馬若克，陳 霞，李長(zhǎng)鴻，符韻林

(廣西大學(xué) 林學(xué)院，廣西 南寧 530000)

多酚，又稱(chēng)單寧，是一類(lèi)廣泛分布在自然界的植物次生代謝物質(zhì)，具有抗癌、抗氧化、抗動(dòng)脈硬化和防治冠心病、腦血管疾病等多種醫(yī)藥價(jià)值[1]。據(jù)研究，多酚在植物的抗蟲(chóng)機(jī)理上有非常顯著的作用[2]，有報(bào)道多酚與木材心材形成機(jī)理可能相關(guān)[3]。建立多酚含量的測(cè)定方法是研究和利用多酚的基礎(chǔ)。

降香黃檀(Dalbergiaodorifera)，俗稱(chēng)海南黃花梨，為蝶形花科(Papilionaceae)黃檀屬(Dalbergia)常綠半落葉喬木[4]，其主要分布在我國(guó)海南西部、西南部，目前降香黃檀在廣東、廣西、福建等地區(qū)有較大面積的種植，特別在廣西，受當(dāng)?shù)貎?yōu)化樹(shù)種結(jié)構(gòu)、大力發(fā)展降香黃檀等珍貴樹(shù)種政策的影響，發(fā)展迅速，但大部分尚未形成心材。降香黃檀自古就是一味名貴中藥，具有行氣止痛、活血止血的功效而廣泛應(yīng)用于心胸悶痛、脘脅刺痛、外治跌打出血[5],許多藥理學(xué)的研究也集中在根部心材的化學(xué)成分及生理活性方面。翁新楚等[6]篩選了700余種中藥和香辛料的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)包括降香黃檀在內(nèi)的24種植物的抗氧化活性很強(qiáng)。Wang等[7]從降香黃檀中分離得到的8種酚類(lèi)物質(zhì)中6種具有抗氧化性。Goda等[8]從降香黃檀分離得到15種化合物，其中肉桂基苯酚、異黃酮、異黃酮和苯甲酸衍生物能顯著抑制前列腺素生物合成以及由花生四烯酸誘導(dǎo)的血小板聚集。An等[9]在降香黃檀中發(fā)現(xiàn)8種酚類(lèi)化合物對(duì)HT22細(xì)胞中谷氨酸鹽誘導(dǎo)的氧化損傷提供有效的保護(hù)作用。鑒于降香黃檀極高的應(yīng)用價(jià)值，本試驗(yàn)采用Folin-Ciocaileu比色法研究了降香黃檀葉、根、樹(shù)皮、側(cè)枝4種不同部位多酚的含量，并對(duì)顯色反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，以期為研究降香黃檀心材形成機(jī)理，充分挖掘降香黃檀產(chǎn)業(yè)價(jià)值提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品與儀器

根、葉、樹(shù)皮、側(cè)枝均采自廣西大學(xué)實(shí)驗(yàn)種植基地8年生降香黃檀；沒(méi)食子酸標(biāo)品、Folin-Ciocalteu試劑(上海金穗生物科技有限公司)；乙醇、甲醇、丙酮、石油醚、無(wú)水碳酸鈉(分析純)(天津市豪宇精細(xì)化工有限公司)；CP214型精密分析天平(奧豪斯儀器有限公司)；DFT-200粉碎機(jī)(溫嶺市林大機(jī)械有限公司)；SP-754紫外分光光度計(jì)(上海光譜有限公司)；KQ2200超聲波清洗器(昆山市超聲儀器公司)。

1.2 方法

1.2.1 樣品多酚提取液制備與優(yōu)化選擇 選取一定量降香黃檀樣品，洗凈晾干后于50 ℃烘箱平衡4 h干燥，粉碎過(guò)40目篩，用石油醚(沸點(diǎn)60～90 ℃)作為溶劑，于索氏提取器中回流3次進(jìn)行脫脂。精確稱(chēng)取各降香黃檀樣品粉末12份，按照1∶20(樣品∶溶劑)的比例分別加入70%乙醇、甲醇、丙酮溶液，然后分別進(jìn)行超聲波(脈沖頻率40 kHz)提取30 min、60 min、1.5 h、2.0 h，減壓抽濾，編號(hào)。

