劉天鵬 董孔軍 董喜存 何繼紅 劉敏軒 任瑞玉 張 磊 楊天育,4,

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12C6+離子束輻照糜子誘變突變群體的構建與SSR分析

劉天鵬1董孔軍1董喜存2何繼紅1劉敏軒3任瑞玉1張 磊1楊天育1,4,*

1甘肅省農業(yè)科學院作物研究所, 甘肅蘭州 730070;2中國科學院近代物理研究所, 甘肅蘭州 730000;3中國農業(yè)科學院作物科學研究所, 北京 100081;4甘肅農業(yè)大學生命科學技術學院, 甘肅蘭州 730070

為構建物理誘變糜子突變體庫, 采用50、100、150、200和250 Gy劑量碳離子束(12C6+)輻照隴糜7號和晉黍9號種子, 結合混合系譜法和系統(tǒng)聚類分別構建2個含52和79個株系的M5寡表型突變群體。田間試驗結果顯示, 誘變M1出苗率隨劑量增大明顯降低, 隴糜7號M1半致死劑量為150 Gy, 晉黍9號M1半致死劑量為100 Gy, 且100、150 Gy誘變下M4變異最多。不同誘變劑量下M5、M6表型穩(wěn)定且株高、產量性狀、成株色及粒色均表現(xiàn)出明顯遺傳差異。從2個M6群體中分別選擇9和11個代表性株系, 利用多態(tài)性SSR引物進行分子驗證, 與親本相比, 6對SSR引物在隴糜7號的9個株系中位點變異基因型數(shù)為1~2, 在晉黍9號的11個株系中位點變異基因型數(shù)為1~4, 突變群體存在豐富的遺傳多樣性。

碳(12C6+)離子; 物理誘變; 突變體; 譜系; SSR標記

突變體是遺傳研究的有益材料, 已利用生物、物理和化學誘變構建了大規(guī)模擬南芥、水稻突變體庫[1-2], 為科學研究提供了重要基礎材料。物理誘變多產生少數(shù)位點突變, 且純合速度較有性雜交快, 各類物理誘變劑現(xiàn)已廣泛應用于作物誘變育種和特異突變種質創(chuàng)制[3-4], 重離子束因擁有高傳能線密度和獨特的電離峰, 可誘發(fā)多種多樣性突變材料[5], 其中碳離子(12C6+)束具有突變譜廣、突變性狀容易穩(wěn)定、正向突變率高等獨特優(yōu)勢[6], 已在水稻、大豆[7-8]等作物中用于突變體篩選、誘變機制、生物學效應的研究。糜子(L.)屬禾本科黍屬(), 一年生草本植物, 有粳、糯兩種類型, 是短日照C4作物[9-10], 熟性、株高、穗型、粒色、成株色、穗下節(jié)間長、單株莖數(shù)、葉相等性狀表型多樣, 特別是粒色最為豐富, 有白、灰、紅、黃、褐和復色[11], 其中復色組合方式又多樣, 成為區(qū)分不同糜子種質資源和鑒定真假雜交種的重要形態(tài)標記之一, 但有關糜子典型性狀多樣性的遺傳機理研究較少, 多數(shù)遺傳研究主要集中在糜子種質資源多樣性評價方面[12-13]。近年來, 構建糜子臨時作圖群體, 設計SSR引物, 利用分子遺傳學和轉錄組學技術繪制遺傳圖譜的研究, 為解析相關性狀遺傳規(guī)律奠定了基礎[14-15], 但要實現(xiàn)圖位克隆目標基因, 不僅需要構建永久作圖群體(RIL)并篩選穩(wěn)定QTL, 也需進一步構建飽和遺傳作圖群體, 其過程復雜且時間長[16-17], 而12C6+重離子輻照誘變的單一表型突變體可直接與誘變親本構建位點特異作圖群體, 快速定位目標性狀并克隆靶基因, 同時可通過單一突變體定位克隆、構建cDNA進行序列分析及RT-PCR擴增, 與野生親本比較, 實現(xiàn)快速解析其遺傳差異機制[18]。對此, 本文采用不同劑量碳離子(12C6+)輻照糜子種子, 確定了適宜輻照劑量, 構建了2個寡表型突變群體, 并初步進行遺傳差異分析, 為深度研究糜子相關性狀遺傳規(guī)律提供了有益突變材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

