李文，傅超美，傅舒

附子為毛茛科植物烏頭 （Aconitum carmichaeliDebx.）子根的加工品，具有回陽救逆，補(bǔ)火助陽，散寒止痛之功效，主治亡陽虛脫、心陽不足、寒凝疼痛等證，為“回陽救逆第一品藥”?，F(xiàn)代研究表明附子中含有多種強(qiáng)心的化學(xué)成分，如烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿等，此類雙酯型生物堿有具有強(qiáng)心、抗心律失常、鎮(zhèn)痛抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等藥理作用，但心臟也是附子毒性的靶器官，烏頭堿是附子引起心律失常的重要毒性物質(zhì)基礎(chǔ)，表現(xiàn)出對(duì)心肌細(xì)胞、中樞神經(jīng)和肌肉組織的毒性反應(yīng)[1-4]。甘草為豆科植物甘草（GlycyrrhiauralensisFisch.）、脹果甘草（G.inflataBat.）或光果甘草（G.glabraL.）的根及根莖。具有補(bǔ)脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳、緩急止痛、調(diào)和諸藥的功效。

在《景岳全書?本草正?毒草部》中曰：“附子之性急，得甘草而后緩；附子之性毒，得甘草而后解；附子之性走，得甘草而后宜心脾；附子之性散，得甘草而后調(diào)營衛(wèi)”。甘草能解附子之毒早已被多數(shù)人認(rèn)識(shí)，但附子-甘草配伍減毒的作用機(jī)制眾說紛紜，包括化學(xué)成分、藥效毒性、分子機(jī)制、組分配伍胃腸吸收動(dòng)力學(xué)等諸多方面。

組分配伍是中藥傳統(tǒng)“配伍和合”的繼承和發(fā)展。傳統(tǒng)中藥配伍多為飲片配伍，常具有成分繁雜、作用機(jī)制不明等不足。張伯禮、王永炎院士提出“組分中藥”理論，基于中藥配伍理論，通過組分間相互作用研究，理清藥味間相互作用關(guān)系，并通過多因素、動(dòng)態(tài)藥理模型指導(dǎo)辨證施治。組分配伍是遵循“復(fù)雜-簡單-復(fù)雜”研究原則，闡明中藥配伍關(guān)系的新模式。

《素問》云：“主病之謂君，佐君之謂臣，應(yīng)臣之謂使”。組分配伍在明確有效成分、作用機(jī)制和靶點(diǎn)的基礎(chǔ)上，按照中醫(yī)“君臣佐使”理論進(jìn)行辯證選藥組方入藥，既堅(jiān)持中醫(yī)藥整體觀，又充分發(fā)揮中藥多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)、多渠道的綜合療效優(yōu)勢(shì)，是系統(tǒng)思維與分析還原法的有機(jī)結(jié)合。陳竺科研組基于中藥復(fù)方（雄黃、青黛、丹參）的有效組成，將其主要成分四硫化四砷、靛玉紅、丹參酮IIA，按照分子配伍理論組方，有效緩解急性早幼粒細(xì)胞性白血病，成為現(xiàn)代中藥治療重大疾病的標(biāo)桿。其中四硫化四砷作“君藥”，它直接作用于癌蛋白，通過誘導(dǎo)其降解，從根本上逆轉(zhuǎn)癌細(xì)胞的瘋長，使其分化成熟；丹參酮和靛玉紅作為“臣藥”，促進(jìn)白血病細(xì)胞的分化成熟，抑制癌細(xì)胞的細(xì)胞周期及分裂增殖；并且丹參酮和靛玉紅通過增加負(fù)責(zé)運(yùn)輸硫化砷的蛋白的基因表達(dá)，促使硫化砷更多進(jìn)入細(xì)胞，起到了“佐使藥”的作用。國際主流科學(xué)界對(duì)這一研究成果給予積極評(píng)價(jià)，《Nature》雜志發(fā)表了題為“中醫(yī)藥：古老復(fù)方的現(xiàn)代新解”的述評(píng)。此外，謝恬科研組基于欖香烯三種構(gòu)型（β-，γ-，δ-欖香烯）的藥效機(jī)制，結(jié)合組分配伍理論，以具有顯著殺腫瘤細(xì)胞作用的β-欖香烯作為“君藥”，γ-，δ-欖香烯可顯著增強(qiáng)β-欖香烯抗腫瘤作用，為“臣藥”，輔以適宜輔料將其組方研發(fā)成為欖香烯抗癌新藥，具有減毒增效的制劑優(yōu)勢(shì)。

