號(hào)為XP_ 003578478.1)的相似性分別為92%、85%和80% (圖2)。

圖1 小麥TaHsfB2d的核苷酸和氨基酸序列

下畫線表示Hsf家族保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域; 灰色區(qū)域顯示核定位信號(hào)序列(NLS)。

The conserved DNA binding domain of Hsf family is underlined, and the nuclear localization signal (NLS, KRAR) is in grey background.

2.2 小麥熱激轉(zhuǎn)錄因子TaHsfB2d在不同組織器官中的表達(dá)

qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn), 在檢測(cè)的小麥幼苗期根、莖和葉片, 開花期根、莖、葉片、雌雄蕊和萼片, 以及生育后期幼嫩和成熟種子中,均有不同程度表達(dá), 與幼嫩根系中表達(dá)相比, 成熟根系中表達(dá)量最高, 為幼根的33倍; 幼莖和萼片中次之, 數(shù)值約達(dá)到18倍和15倍; 接近于幼嫩根系, 幼葉和雌蕊中的表達(dá)量較低(圖3)。

2.3 不同逆境對(duì)小麥熱激轉(zhuǎn)錄因子TaHsfB2d表達(dá)的調(diào)控

分別提取不同逆境脅迫下小麥幼苗葉片的總RNA, 定量分析表達(dá)量的變化表明, 37°C熱處理(圖4-A)、0.8 mmol L–1水楊酸(圖4-B)和10 mmol L–1H2O2(圖4-C)單獨(dú)處理均能不同程度上調(diào)表達(dá), 處理1.5 h時(shí)達(dá)到峰值, 最大表達(dá)量分別為正常對(duì)照的34、8和61倍, 熱脅迫和H2O2處理誘導(dǎo)作用強(qiáng)于水楊酸處理, 處理4 h時(shí),仍能保持較高的表達(dá)水平。

用水楊酸和H2O2預(yù)處理1.5 h后再于37°C熱激(圖4-D)發(fā)現(xiàn), 熱激能顯著增強(qiáng)SA和H2O2對(duì)表達(dá)的誘導(dǎo)作用, 表達(dá)量約分別達(dá)到單獨(dú)SA和H2O2處理時(shí)的19.5倍和3.0倍, 該數(shù)值顯著高于單獨(dú)熱脅迫處理。

圖2 小麥TaHsfB2d編碼蛋白與其他蛋白的相似性比較

NCBI同類蛋白包括大麥未知蛋白Hv predicted protein (BAJ85352.1)、大麥HvHsfB2c (AEB26596.1)和二穗短柄草BdHsfB2c (XP_003578478.1)。

Proteins for alignment in NCBI were Hv predicted protein (BAJ85352.1), HvHsfB2c (AEB26596.1), and BdHsfB2c (XP_003578478.1).

用150 μmol L–1H2O2合成抑制劑DPI和20 mmol L–1羥自由基清除劑DMTU聯(lián)合處理2 h (圖4-E),表達(dá)與正常對(duì)照差異不明顯, 二者預(yù)處理后再熱激1 h時(shí),的表達(dá)顯著低于單獨(dú)熱處理, 熱激上調(diào)表達(dá)被顯著抑制; 如果預(yù)處理后再用SA處理1.5 h,上調(diào)表達(dá)完全被抑制。

2.4 小麥熱激轉(zhuǎn)錄因子TaHsfB2d的亞細(xì)胞定位

構(gòu)建瞬時(shí)表達(dá)載體pJIT163-TaHsfB2d-hGFP并轉(zhuǎn)化洋蔥內(nèi)表皮, 通過融合基因表達(dá)顯示目的蛋白的亞細(xì)胞定位。利用激光共聚焦顯微鏡觀察熒光發(fā)現(xiàn), 正常條件下, 觀察到GFP綠色熒光只分布在細(xì)胞核, 且與核特異染料DAPI熒光完全重合(圖5), 表明TaHsfB2d蛋白定位于細(xì)胞核。

圖3 TaHsfB2d在小麥不同組織器官中的定量表達(dá)

數(shù)據(jù)為3個(gè)生物學(xué)重復(fù)平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。

Each bar value represents ± SD of triplicate experiments.