每個劑量分別選用褐色籽粒粳型品種隴糜7號200粒、白紅復色籽粒糯性品種晉黍9號100粒飽滿種子進行碳離子束(12C6+)輻照誘變。

1.2 輻照方法

輻照處理的碳離子束(12C6+)由中國科學院近代物理研究所蘭州重離子加速器(HIRFL)提供, 能量80 MeV u–1, 劑量率20 Gy min–1, 輻照劑量50、100、150、200和250 Gy。

1.3 突變群體構建

2012年于甘肅會寧種植不同輻照劑量輻照的隴糜7號和晉黍9號, 五葉期統(tǒng)計成苗數(shù), 成熟后混合收獲成穗株建M1; 2012年冬在海南三亞加代, 播種M1所有種子, 成熟后混合收獲建M2; 2013年在甘肅會寧種植M2混收種子, 成熟期以粒色為形態(tài)指標結合植株綜合表現(xiàn)選不同輻照劑量下變異單株建M3; 2014在甘肅會寧種植M3突變單株, 按粒色和植株綜合表現(xiàn)選單株建M4株系譜; 2015年設對照種植株系M5, 按株系記載物候期、成株色、穗型, 成熟后隨機取10株, 室內考察株高、莖粗、莖節(jié)數(shù)、穗長、穗分枝長短、穗下節(jié)間長、單株莖數(shù)、單株成穗數(shù)、單株穗重、單株粒重、單株草重、千粒重、粒色13個農藝性狀; 2016年設重復種植寡表型突變體株系(M6)(圖1), 記載物候期、成株色、穗型, 成熟后取10株考察株高、莖粗、莖節(jié)數(shù)、穗長、單株成穗數(shù)、單株穗重、單株粒重、單株草重、千粒重、粒色10個性狀并收獲小區(qū)測產, 抽穗期采集各株系倒一至倒三葉新鮮葉片, 液氮條件下保存, 用于分子驗證。

圖1 碳離子束輻照糜子籽粒誘變的寡表型性狀突變的譜系構建過程

1.4 田間試驗

2012年田間試驗按表1順序點種不同劑量碳離子束輻照的隴糜7號、晉黍9號籽粒, 五葉期統(tǒng)計不同劑量下存活苗數(shù)。2015年寡表型突變體遺傳差異試驗以隴糜7號(CKJ0、CKJ1、CKJ2、……、CKJ9)、晉黍9號(CKN0、CKN1、CKN2、……、CKN14)為對照, 間比排列, 每9份材料設一對照, 小區(qū)面積3 m2(行長5 m、行距30 cm, 2行區(qū)), 每公頃留苗60萬株, 田間種植順序及突變株名稱見表1。2016年寡表型突變體代表株系遺傳差異試驗, 以隴糜7號(CKJ)、晉黍9號(CKN)為對照, 完全隨機區(qū)組設計, 3次重復, 小區(qū)面積3.6 m2(行長3 m、行距30 cm, 4行區(qū)), 每公頃留苗60萬株。

1.5 SSR標記分析

選用高通量測序結合磁珠富集法開發(fā)[11]的糜子6對多態(tài)性SSR引物(表2), 對9個隴糜7號突變株系和11個晉黍9號突變株系進行PCR擴增, 采用Fang等[19]的基因組提取方法及PCR體系。

1.6 數(shù)據分析

采用Microsoft Excel 2007、SPSS19.0、DPS7.05處理數(shù)據, 選用卡方距離、可變類平均值法聚類分析, 粒色、成株色、穗型分別賦值, 其中隴糜7號M5粒色褐、黃分別賦值0、1; 晉黍9號M5粒色白紅復色、白、紅、黃、白褐復色、白灰復色、黃灰復色、褐、灰分別賦值0、1、2、3、4、5、6、7、8、9; 成株色黃、紫分別賦值0、1; 穗型側、散賦值0、1。