1.2.2 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精確稱(chēng)取10.0 mg沒(méi)食子酸標(biāo)品于容量瓶中，用去離子水定容至100 mL，配成0.1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.3 最大吸收波長(zhǎng)的選擇 選擇4種不同部位樣品的乙醇提取液和沒(méi)食子酸標(biāo)液各0.5 mL，于25 mL容量瓶中，各加入1 mL顯色試劑、1 mL 15%碳酸鈉溶液，振蕩混合均勻，避光放置1 h。在700～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描確定最大吸收波長(zhǎng)。

1.2.4 提取溶劑以及超聲提取時(shí)間的確定 分別移取0.5 mL上述1.2.1所配12份樣品提取液，各加入1 mL顯色試劑、1 mL 5%碳酸鈉溶液放入25 mL容量瓶中，混合均勻后用去離子水定容, 避光放置1 h，測(cè)吸光度。比較出每種樣品的最佳提取溶劑及顯色時(shí)間，下述實(shí)驗(yàn)均以最優(yōu)溶劑和時(shí)間進(jìn)行條件優(yōu)化。

1.2.5 FoLin-CiocaLteu試劑用量的確定 取0.5 mL樣品提取液6份，分別加入0.5、0.8、1.0、1.5、2.0、2.5 mL Folin-Ciocalteu試劑、1 mL 15%碳酸鈉溶液于25 mL容量瓶中，混合均勻后用去離子水定容。避光放置1 h，測(cè)吸光度。

1.2.6 15% Na2CO3溶液用量的確定 取0.5 mL樣品提取液6份，各加入上述最佳Folin-Ciocalteu試劑用量后，分別加入0.5、1.0、2.0、2.5、3.0、3.5 mL的15%碳酸鈉溶液于25 mL容量瓶中，混合均勻后定容。比較不同Na2CO3溶液用量對(duì)顯色效果的影響。

1.2.7 反應(yīng)溫度的確定 取0.5 mL樣品提取液6份，各加入上述最佳Folin-Ciocalteu試劑及碳酸鈉用量，放入25 mL容量瓶中，混合均勻后定容。分別置于25、30、35、40、45、50 ℃水浴，比較不同溫度對(duì)顯色效果的影響。

1.2.8 顯色時(shí)間的確定 取0.5 mL樣品提取液6份，各加入上述最佳Folin-Ciocalteu試劑及碳酸鈉用量，混合均勻定容后置于25 mL容量瓶，置于最優(yōu)反應(yīng)溫度下。顯色時(shí)間分別為90、110、130、140、150、180 min，對(duì)比分析不同顯色時(shí)間與顯色效果的關(guān)系。

1.2.9 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制 準(zhǔn)確移取沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL于10 mL容量瓶中，再加入上述根、葉、側(cè)枝、樹(shù)皮4種樣品所優(yōu)化的最佳溶劑用量，混合均勻后定容，沒(méi)食子酸的濃度分別為0、1、2、3、4、5、6 μg/mL，在最佳反應(yīng)溫度與時(shí)間條件下進(jìn)行反應(yīng)。繪制每種樣品的標(biāo)準(zhǔn)吸光度曲線。

1.2.10 評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn) 穩(wěn)定性試驗(yàn)：將所測(cè)降香黃檀不同部位的樣品提取液按照最佳條件處理后，分別避光放置1.5、2.0、4.0、6.0 h，在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

重復(fù)性試驗(yàn)：取6份樣品制得的提取液，按照上述最佳條件，在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

精密度試驗(yàn)：取同一提取液6份，按照上述最佳條件，在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

加標(biāo)回收率試驗(yàn)：向樣品提取液中分別加入不同量的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)液，在最佳條件下測(cè)定吸光度，計(jì)算回收率。

1.2.11 降香黃檀不同部位多酚含量的測(cè)定 取樣品提取液0.5 mL于100 mL容量瓶中，按照上述最佳實(shí)驗(yàn)條件處理后測(cè)吸光度。根據(jù)所建立的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)工作曲線計(jì)算多酚含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 最大吸收波長(zhǎng)的確定

選用降香黃檀葉、根、側(cè)枝、樹(shù)皮的70%乙醇提取液與Folin-Ciocalteu試劑及碳酸鈉避光反應(yīng)1 h后，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[10-14]的多酚的最大吸收波長(zhǎng)，選擇測(cè)定在700～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的吸光度。從圖1可以看出，吸光度在這一范圍內(nèi)總體變化幅度不大，但4個(gè)部位樣品的最大吸收波長(zhǎng)都出現(xiàn)在750～760 nm波長(zhǎng)范圍之間，因此我們選擇755 nm波長(zhǎng)作為比色測(cè)定的波長(zhǎng)。