圖4 37°C熱脅迫, 0.8 mmol L–1 SA和10 mmol L–1 H2O2分別處理和聯(lián)合處理對(duì)小麥葉片TaHsfB2d表達(dá)量的影響

A: 單獨(dú)37°C熱處理; B: 單獨(dú)0.8 mmol L–1SA處理; C: 單獨(dú)10 mmol L–1H2O2處理; D: SA和H2O2分別預(yù)處理1.5 h后再于37°C熱激處理; E: H2O2合成抑制劑DPI和清除劑DMTU預(yù)處理2 h后, 再分別于37°C熱激1 h和SA處理1.5 h。數(shù)據(jù)為3個(gè)生物學(xué)重復(fù)平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

A: HS at 37°C; B: 0.8 mmol L–1SA treatment; C: 10 mmol L–1H2O2treatment; D: HS at 37°C after pretreatment with SA and H2O2for 1.5 h, respectively; E: Treatments under 37°C heat shock for 1 h and 0.8 mmol L–1SA for 1.5 h, respectively, after pretreated with DPI and DMTU for 2 h. Each bar value represents mean±SD of triplicate experiments.

圖5 小麥TaHsfB2d蛋白在洋蔥表皮細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位

A: 明視野下35S:TaHsfB2d-hGFP熒光; B: 35S:TaHsfB2d-hGFP綠色熒光; C: 35S:TaHsfB2d-hGFP的DAPI紅色熒光; D: 疊加圖像。

A: epidermal cells of onion expressing 35S:TaHsfB2d-hGFP under white light; B: epidermal cells of onion expressing 35S: TaHsfB2d-hGFP under green channel florescence; C: epidermal cells of onion expressing 35S: TaHsfB2d-hGFP under DAPI red florescence; D: merge of DAPI and green channel florescence.

2.5 小麥熱激轉(zhuǎn)錄因子TaHsfB2d在酵母中的耐熱性調(diào)控分析

將小麥在酵母中轉(zhuǎn)化并進(jìn)行熱激處理,在正常生長(zhǎng)條件下, 在半乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基上, 轉(zhuǎn)與轉(zhuǎn)空載體pYES2的酵母細(xì)胞的長(zhǎng)勢(shì)和大小無明顯差異(圖6-A); 經(jīng)50°C熱激處理45 min后, 轉(zhuǎn)基因酵母細(xì)胞和轉(zhuǎn)空載體對(duì)照細(xì)胞的生長(zhǎng)速度均受到抑制, 但是轉(zhuǎn)基因酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)受抑制程度明顯小于轉(zhuǎn)空載體對(duì)照細(xì)胞, 細(xì)胞數(shù)目明顯多于對(duì)照, 細(xì)胞大小沒有明顯差異(圖6-B)。從酵母細(xì)胞生長(zhǎng)曲線也可看出, 正常培養(yǎng)條件下轉(zhuǎn)pYES2和pYES2-TaHsfB2d酵母細(xì)胞生長(zhǎng)較快, 生長(zhǎng)速度沒有明顯差異(圖6-C); 50°C熱激處理后細(xì)胞生長(zhǎng)速度均降低, 但處理15 h后轉(zhuǎn)pYES2- TaHsfB2d酵母細(xì)胞生長(zhǎng)速率明顯高于轉(zhuǎn)空載體對(duì)照細(xì)胞(圖6-D), 表明能在酵母細(xì)胞中被誘導(dǎo)表達(dá), 且能顯著提高酵母細(xì)胞的耐熱性。