本文將對(duì)近年來附子配伍甘草對(duì)大鼠心肌細(xì)胞減毒作用機(jī)制進(jìn)行綜述，以期為中藥復(fù)方配伍減毒研究提供參考，為中藥臨床合理應(yīng)用提供指導(dǎo)。

1 附子對(duì)心肌細(xì)胞的毒性

1.1 烏頭堿對(duì)心肌細(xì)胞內(nèi)電生理的影響

中藥有多成分、多靶點(diǎn)、弱效應(yīng)的特點(diǎn)，學(xué)者們常常選擇其主要有效成分作為研究對(duì)象來闡釋藥物作用機(jī)理。附子中主要成分烏頭堿是引起心律失常的重要毒性物質(zhì)基礎(chǔ)，所以研究中常常采用烏頭堿作為代表研究附子的心肌細(xì)胞毒性。心肌細(xì)胞膜上有多種離子通道，離子通道是一類跨膜糖蛋白，如Na+、K+、Ca2+、Cl-通道等, 這些離子通道節(jié)律性的開放和關(guān)閉，通過正常表達(dá)與功能的彼此平衡來維持心臟的正常功能。Na+、K+、Ca2+、Cl-等離子流參與了心肌動(dòng)作電位的形成，任何離子通道電流發(fā)生異常，均可導(dǎo)致心肌細(xì)胞電生理功能的改變，嚴(yán)重的可致心律失常。

附子中的主要有效成分烏頭堿的心臟毒性與心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+和Na+濃度及相關(guān)離子泵、ATP酶相關(guān)。王茁伉等[6]給予SD乳鼠心肌細(xì)胞烏頭堿，應(yīng)用試劑盒檢測(cè)心肌細(xì)胞內(nèi)Na+、K+、Ca2+的離子含量，以及Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活力，結(jié)果15min后細(xì)胞內(nèi)Na+和Ca2+含量增加，而K+含量減少，具有劑量依賴性，同時(shí)抑制細(xì)胞Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶的活性。通過測(cè)四噻唑蘭MTT（OD570-655）的值判斷心肌細(xì)胞的活力，結(jié)果顯示，烏頭堿可以導(dǎo)致心肌細(xì)胞活力的降低，呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。

Fu等[7]研究發(fā)現(xiàn)烏頭堿能引起大鼠心肌細(xì)胞毒性，表現(xiàn)在心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+的濃度有顯著性異常，能被Ca2+抑制劑拮抗，故認(rèn)為附子心臟毒性的主要機(jī)制是Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)失調(diào)和細(xì)胞內(nèi)的電耦聯(lián)障礙導(dǎo)致了心律失常。進(jìn)一步研究表明，烏頭堿可破壞心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)和細(xì)胞膜穩(wěn)定性，使能量代謝紊亂，影響到細(xì)胞膜的Ca2+-ATP酶活性，細(xì)胞外的鈣離子可經(jīng)電壓門控式L型Ca2+通道（L-type Ca2+channel，LTCC）迅速釋放到心肌細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞質(zhì)中的Ca2+達(dá)到了一定的濃度，RyR2通道開放，使細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載[8]。另有研究[9,10]結(jié)果顯示烏頭堿作用于心肌細(xì)胞后的RyR2基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平上調(diào)，可使L型Ca2+通道m(xù)RNA的表達(dá)增多，使L型Ca2+通道開放數(shù)量增加而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+增加，發(fā)生鈣超載致心律失常。付敏等[11]發(fā)現(xiàn)應(yīng)用烏頭堿后，心肌細(xì)胞內(nèi)鈣振蕩的振幅明顯減小，且高濃度烏頭堿較低濃度烏頭堿致心肌細(xì)胞鈣振蕩振幅的變化更加明顯。由此可見烏頭堿對(duì)心肌細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)產(chǎn)生了影響，破壞了鈣穩(wěn)態(tài)的平衡，導(dǎo)致Ca2+平衡失調(diào)，這可能是影響心肌細(xì)胞收縮-舒張功能的主要依據(jù)，從而引發(fā)心率失常。