表1 輻照糜子M5株系田間種植順序及名稱

(續(xù)表1)

表2 用于誘變M6分子標記分析的SSR引物

2 結果與分析

2.1 12C6+離子束輻照糜子M1出苗率及最適劑量

從圖2可以看出, 2份材料誘變后均表現(xiàn)出隨劑量加大M1出苗率明顯下降的趨勢。在50、100、150、200和250 Gy下, 隴糜7號M1出苗率(圖2-A)分別為83%、71.5%、51%、41%和38%, 晉黍9號(圖2-B)分別為77%、45%、41%、19%和21%, 半致死劑量分別為150 Gy、100 Gy, 但晉黍9號在150 Gy下出苗率亦接近100 Gy處理。經連續(xù)3年田間鑒定, 50、100、150、200和250 Gy下, 隴糜7號分別選出M4變異株4、9、1、2和4個, M5穩(wěn)定株19、26、11、10和15個, 而晉黍9號分別選出M4變異株21、10、21、11和15個, M5穩(wěn)定株37、11、39、19和21個, 綜合M1出苗率、M4突變株及M5保留穩(wěn)定株系, 100 Gy、150 Gy是糜子12C6+離子束輻照誘變適宜劑量。

2.2 12C6+離子束輻照糜子后M5質量性狀變化

隴糜7號褐色誘變后出現(xiàn)黃色突變籽粒, 50、100、150、200和250 Gy劑量(圖3-A、B、C、D、E)下M5黃色突變粒株數(shù)分別占42%、38%、9%、50%和0; 晉黍9號粒色為白紅復色, 50、100、150、200和250 Gy劑量下, M5粒色變異類型分別有7、6、10、7和7種(圖3-a、b、c、d、e)?？梢钥闯鰡紊H本隴糜7號誘變后代粒色變異單一, 而復色親本晉黍9號粒色變異豐富, 說明碳離子束對復色籽粒輻照誘變效果更為顯著。除粒色外, 50、100、250 Gy處理下(表3), 隴糜7號M5成株出現(xiàn)紫色, 50 Gy、250 Gy處理下晉黍9號M5成株也出現(xiàn)紫色, 側穗型的晉黍9號還在100 Gy、150 Gy下出現(xiàn)散穗型變異(表3)。

圖2 不同劑量誘變糜子M1出苗率及M4、M5株數(shù)變化

(圖3)

A(a)、B(b)、C(c)、D(d)、E(e)分別為50、100、150、200和250 Gy下輻照隴糜7號(晉黍9號) M5株系籽粒顏色、份數(shù)及百分比。

A(a), B(b), C(c), D(d), E(e) indicated grain color, number and percentage of mutant from Longmi 7 (Jinshu 9) under 50, 100, 150, 200, and 250 Gy, respectively. WR: white-red; WG: white-gray; WB: white-brown; RG: red-gray; YG: yellow-gray; CC: compound color.

2.3 12C6+離子束輻照糜子M5數(shù)量性狀差異

由表3可以看出, 隴糜7號M5在150 Gy處理下單株穗重、單株粒重與其他4個處理存在極顯著差異, 50 Gy處理下穗長與100 Gy、200 Gy處理穗長存在極顯著差異, 50、150、200和250 Gy處理下的穗下節(jié)間長存在極顯著差異。晉黍9號M5在50 Gy和200 Gy處理下單株穗重、單株粒重間差異極顯著, 100、150和250 Gy處理的株高、單株草重間存在極顯著差異, 200 Gy與50 Gy、250 Gy處理的穗長存在極顯著差異, 穗下節(jié)間長僅在15 Gy與200 Gy間有極顯著差異?？梢姴煌幚硐翸5數(shù)量性狀遺傳差異主要存在于株高、穗長、單株穗重、單株粒重和穗下節(jié)間長少數(shù)幾個性狀, 說明構建的M5屬寡表型突變體譜系。

