鄭 宇,姚鳳鑾,丁雪玲,趙建偉,何玉仙

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護研究所/福建省作物有害生物監(jiān)測與治理重點實驗室,福建 福州 350013)

煙粉虱Bemisiatabaci(Gennadius)是一種世界性害蟲,給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了極大的損失[1]。煙粉虱的防治一直以化學(xué)防治為主,由此也引發(fā)了包括抗藥性在內(nèi)的一系列問題。近年來,煙粉虱對新煙堿類殺蟲劑的抗藥性也十分普遍[2-4]。我們通過抗性監(jiān)測證實福建田間煙粉虱群體對新煙堿類殺蟲劑的敏感性普遍下降,部分地區(qū)達到了中高抗水平[5]。因此煙粉虱的抗藥性成為治理的重點和難點[6]。本研究通過在室內(nèi)對煙粉虱相對敏感品系進行吡蟲啉藥劑抗性的連續(xù)汰選,每隔一代進行煙粉虱對吡蟲啉的敏感性測定,以了解其抗性發(fā)展動態(tài);同時測定了煙粉虱相對敏感和抗性種群中羧酸酯酶CarE、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶GSTs、多功能氧化酶MFO活性的變化差異,以探討其抗性形成的生化機理,為煙粉虱的抗藥性治理提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源及飼養(yǎng)

供試煙粉虱相對敏感品系(SS)于2011年采集于福州市郊,經(jīng)mtCOI標(biāo)記鑒定為B型煙粉虱。在福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植保所昆蟲飼養(yǎng)室,以棉花為寄主繼代飼養(yǎng)煙粉虱相對敏感品系,期間未接觸任何殺蟲劑,測定其LC50,為270 mg/L。

1.2 供試藥劑

供試藥劑:吡蟲啉(10%可濕性粉劑,由沈陽化工研究院試驗廠生產(chǎn))、α-乙酸萘酯(α-NA,由中國上海青浦合成試劑廠提供)、固藍RR鹽(Fast Blue RRsalt,由廈門泰京生物技術(shù)有限公司提供)、碘化硫代乙酞膽堿(ATChI,由Fluka公司提供)、二硫代雙對硝基苯甲酸(DTNB,由上?；瘜W(xué)試劑廠提供)、還原型谷朧甘膚(GSH,由上海生工生物工程有限公司提供)、考馬斯亮藍(G-250,由中國醫(yī)藥集團上海化學(xué)試劑分公司提供);其他試劑均為分析純。

1.3 生物測定方法

參照何玉仙等[4]的方法,采用棉葉浸葉法對煙粉虱進行毒力測定。

1.4 抗性種群汰選方法

采用灌根法對同源對照的煙粉虱相對敏感種群SS進行吡蟲啉抗性選育。以每代煙粉虱的毒力測定結(jié)果(LC20)作為吡蟲啉灌根濃度的參考,每盆棉花苗灌根50 mL吡蟲啉溶液后,持續(xù)喂養(yǎng),待每代種群個體被殺死40%～60%后,換入未灌根的棉花苗進行正常飼養(yǎng)，直至下一代。

1.5 酶液制備

挑取100頭煙粉虱雌成蟲放入1.5 mL的離心管中,加入1 mL磷酸鈉緩沖液(0.02 mol/L、pH 7.0，含0.1% TritonX-100)進行勻漿,置于4 ℃靜置30 min,在4 ℃下以10000 r/min離心10 min,吸取上清液作酶源。

1.6 蛋白質(zhì)含量的測定

參照Braford[8]的方法,采用美國 Max190型酶標(biāo)儀,在595 nm波長處測定酶源的OD值,重復(fù)5次,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出酶源的蛋白質(zhì)含量。

1.7 羧酸酯酶CarE活性的測定

參照Graham[9]的方法,在96孔酶標(biāo)板加入1×10-4mol/L毒扁豆堿溶液25 μL、酶粗提液25 μL,再加入200 μL 1 mmol/L α-NA和1.5 mmol/L固藍RR鹽混合液;在美國分子儀器公司生產(chǎn)的Max190型酶標(biāo)儀上測定595 nm處的OD值,反應(yīng)溫度27 ℃,重復(fù)3次?？瞻讓φ找粤姿峋彌_液代替。