3 討論

2014年, Xue等[5]通過生物信息學(xué)分析推測(cè)小麥中含有56個(gè)Hsf成員, 其中A、B、C族各占33個(gè)、11個(gè)和12個(gè), B2亞族有5個(gè), 多個(gè)基因呈組成型表達(dá)。關(guān)于小麥Hsf家族結(jié)構(gòu)和個(gè)體功能了解甚少, 僅對(duì)、、()和進(jìn)行了功能分析, 其中介導(dǎo)了小麥耐鎘反應(yīng)[20]; 轉(zhuǎn)可提高擬南芥植株的耐熱、耐鹽和抗旱性[21]; 過表達(dá)可增強(qiáng)擬南芥植株的耐熱和抗凍性[22]; 過表達(dá)可激活下游熱激蛋白基因的表達(dá)[5]。

圖6 正常培養(yǎng)和50°C熱激處理轉(zhuǎn)pYES2和pYES2-TaHsfB2d酵母細(xì)胞生長(zhǎng)勢(shì)比較

A: 30°C下正常生長(zhǎng), B: 50°C熱脅迫45 min, 于30°C恢復(fù)生長(zhǎng)3 d; C: 30°C下正常生長(zhǎng)測(cè)定酵母細(xì)胞OD600值; D: 50°C熱脅迫45 min后于30°C恢復(fù)生長(zhǎng)測(cè)定酵母細(xì)胞OD600值。數(shù)據(jù)為3個(gè)生物學(xué)重復(fù)平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

A: culture at 30°C; B: HS at 50°C for 45 min, then culture at 30°C for 3 days; C: OD600of transformed yeast cells at 30°C; D: OD600of transformed yeast cells at 50°C for 45 min and then culture at 30°C. The error bar represents ±SD of triplicate experiments.

本實(shí)驗(yàn)室在前期研究玉米A1亞族[25,27]的基礎(chǔ)上, 從小麥幼葉中克隆獲得的cDNA序列, 分析表明, 該序列全長(zhǎng)為1191個(gè)核苷酸, 編碼396個(gè)氨基酸殘基。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)含有完整的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和核定位信號(hào)序列, 正常生長(zhǎng)條件下, TaHsfB2d蛋白定位在細(xì)胞核, 與小麥()定位保持一致。同源分析表明, TaHsfB2d蛋白與大麥未知蛋白的相似性最高, 達(dá)92%, 與大麥HvHsfB2c和二穗短柄草BdHsfB2c的相似性分別為85%和80%。擬南芥、番茄和大豆HsfB1的C末段均含有一段保守序列, 即11個(gè)氨基酸GEGLKLFGVWL的BRD抑制域, 為基因HsfB1抑制熱誘導(dǎo)基因表達(dá)所必需[28-29]。但是, 作為HsfA1共激活因子, 番茄HsfB1依賴于C末段一段類組氨酸序列(GRGKMMK), 該序列為植物CBP/HAC1的結(jié)合位點(diǎn)[30]。可見, C末段氨基酸序列不同導(dǎo)致基因功能的差異性。通過比對(duì),與番茄和擬南芥同源性較低, C末段既不含有11個(gè)氨基酸的保守序列, 也不含有類組氨酸序列。那么, TaHsfB2d的C末段結(jié)構(gòu)上的不同是否導(dǎo)致功能特異尚未見報(bào)道。