2.4 12C6+離子束輻照糜子M5聚類分析

聚類分析(圖4-A, B)表明, 在卡方距離3.11、3.67處, 隴糜7號和晉黍9號M5分別分為8類和9類, 對照CKJ0、CKJ1、CKJ2、……、CKJ9集中在第I、II、VII類, 對照CKN0、CKN1、CKN2、……、CKN14主要集中在I、V、VII類, 說明田間試驗地力差異對M5生長發(fā)育影響較小, 可較好反映入選株間相似程度。從圖4-A, B也可以看出, 隴糜7號M5含對照I、II、VII類共42株, 其余5類有39株; 晉黍9號M5含對照I、V、VII類共75株, 其余6類有52株, 說明入選株系多數(shù)與親本表現(xiàn)一致, 無誘變突變效果。兩個系統(tǒng)聚類群中, 不同程度分布著50、100、150、200和250 Gy處理株, 說明5個劑量下均可誘變產生突變體, 亦可產生相似突變體, 據此構建出2個與對照表型性狀差異較大, 分別含39株和52株表型穩(wěn)定的隴糜7號與晉黍9號寡表型M5突變體群體。

2.5 12C6+離子束輻照糜子突變體M6寡表型突變體遺傳差異分析

在系統(tǒng)聚類基礎上從隴糜7號、晉黍9號M5中分別選不含對照的9個和11個株系(圖4-A、B三角箭頭標示)進一步考察其主要農藝性狀(表4), 并設計SSR引物驗證多態(tài)性(表5)?？梢钥闯? 隴糜7號M6除莖粗、單株穗數(shù)、全生育期、穗型4個性狀外, 其余性狀均與對照存在不同程度極顯著差異; 晉黍9號M6除單株穗數(shù)外, 其余性狀與對照也不同程度存在極顯著差異。兩入選株系群性狀存在明顯差異說明入選株系代表性較好, 晉黍9號M6遺傳多樣性更為豐富,12C6+離子束輻照更易產生遺傳類型豐富的誘變突變體。

用6對多態(tài)性SSR引物對M6入選株系進行基因型分析(表5), LMX503、LMX630、LMX632、LMX1380、LMX1760、BM289標記在隴糜7號9個株系位點基因型數(shù)分別為2、3、2、2、2和3, 晉黍9號11個株系位點基因型數(shù)分別為2、5、3、3、5和5。可以看出, 隴糜7號M6SSR相同位點變異較少, 而晉黍9號變異類型較多, 特別是LMX630、LMX1760、BM289標記位點變異基因型達4種, 說明12C6+離子束輻照晉黍9號可產生更多變異類型。

3 討論

基因組測序技術的快速發(fā)展應用和一批植物全基因組測序完成, 給研究者帶來海量生物學信息的同時, 建立相應突變體開展基因功能鑒定成為亟待解決的問題。利用插入/敲出突變技術的生物誘變, 已構建了模式植物擬南芥[20-21]、水稻等作物大規(guī)模突變體庫[22], 為采用反向遺傳學方法分析研究基因組功能提供了重要材料。由自然因素引發(fā)的突變和采用物理、化學等因素誘變突變體, 是正向遺傳學研究的有利基礎材料, Monna等[18]利用水稻自然半矮稈突變體通過定位克隆、構建cDNA進行序列分析及RT-PCR擴增, 發(fā)現(xiàn)矮化突變體基因與正常水稻栽培種相比, 出現(xiàn)序列缺失和堿基替換是其矮化的主要原因; Yi等[23]利用自然突變體衍生而來的S45AB材料精細定位和克隆了甘藍型油菜隱性核不育基因; 朱環(huán)環(huán)等[24]經60Co輻照粳稻嘉花1號得到一個新的致死白化突變體, 利用其構建作圖群體、定位突變基因, 發(fā)現(xiàn)了水稻苗期白化致死新基因; 葉俊等[25]利用60Coγ射線和EMS誘變處理秈稻“9311”種子, 經過M2篩選和M3重復鑒定, 分別獲得465份和210份葉、莖、穗和根等性狀變異的突變體。