張世忠等[12]利用心肌細(xì)胞K+通道電生理原理激動(dòng)鉀通道可加強(qiáng)復(fù)極,抑制鈉通道激活造成的后除極化，結(jié)果表明，通過激動(dòng)敏感的K+通道，顯著增高了心肌細(xì)胞對(duì)烏頭堿可耐受的最大濃度，使烏頭堿強(qiáng)心效果明顯增強(qiáng)，強(qiáng)心作用的有效濃度范圍顯著增高。還有研究[13,14]發(fā)現(xiàn)對(duì)心臟的毒性作用機(jī)制主要在于抑制心肌細(xì)胞質(zhì)膜Na+通道的失活，使Na+持續(xù)內(nèi)流，延長心肌細(xì)胞膜除極化時(shí)程而引發(fā)心律失常。

1.2 次烏頭堿對(duì)蛋白表達(dá)的影響

次烏頭堿也是附子中主要的雙酯型生物堿之一，對(duì)小鼠的LD50低于烏頭堿和新烏頭堿，在炮制和煎煮的過程中分解緩慢不易破壞，含量較高[15-17]，故有學(xué)者研究次烏頭堿對(duì)心肌細(xì)胞的毒性機(jī)理。易明晶[18]用蛋白印跡法和熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法（PCR），研究了附子主要有效成分次烏頭堿合甘草苷配伍前后對(duì)心肌細(xì)胞和心肌組織中鈣調(diào)控蛋白信使核苷酸（CaM mRNA）和蛋白表達(dá)的影響，次烏頭堿能夠抑制CaM的表達(dá)，和連接蛋白43（Cx43）磷酸化水平，從而影響心肌收縮功能和節(jié)律變化。

另有研究[19,20]將次烏頭堿作用于心肌細(xì)胞，觀察心肌細(xì)胞搏動(dòng)頻率，結(jié)果使心肌細(xì)胞的波動(dòng)頻率加快，細(xì)胞膜穩(wěn)定性破壞，當(dāng)次烏頭堿濃度超過32μmol﹒L-1時(shí)，會(huì)使心肌細(xì)胞停止搏動(dòng)。用MTT法檢測(cè)次烏頭堿對(duì)心肌細(xì)胞的毒性，結(jié)果顯示次烏頭堿對(duì)心肌細(xì)胞存活率無影響。利用熒光定量PCR測(cè)細(xì)胞的蛋白表達(dá)，表明次烏頭堿灌胃給藥后能顯著抑制鈉鈣交換體（NCX） mRNA的表達(dá)細(xì)胞內(nèi)和誘導(dǎo)Ⅱ型雷諾定受體（RyR2）mRNA的表達(dá)，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高，加重心律失常發(fā)生。

1.3 附子毒性與心肌細(xì)胞作用靶標(biāo)的相關(guān)性

研究中藥發(fā)揮藥效的活性成分及作用靶點(diǎn)一直是中藥研究的巨大挑戰(zhàn)和未來方向[21]。近年來，鈉鈣交換蛋白（NCX）成為研究心肌細(xì)胞保護(hù)，治療心律失常的新靶點(diǎn)，心肌舒張時(shí)，將胞漿Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外的最主要途徑。在病理狀態(tài)下，胞內(nèi)濃度升高，顯著影響肌漿網(wǎng)的鈣填充，誘發(fā)自發(fā)性的鈣釋放[22]。