早期研究認(rèn)為B族Hsf成員主要抑制熱響應(yīng)基因的表達(dá)[9-10], 隨著研究的深入, 越來越多的研究發(fā)現(xiàn)B族Hsf受多種逆境脅迫誘導(dǎo)表達(dá), 參與植株耐熱、抗旱和抗病等多種生物和非生物脅迫及生長(zhǎng)發(fā)育過程[10-13,31]。非脅迫條件下, 擬南芥HsfB1和HsfB2b定位在細(xì)胞核, 直接抑制HsfA2、HsfA7a、HsfB1和HsfB2b的表達(dá)[10]。小麥在多個(gè)器官中表達(dá), 但在小穗中高表達(dá), 且高、低溫和干旱、NaCl均能上調(diào)的表達(dá)[22]。本研究結(jié)果顯示,在小麥不同時(shí)期的多種組織器官中均有表達(dá), 在成熟植株根系中表達(dá)量較高。37°C熱脅迫、水楊酸和H2O2處理均能顯著上調(diào)葉片的表達(dá), 同時(shí)熱激能顯著增強(qiáng)SA和H2O2對(duì)表達(dá)的誘導(dǎo)作用, 表明屬于熱誘導(dǎo)型, 可能參與多種逆境脅迫響應(yīng)過程水楊酸介導(dǎo)植物耐熱性尤其是植株獲得耐熱性的過程[32-33], 水楊酸可上游調(diào)控?cái)M南芥的表達(dá), 該過程需要借助H2O2信號(hào)途徑, 同時(shí)依賴相關(guān)熱激蛋白基因的表達(dá)[34]。我們前期研究也表明, 42°C熱激和H2O2處理均能顯著上調(diào)玉米的表達(dá), 熱激上調(diào)的表達(dá)依賴于H2O2的存在[25]。模式植物擬南芥受熱誘導(dǎo)和氧化脅迫誘導(dǎo)高表達(dá)[35-36], 在介導(dǎo)植株獲得耐熱性過程中[33], 水楊酸在上游調(diào)控的表達(dá), 該過程借助H2O2信號(hào)途徑[32,34]。本研究結(jié)果中, 用H2O2合成抑制劑DPI和自由基清除劑DMTU聯(lián)合預(yù)處理后再熱激處理, 發(fā)現(xiàn)熱激對(duì)的上調(diào)表達(dá)作用被顯著抑制, 如果預(yù)處理后再用SA處理, SA對(duì)的上調(diào)表達(dá)作用被完全抑制, 說明熱激上調(diào)的表達(dá)部分依賴于H2O2的存在, 而正常條件下SA上調(diào)的表達(dá)完全依賴于H2O2的存在。推測(cè)可能通過水楊酸途徑介導(dǎo)植株耐熱性調(diào)控過程, 該過程依賴于H2O2的存在。

20世紀(jì)80年代后期酵母被首先克隆, 之后, 越來越多動(dòng)植物物種的基因被相繼獲得和注釋。酵母中只有1個(gè), 相對(duì)簡(jiǎn)單, 以酵母為轉(zhuǎn)化系統(tǒng)來驗(yàn)證的功能越來越得到應(yīng)用[37]。本研究通過轉(zhuǎn)化酵母發(fā)現(xiàn), 正常生長(zhǎng)條件下, 轉(zhuǎn)基因酵母和轉(zhuǎn)空載體對(duì)照細(xì)胞的長(zhǎng)勢(shì)沒有明顯差異; 經(jīng)50°C熱激處理45 min后, 轉(zhuǎn)基因酵母細(xì)胞和轉(zhuǎn)化空載體對(duì)照細(xì)胞的生長(zhǎng)速度均受到抑制, 但是前者受抑制程度明顯小于后者。表明能在酵母細(xì)胞中被誘導(dǎo)表達(dá), 且能顯著提高酵母細(xì)胞的耐熱性, 初步證實(shí)的耐熱性調(diào)控功能。熱脅迫后, 轉(zhuǎn)基因酵母菌斑與對(duì)照沒有明顯差異, 說明的導(dǎo)入不影響酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程。Ogawa等[38]在擬南芥中過表達(dá)發(fā)現(xiàn),表達(dá)量越高, 植株矮化越明顯, 但基礎(chǔ)耐熱性卻顯著增強(qiáng)。目前正在通過轉(zhuǎn)基因擬南芥植株對(duì)的耐熱性功能進(jìn)行深入的研究。