2.2 不同溶劑及超聲時(shí)間對(duì)吸光度的影響

表1是用70%乙醇、甲醇、丙酮3種溶劑分別處理降香黃檀葉、側(cè)枝、樹(shù)皮、根0.5、1.0、1.5、2.0 h后，在最大吸收波長(zhǎng)處所測(cè)吸光度。由于溶劑極性不同等原因，超聲提取效果也不同。對(duì)比3種溶劑的提取效果，差別不大?？紤]到甲醇、丙酮具有毒性，因此選擇乙醇作為提取溶劑。對(duì)于提取時(shí)間，葉和樹(shù)皮樣品的最佳提取時(shí)間為1.5 h，側(cè)枝為2.0 h，根部為3.0 h。不同的樣品最佳提取時(shí)間不同主要是多酚含量不同，多酚含量較多的葉和樹(shù)皮樣品的吸光度最高點(diǎn)出現(xiàn)較早，而側(cè)枝、根樣品的最高點(diǎn)出現(xiàn)較晚。

圖1 降香黃檀不同部位樣品的吸收光譜

處理時(shí)間/h吸光值(葉)乙醇甲醇丙酮吸光值(側(cè)枝)乙醇甲醇丙酮吸光值(樹(shù)皮)乙醇甲醇丙酮吸光值(根)乙醇甲醇丙酮0.51.2841.2441.4200.3750.5440.6221.2011.1491.4090.3290.4120.41211.4321.4321.3870.6090.6040.6331.2011.1551.4690.2660.3780.3781.51.7211.3471.4090.6620.6070.6231.3011.1021.1370.3160.3090.30921.3201.3981.6590.7010.6680.6801.1941.1431.2080.4910.3120.312

注：乙醇、甲醇、丙酮濃度均為70%。

2.3 FoLin-CiocaLteu試劑用量對(duì)顯色效果的影響

由圖2可知，隨著Folin-Ciocalteu試劑用量的增加，吸光度表現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì)，但是4種材料的最佳試劑用量不同，降香黃檀的葉和樹(shù)皮的提取液樣品在顯色劑用量為1.5 mL時(shí)，吸光度達(dá)到最大，而側(cè)枝和根的提取液樣品在1.0 mL時(shí)吸光度達(dá)到最大值。這可能是葉和樹(shù)皮的多酚相對(duì)含量高，所需顯色劑量相對(duì)較多的原因，因此我們將4種材料的顯色劑用量分別對(duì)待。

圖2 Folin-Ciocalteu試劑用量對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響

2.4 15%碳酸鈉用量對(duì)顯色效果的影響

Na2CO3溶液為酚類(lèi)物質(zhì)與Folin-Ciocalteu試劑顯色提供一個(gè)堿性環(huán)境，使溶液呈現(xiàn)藍(lán)色。由圖3可以看出，隨著15%的Na2CO3溶液用量的增加，所測(cè)吸光度表現(xiàn)為先增加，而后在用量1～3 mL時(shí)變化幅度變小，最后開(kāi)始降低。4種材料的最佳Na2CO3溶液的用量有一定的差別，為了盡可能地提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性，選擇不同的Na2CO3溶液用量。降香黃檀葉提取液樣品的Na2CO3溶液的最佳用量為2.5 mL，樹(shù)皮提取液樣品的最佳用量為2.5 mL，根和側(cè)枝提取液樣品的最佳用量為2.0 mL。

圖3 15%碳酸鈉用量對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響

2.5 反應(yīng)溫度對(duì)比色效果的影響

顯色溫度對(duì)吸光度有一定的影響?？傮w來(lái)看，溫度在45 ℃時(shí)，降香黃檀葉、側(cè)枝、根的吸光度均有最大值，樹(shù)皮提取液的吸光度略有下降，但幅度較低(圖4)，這可能是因?yàn)轱@色反應(yīng)之后生成的物質(zhì)在溫度增高后性質(zhì)不穩(wěn)定。為方便集中處理，將反應(yīng)溫度設(shè)定為45 ℃。

2.6 反應(yīng)時(shí)間對(duì)比色效果的影響

多酚化合物的顯色過(guò)程需要一定的時(shí)間。反應(yīng)時(shí)間對(duì)降香黃檀多酚的吸光度的影響在反應(yīng)前期比較明顯。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為45 min時(shí)，吸光度增加緩慢，體系反應(yīng)較為完全。為使測(cè)試更加準(zhǔn)確，選擇反應(yīng)時(shí)間1 h。