李勇志等[22]通過觀察次烏頭堿對(duì)大鼠心肌細(xì)胞Na+通道SCN5A亞基和鈉鈣交換蛋白（NCX）mRNA表達(dá)，得出結(jié)論當(dāng)次烏頭堿濃度大于60μmol﹒L-1時(shí)，可以通過增加心肌細(xì)胞膜里Na+通道SCN5A亞基和NCX mRNA表達(dá)，進(jìn)而激活L-Ca通道后參與心律失常發(fā)生過程，所以在干預(yù)這兩個(gè)靶點(diǎn)可以達(dá)到減毒而緩解心律失常。Li等[24]建立了高表達(dá) VEGFR的 HEK293 細(xì)胞膜色譜[25]在線液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用篩選系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)作用于 VEGFR-2 的三個(gè)活性組分烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿，并采用體外MTT和ELISA實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了對(duì)VEGF的抑制作用。

2 附子配伍甘草對(duì)心肌細(xì)胞減毒作用機(jī)制

2.1 附子配伍甘草物質(zhì)基礎(chǔ)

甘草中含有三萜皂苷類成分甘草酸和甘草次酸，黃酮類成分甘草苷，研究表明，甘草主要有效成分甘草苷和甘草酸對(duì)心臟具有一定的保護(hù)作用，這兩類化合物的抗氧化[26]和抗炎作用[27]可能是保護(hù)心臟免受傷害的主要機(jī)制。而甘草次酸具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤以及免疫調(diào)節(jié)等廣泛活性[28]。

有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[29]，甘草皂苷抗心律失常作用可能是其具有負(fù)性頻率和傳導(dǎo)作用，以及抗心肌缺血作用的結(jié)果。附子與炙甘草合煎后，附子烏頭堿和炙甘草黃酮類成分的量均有不同程度下降,由此推測(cè)甘草抑制附子毒性的物質(zhì)基礎(chǔ)可能與甘草黃酮有關(guān)[30]。目前認(rèn)為“成分結(jié)合”學(xué)說[31]是附子-甘草配伍減毒主要作用途徑，即附子-甘草配伍合煎過程中甘草酸成分與烏頭堿等毒性成分根據(jù)酸堿成分相互作用結(jié)合而逐漸沉淀，使湯液中毒性成分雙酯型生物堿含量減少，從而使合煎液毒性降低。從藥動(dòng)學(xué)角度看，甘草附子配伍的物質(zhì)基礎(chǔ)可能與其體外化學(xué)成分含量無關(guān)，而是烏頭堿與甘草次酸在體內(nèi)發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，生成沉淀生成不溶于水的大分子絡(luò)合物，降低藥液中生物堿量，延緩了其在胃腸道的吸收，從而發(fā)揮解毒作用[32-35]。有研究表明[36]附子配伍甘草的比例也會(huì)影響作用效果，附子、甘草中主要有效成分次烏頭堿配伍甘草次酸對(duì)心肌細(xì)胞缺氧缺糖損傷有保護(hù)作用，其中以1:1配伍組效果最佳。甘草配伍附子對(duì)慢性心衰大鼠具有增效減毒的作用，其機(jī)制可能跟心肌細(xì)胞凋亡信號(hào)通路有關(guān)。

2.2 甘草配伍附子后對(duì)心肌細(xì)胞內(nèi)電生理的作用

周天梅[37]等運(yùn)用MTT法檢測(cè)附子-甘草主要有效成分配伍后對(duì)心肌細(xì)胞存活率的影響，采用Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶和琥珀酸脫氫酶（SDH）試劑盒測(cè)試。結(jié)果表明烏頭堿能導(dǎo)致心肌細(xì)胞Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶和SDH活性降低，細(xì)胞存活率也下降。甘草主要有效成分配伍后，這三種酶的活性和細(xì)胞存活率具有一定程度恢復(fù)，從而保護(hù)心肌細(xì)胞損傷。其減毒機(jī)理可能是通過SDH、Na+-K+-ATP酶，Ca2+-Mg2+-ATP酶等能量代謝調(diào)節(jié)，從而抑制心肌細(xì)胞缺氧缺血，實(shí)現(xiàn)對(duì)心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)，發(fā)揮減毒作用。