4 結(jié)論

小麥B族熱激轉(zhuǎn)錄因子基因的cDNA序列全長(zhǎng)1191 bp, 編碼396個(gè)氨基酸殘基。蛋白質(zhì)序列含有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和核定位信號(hào)序列。TaHsfB2d與大麥未知蛋白的相似性最高, 達(dá)92%。正常條件下,在小麥多個(gè)組織器官中組成型表達(dá), 基因表達(dá)受37°C熱脅迫、外源水楊酸和H2O2顯著上調(diào), 且熱激上調(diào)的表達(dá)部分依賴于H2O2存在, 而水楊酸上調(diào)的表達(dá)完全依賴于H2O2存在。TaHsfB2d定位于細(xì)胞核。轉(zhuǎn)酵母的耐熱性被顯著提高。

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Cloning and Characterization of Heat Shock Transcription Factor Geneand Its Regulating Role in Thermotolerance

ZHAO Li-Na1,2,**, LIU Zi-Hui1,**, DUAN Shuo-Nan1, ZHANG Yuan-Yuan1,2, LI Guo-Liang1,*,and GUO Xiu-Lin1,*

1Institute of Genetics and Physiology, Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences / Plant Genetic Engineering Center of Hebei Province, Shijiazhuang 050051, Hebei, China;2College of Life Sciences, Hebei Normal University, Shijiazhuang 050024, Hebei, China

Heat shock transcription factors (Hsfs) are key components of heat shock signal transduction pathways involved in the activation of Hsp genes in response to heat stress in plants. There are at least 56 members in wheat Hsf family. Eleven of them belong to class B, among which 5 members belong to subclass B2. In this study,was isolated from wheat (L.) young leaves treated by heat shock at 37°C for 1.5 h using homologous cloning methods. Sequence analysis showed that the coding sequence (CDS) ofwas 1191 bp encoding a protein of 396 amino acids. The amino acid sequence analysis demonstrated that TaHsfB2d contained a DNA-binding domain (DBD) and nuclear localization signal (NLS). TaHsfB2d protein sequence shared 90%, 85%, and 80% identities with the proteins from predicted protein of, HsfB2c ofand, respectively. The qRT-PCR results showed thatwas expressed in multiple tissues and organs of wheat, and the relative expression level ofwas higher in roots at anthesis stage.was up-regulated by 37°C heat shock (HS), salicylic acid (SA) and H2O2in leaves. Furthermore, HS significantly enhanced the expression ofpretreated with SA or H2O2, the up-regulation expression ofby HS was significantly inhibited by the combined treatment of 150 μmol L–1DPI and 20 mmol L–1DMTU, and the up-regulation expression by SA was completely inhibited. Through transient reporter assay with onion (L.) epidermal cells, we found that TaHsfB2d localized in the nuclei. Yeast overexpressingshowed stronger growth potential than the control cells overexpressing pYES2 after HS at 50°C for 45 min, and overexpression ofhad no effect on the growth and development of yeast cells. The results revealed that TaHsfB2d perhaps plays a key role in regulating the response to HS through SA signal pathway in plants, which was dependent on existence of H2O2. These results will provide theoretical basis for analysing biological functions and regulating mechanism offurther.

wheat;; subcelullar-localization; quantitative expression; thermotolerance

2017-03-13;

2017-09-10;

2017-09-29.

10.3724/SP.J.1006.2018.00053

通信作者(Corresponding authors): 李國良, E-mail: guolianglili@163.com, Tel: 0311-87652127; 郭秀林, E-mail: myhf2002@163.com, Tel: 0311-87269032

**同等貢獻(xiàn)(Contributed equally to this work)

本研究由河北省自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(C2016301085), 河北省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程項(xiàng)目(2017038997, F17C10006), 河北省財(cái)政專項(xiàng)(494-0402-JBN-VT68)和河北省高層次人才項(xiàng)目(A201500130)資助。

This study was supported by the Key Project of Natural Science Foundation of Hebei Province (C2016301085), the Technological Innovation Project of Modern Agriculture of Hebei Province (2017038997, F17C10006), the Key Research Project of Hebei Province (494-0402- JBN-VT68), and the High-level Talent Project of Hebei Province (A201500130).

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20170929.0218.002.html