2.7 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制

因?yàn)槊糠N樣品的最佳處理?xiàng)l件不同，圖6是根據(jù)沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品在每個(gè)樣品的最佳條件下所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線，在4個(gè)樣品中，側(cè)枝和根的提取液的反應(yīng)條件一致，得3條工作曲線。葉提取液樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=0.125x+0.016，相關(guān)系數(shù)R2為0.994；側(cè)枝和根提取液樣品的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線為y=0.123x+0.041，R2為0.995；樹(shù)皮提取液樣品的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線為y=0.129x+0.021，R2為0.998。沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度在0～6 μg/mL范圍內(nèi)符合朗伯比爾定律，均與其吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，可用于降香黃檀多酚含量的測(cè)定。

圖4 反應(yīng)溫度對(duì)多酚測(cè)定結(jié)果的影響

圖5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)多酚測(cè)定結(jié)果的影響

圖6 不同條件對(duì)應(yīng)的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

用Folin-Ciocalteu法測(cè)定降香黃檀4種不同部位的多酚含量，水浴1 h后，避光處理，分別放置0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、6.0 h后測(cè)定吸光度。測(cè)得葉片、側(cè)枝、樹(shù)皮和根部樣品提取液的吸光度的RSD分別為0.50%、0.24%、1.14%和0.19%，表明該方法體系測(cè)試后放置6 h后仍比較穩(wěn)定。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn)

用Folin-Ciocalteu法測(cè)定降香黃檀4種不同部位的多酚含量，在所測(cè)每個(gè)部位的6份樣品中，測(cè)得葉片、側(cè)枝、樹(shù)皮和根部提取液的多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD分別為3.87%、5.75%、3.07%和4.46%，結(jié)果表明該方法重復(fù)性較好。

2.10 精密度試驗(yàn)

用Folin-Ciocalteu法測(cè)定降香黃檀4個(gè)不同部位的多酚含量，對(duì)降香黃檀每個(gè)部位的同一樣品提取液分別測(cè)定6次，計(jì)算多酚值(以100 g樣品計(jì))。測(cè)得葉片、側(cè)枝、樹(shù)皮和根部的多酚值的RSD分別為1.28%、2.98%、1.47%和2.50%。結(jié)果顯示，該方法精密度較高。

2.11 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

對(duì)每個(gè)部位的樣品按照上述所確定的最佳試驗(yàn)條件，進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)。從表2中所列結(jié)果得出該方法準(zhǔn)確可靠。

2.12 降香黃檀不同部位多酚含量的測(cè)定

按照上述方法測(cè)定了不同部位降香黃檀的多酚含量，發(fā)現(xiàn)降香黃檀不同部位的多酚含量差異較大，多酚含量從高到低分別為葉15.3 mg/g、樹(shù)皮10.3 mg/g、側(cè)枝4.9 mg/g和根部4.2 mg/g。

3 結(jié)論

研究了用Folin-Ciocalteu法測(cè)定降香黃檀不同部位多酚含量的適宜條件。經(jīng)脫脂后樣品與70%乙醇提取液按照1∶20的比例超聲提取，均移取0.5 mL樣品提取液進(jìn)行測(cè)定。其中測(cè)定葉中多酚含量的最佳條件是：1.0 mL Folin-Ciocalteu顯色劑、2.0 mL Na2CO3，用去離子水定容至100 mL。測(cè)定樹(shù)皮多酚的最佳條件1.5 mL Folin-Ciocalteu顯色劑、2.5 mL Na2CO3，用去離子水定容至100 mL。根和側(cè)枝樣品的測(cè)定條件相同：1.0 mL Folin-Ciocalteu顯色劑、2.0 mL Na2CO3，用去離子水定容至25 mL。4種樣品比色波長(zhǎng)755 nm，反應(yīng)溫度45 ℃，避光反應(yīng)1 h。多酚含量在1～6 μg/mL工作范圍內(nèi)有效。通過(guò)測(cè)定4種部位的多酚含量，葉片多酚含量最高，可達(dá)15.3 mg/g，對(duì)進(jìn)一步開(kāi)發(fā)降香黃檀產(chǎn)業(yè)價(jià)值具有十分重要的作用。

表2 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

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