2.2 從代謝角度研究甘草配伍附子減毒機(jī)理

Hui Gong等[38]研究發(fā)現(xiàn)從甘草中分離出來的異橄欖巖，通過Nrf2激活促進(jìn)解毒系統(tǒng)，這可能是甘草的潛在保護(hù)機(jī)制。孫博等[39]利用NMR代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)附子、甘草配伍的減毒作用探究，發(fā)現(xiàn)是通過對(duì)整個(gè)代謝環(huán)境的調(diào)節(jié)，減少多種氨基酸、有機(jī)酸、酮體等代謝產(chǎn)物受附子毒性影響的含量變化幅度，來有效降低附子的毒性作用。

2.3 次烏頭堿配伍甘草次酸和甘草苷的減毒作用

劉巧云等[40]以新生SD乳鼠心肌細(xì)胞作為研究對(duì)象，觀察甘草次酸和甘草苷對(duì)次烏頭堿引起的心肌細(xì)胞形態(tài)的變化，以及對(duì)超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）活性的影響，結(jié)果表明480μmol﹒L-1甘草苷和120μmo﹒L-1甘草次酸能減小由120μmol﹒L-1次烏頭堿所造成的的心肌細(xì)胞形態(tài)損傷，使心肌細(xì)胞SOD和GSH-PX活力增加，降低心肌細(xì)胞的凋亡水平，同時(shí)提高其抗氧化能力，降低次烏頭堿對(duì)心肌細(xì)胞的毒性

甘草苷與次烏頭堿聯(lián)合作用于乳鼠原代心肌細(xì)胞，甘草苷與次烏頭堿協(xié)同抑制鈣調(diào)控蛋白的表達(dá)，對(duì)次烏頭堿的心肌連接蛋白43（Cx43）磷酸化的抑制作用產(chǎn)生拮抗，由此在一定程度上拮抗次烏頭堿導(dǎo)致的心律失常[18]。

王利勤[36]等研究附子有效成分次烏頭堿和甘草成分甘草次酸配伍后對(duì)H9c2心肌細(xì)胞缺糖缺氧損傷的影響，配伍后細(xì)胞形態(tài)有明顯的改善，同時(shí)降低腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素1β（1L-1β）、肌酸激酶（CK）含量及兔抗Caspase-3、Fas-L、Fas蛋白表達(dá)，所以甘草次酸和次烏頭堿配伍后對(duì)心肌細(xì)胞缺糖缺氧損傷具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與抑制細(xì)胞凋亡和抗炎。

3 結(jié)論與討論

通過以上文獻(xiàn)綜述，學(xué)者們對(duì)附子配伍甘草減毒增效機(jī)理已經(jīng)取得了一定的認(rèn)識(shí)，但其研究角度較單一，大多停留在藥理毒理作用或物質(zhì)基礎(chǔ)篩選階段，且研究單一組分的比較多，相互間重復(fù)性較大。將來對(duì)附子配伍甘草對(duì)大鼠心肌細(xì)胞的減毒作用機(jī)制，可以從以下幾點(diǎn)展開進(jìn)一步研究：①大多數(shù)的研究只對(duì)烏頭堿影響大鼠心肌細(xì)胞的的離子變化引發(fā)興奮收縮耦聯(lián)機(jī)制，還未研究烏頭堿作用于心肌細(xì)胞導(dǎo)致的心率增加的抑制作用是否通過影響心肌細(xì)胞離子通道，有待于進(jìn)一步研究；②研究烏頭堿類對(duì)心肌細(xì)胞受體的影響，現(xiàn)階段有學(xué)者做了對(duì)腎上腺素受體的研究，但還未對(duì)其他亞型和心肌細(xì)胞上的其他受體如M-膽堿受體有所研究。③可以研究附子甘草配伍后的物質(zhì)變化及體外轉(zhuǎn)運(yùn)過程研究的還較少，也是研究的一個(gè)方向。附子配伍甘草目前僅僅針對(duì)正常心肌細(xì)胞的研究，可進(jìn)一步展開對(duì)病理狀態(tài)下心肌細(xì)胞的研究。