1.8 谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶GSTs活性的測定

參照Graham[9]的方法,在96孔酶標(biāo)板加入30 μL 50 mmol/L GSH、230 μL 0.02 mol/L磷酸緩沖液(pH 7.0)、10 μL 30 mmol/L CDNB、25 μL酶粗提液(空白對照以磷酸緩沖液代替),輕微振蕩混勻;在Max190酶標(biāo)儀上,在340 nm處測定OD值,重復(fù)3次。

1.9 多功能氧化酶(MFO)活力的測定

采用Li[10]的方法，在96孔酶標(biāo)板中加入樣品,反應(yīng)溫度為30 ℃,在Max190型酶標(biāo)儀405 nm波長下測定OD值,每隔25 s記錄1次,共25次,重復(fù)3次。

1.10 數(shù)據(jù)處理

用DPS 7.0統(tǒng)計軟件求出毒力回歸方程的斜率、LC50及其95%置信限?？剐员稊?shù)=汰選煙粉虱種群的LC50值/相對敏感種群的LC50值。方差分析采用DPS軟件中的鄧肯氏新復(fù)極差檢驗法。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙粉虱室內(nèi)抗性發(fā)展動態(tài)

在室內(nèi)吡蟲啉藥劑抗性汰選過程中,用浸葉法進行煙粉虱對吡蟲啉敏感性的毒力測定。結(jié)果顯示:相對敏感品系SS(LC50=270 mg/L)進行吡蟲啉藥劑連續(xù)篩選14代后,汰選所用吡蟲啉亞致死劑量LC20從100 mg/L上升到1000 mg/L(表1);在抗性汰選的初期(初始6代),煙粉虱種群抗性增長較為緩慢,增長約1.64倍,與SS群體無顯著差異。在第6代后抗性水平增長加快,到第8代抗性倍數(shù)達到3.16倍；隨后抗性增長有所平緩,但到10代后抗性水平又迅速上升,到14代時LC50為2414 mg/L,抗性倍數(shù)為相對敏感種群的8.64倍,差異顯著。從各代毒力回歸線的斜率b值(表1)來看,b值由1.772逐漸降低為0.838,表明在吡蟲啉亞致死劑量的選擇壓力下,煙粉虱相對敏感品系中抗性雜合子逐漸出現(xiàn),群體異質(zhì)性開始變大,抗性個體增多,導(dǎo)致抗性水平提高。

表1 吡蟲啉汰選下室內(nèi)煙粉虱不同代數(shù)的毒力測定結(jié)果

2.2 煙粉虱兩種群3種解毒酶活性差異

2.2.1 羧酸酯酶CarE活性 由表2可見:煙粉虱兩個種群(SS、RR)羧酸酯酶的活性差異顯著,RR種群的CarE活性是SS種群的2.35倍。由此可見,羧酸酯酶活性的升高加強了對吡蟲啉的代謝解毒作用,使煙粉虱對吡蟲啉的抗性提高。

表2 羧酸酯酶CarE活性測定結(jié)果

2.2.2 谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶GSTs活性 由表3可知:煙粉虱兩個種群間谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶GSTs的活性沒有顯著性差異?？梢酝茰yGSTs并未參與吡蟲啉的代謝作用,所以GSTs對煙粉虱的吡蟲啉抗性提高作用不明顯。

表3 谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的活性測定結(jié)果

2.2.3 多功能氧化酶MFO活性 從表4可以看出，煙粉虱RR種群的MFO活性是SS種群的1.20倍。因此,可推斷MFO活性的提高加快了煙粉虱機體對吡蟲啉及其衍生產(chǎn)物的降解,這也是煙粉虱抗性水平上升的一個重要因素。