物理和化學誘變突變體已在擬南芥[26]、水稻[27-28]等作物廣泛應用于遺傳研究, 而碳離子束作為一種新誘變源, 具有傳統(tǒng)物理誘變和化學誘變技術無可比擬的優(yōu)點, 能夠創(chuàng)造出其他育種方式難以獲得的新基因型。余麗霞等[29]已應用碳離子束輻照誘變大麗花幼枝選育出適合盆栽的矮化品種, 發(fā)現(xiàn)10Gy較6Gy輻照處理大麗花DNA損傷較為嚴重, 突變率高, RAPD分析認為碳離子束輻照更易引起植物分子改變。本研究選用50、100、150、200、250 Gy碳離子束分別輻照隴糜7號、晉黍9號籽粒, 發(fā)現(xiàn)隨劑量增大誘變M1存活率降低, 糯性品種比粳性品種、復色籽粒比單色籽粒更容易產生突變體, 糜子12C6+離子束輻照半致死率100~150 Gy, 150 Gy處理晉黍9號可產生10種不同粒色類型。不同誘變劑量下M5、M6表型穩(wěn)定且株高、產量性狀、成株色及粒色均表現(xiàn)出明顯遺傳差異, 與親本相比, 6對SSR引物在隴糜7號M69個株系中位點變異基因型數(shù)為1~2, 在晉黍9號M6世代11個株系中位點變異基因型數(shù)為1~4, 突變體譜系存在豐富的遺傳多樣性。

A、B分別為隴糜7號、晉黍9號誘變M5株系。

A and B represented mutant from Longmi 7 and Jinshu 9, respectively.

表5 糜子誘變M6世代SSR分析

A, B, C, D, and E indicsate different genotypes.

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Pedigree Construction and SSR Analysis of Broomcorn Millet Mutant by12C6+Ion Beam Irradiation

LIU Tian-Peng1, DONG Kong-Jun1, DONG Xi-Cun2, HE Ji-Hong1, LIU Min-Xuan3, REN Rui-Yu1, ZHANG Lei1, and YANG Tian-Yu1,4,*

1Crop Research Institute, Gansu Academy of Agricultural Sciences, Lanzhou 730070, Gansu, China;2Institute of Modern Physics, Chinese Academy of Sciences, Lanzhou 730000, Guansu, China;3Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China;4Life Sciences and Technology College, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, Guansu, China

To construct mutant library of physical mutation in broomcorn millet, applied five doses of12C6+ion beam at 50, 100, 150, 200, and 250 Gy to irradiate seed of Longmi 7 and Jinshu 9, and constructed two populations (M5) consisting of 52 and 79 lines respectively with mixed pedigree method and system cluster. The field text showed that the emergence rate of M1decreased significantly with increasing12C6+dose, half lethal dose for M1from Longmi 7 and Jinshu 9 were 150 Gy and 100 Gy. M4at 100, 150 Gy produce a most abundant mutants. M5and M6Phenotypes were more stable than M4, and plant height, yield traits, plant color and seed color showed significant difference. Nine M6linesfrom Longmi 7 and 11 M6lines from Jinshu 9 were detected with six pairs of SSR primer, compared with the parents, loci variant genotype number were 1–2 and 1–4, respectively, showing abundant genetic diversity in mutant populations.

12C6+ion; physical irradiation; mutant populations; molecular marker

2017-03-24;

2017-09-10;

2017-09-28.

10.3724/SP.J.1006.2018.00144

通信作者(Corresponding author):楊天育, E-mail:13519638111@163.com

E-mail: 139931840518@163.com

本研究由甘肅省農業(yè)科學院中青年基金項目(2016GAAS36)和國家現(xiàn)代農業(yè)產業(yè)技術體系建設專項(CARS-06-13.5-A9)資助。

The study was supported by the Gansu Academy of Agricultural Sciences Funds for Youth (2016GAAS36) and the China Agriculture Research System (CARS-06-13.5-A9).

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20170928.1842.020.html