表4 多功能氧化酶MFO活性測定結(jié)果

3 討論

害蟲抗藥性發(fā)展的速度除與自身的生物學(xué)特性有關(guān)外,還與藥劑的特性、選擇壓力,以及害蟲初始抗性頻率有關(guān)。本研究利用浸葉法測得的吡蟲啉亞致死劑量LC20進行灌根處理,對B型煙粉虱進行了連續(xù)14代抗性品系汰選，發(fā)現(xiàn)煙粉虱群體室內(nèi)抗性動態(tài)變化表現(xiàn)出初期(1～6代)上升緩慢,中期(8～10代)增長加快,到后期(12～14代)增長更為迅速的特點。分析表明煙粉虱抗性發(fā)展初期比較緩慢,可能與其群體初始抗性頻率比較低有關(guān);而后期抗性增長較快與吡蟲啉內(nèi)吸性強,藥劑殘留期長,可對煙粉虱形成持續(xù)性壓力,藥劑的亞致死效應(yīng)比較明顯[10]相關(guān)。另外,與其他昆蟲相比,煙粉虱群體繁殖力強,世代歷期短,因而可以在更短的時間內(nèi)使其群體的抗性頻率得到提高,使種群表現(xiàn)出抗藥性特征。以上因素很可能是煙粉虱對吡蟲啉的抗性增加較為迅速的主要原因。因此,今后在對煙粉虱的防治中,應(yīng)特別注意藥劑的選擇、藥劑的輪換以及科學(xué)用藥等,盡量減緩其抗藥性水平的增加。

近年來研究表明昆蟲的抗藥性形成與代謝抗性的提高密切相關(guān)[10]。吡蟲啉是新煙堿類殺蟲劑的典型代表,由硝基亞甲基雜環(huán)結(jié)構(gòu)和煙堿組合,其藥效基團為硝基亞胺(N-NO2)。吡蟲啉代謝研究在多種哺乳動物和植物中都有報道[10-11],在昆蟲方面主要集中在家蠅(Muscadomestica)、蜜蜂(Apismellifera)、果蠅(Drosophilamelanogaster)、煙粉虱(Bemisiatabaci)等上[12-13]。研究發(fā)現(xiàn)吡蟲啉在昆蟲中主要發(fā)生羥基化、去飽和化、去烷基及硝基還原等代謝反應(yīng),通常這些代謝產(chǎn)物的生物活性有所降低,比本體毒性更低。因而推論昆蟲體內(nèi)相關(guān)代謝解毒酶的代謝作用減低了吡蟲啉對昆蟲自身的毒害。前人研究顯示涉及介導(dǎo)昆蟲代謝抗性的代謝酶有三大酶系:非專一性酯酶(ESTs)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶系(GSTs)和多功能氧化酶系。為了加強煙粉虱對新煙堿類殺蟲劑的抗性及機理研究,本研究還進行了3種代謝解毒酶CarE、GSTs和MFO活性的對比測定,發(fā)現(xiàn)抗性RR種群的CarE和MFO活性提高明顯,而GSTs活性提高不顯著。這說明CarE和MFO活性的提高極有可能加快了煙粉虱對吡蟲啉的代謝降解作用,從而使煙粉虱對吡蟲啉的敏感性下降,使其抗性水平大大提高；而GSTs與吡蟲啉抗性形成關(guān)系不大。本試驗結(jié)果為煙粉虱對吡蟲啉的代謝抗性機理研究提供了一定的生化證據(jù),但對代謝酶類、相關(guān)功能以及相關(guān)基因表達、調(diào)控研究還未進行。在本試驗研究的基礎(chǔ)上，今后有必要進一步研究煙粉虱抗性、敏感種群之間相關(guān)基因表達的差異,進行相關(guān)基因的克隆、生物信息學(xué)分析,以了解不同解毒酶的生理特性,揭示其代謝作用增強(涉及酶數(shù)量或質(zhì)量上的改變)的分子機理。未來我們還可以借助基因沉默、敲除等分子生物學(xué)手段來研究代謝酶在昆蟲體內(nèi)的生理作用。同時,利用蛋白表達與純化技術(shù)獲得有活性的代謝酶,進而分析其酶學(xué)及生物學(xué)特性,為解毒酶介導(dǎo)的昆蟲代謝抗性機理研究奠定基礎(chǔ)。

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