沈 成，童 僑，金一然，袁辰陽，羅靜帆，黃新河

(西南交通大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，成都 610031)

衰老是生物體維持分子、細胞或個體水平生理完整性能力的逐步喪失，表現(xiàn)為細胞或生物體對各種壓力和疾病的抗性逐步下降的生物學(xué)過程[1]。衰老幾乎發(fā)生于每個物種中，人類也不例外。近年研究顯示，衰老本身是導(dǎo)致衰老相關(guān)疾病(包括心血管疾病、II型糖尿病、神經(jīng)退行性疾病及癌癥等)最主要的風(fēng)險因子[2]，因此，通過延緩衰老本身來預(yù)防和治療衰老相關(guān)疾病正成為業(yè)內(nèi)共識，而尋找抗衰老活性分子和策略正成為衰老研究領(lǐng)域的重點和熱點。

天然產(chǎn)物多球殼菌素(Myriocin, 分子式C12H39NO6，分子量401.5，一種神經(jīng)鞘脂合成特異性抑制劑)是前期發(fā)現(xiàn)的一種新的抗衰老活性分子[3]，雷帕霉素(Rapamycin, 分子式C51H79NO13，分子量914.0，一種TORC1激酶特異抑制劑)是一種廣譜的抗衰老活性分子。前期研究表明，多球殼菌素和雷帕霉素可通過分子間協(xié)同效應(yīng)延緩芽殖酵母細胞衰老并延長細胞壽命[4]。為進一步闡明此協(xié)同效應(yīng)的作用機制，本文考察了該協(xié)同效應(yīng)對細胞轉(zhuǎn)錄組的影響，進而從生信角度分析了該協(xié)同效應(yīng)調(diào)控的細胞過程和信號通路，為闡明該協(xié)同效應(yīng)的作用機制提供依據(jù)和思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與原始數(shù)據(jù)

實驗菌種、培養(yǎng)基及處理均同文獻[4]。菌種為野生型芽殖酵母(Saccharomycescerevisiae)DBY746；培養(yǎng)基為SDC(Synthetic Dextrose Complete)；實驗處理為：無藥物處理組(ND,樣本編號DS-1～5)、45 ng/ml Myr處理組(Myr,樣本編號DS-6～10)、450 pg/ml Rap處理組(Rap，樣本編號DS-11～15)、45 ng/ml Myr及450 pg/ml Rap組合處理組(Syn,樣本編號DS-16～20)。隨后利用RNeasy 試劑盒 (Qiagen, Cat#74104)提取總RNA，在各組中篩選出組內(nèi)RNA質(zhì)量濃度相近且質(zhì)量好的3個樣本，進行基因芯片檢測，得到微陣列MAS5信號值作為原始數(shù)據(jù)[5-8]。

1.2 生物信息學(xué)分析

1.2.1 主成分分析

主成分分析(principal component analysis, PCA)使用R軟件(版本3.3)及R Studio(版本1.0.136)，通過擴展包 “psych”，對每個樣本的5 900個探針信號值數(shù)據(jù)做降維處理，提取3個主成分；通過擴展包“rgl”，將3個主成分的因子載荷(loadings)作為三維坐標，進行可視化。

1.2.2 差異表達基因

通過使用R語言平臺(版本3.3，https://www.r-project.org/ 下載)、“Bioconductor”擴展包分析基因芯片數(shù)據(jù)，得到差異表達基因(differentially expressed genes, DEGs) 列表(DEGs list)。采用在線程序DAVID (database for annotation, visualization and integrated discovery, 版本6.8, https://david-d.nciFold Changerf.gov/)補充探針注釋[9]，YEASTRACT(yeast search for transcriptional regulators and consensus tracking, http://www.yeastract.com/ )補充ORF/Gene Symbol。同時通過擴展包“Vennerable”繪建韋恩圖(Venn diagrams)，對差異表達基因進行可視化[10]。

1.2.3 基因本體聚類(GO terms clustering)

采用在線程序DAVID (database for annotation, visualization and integrated discovery, https://david-d.nciFold Changerf.gov/) Functional Annotation Clustering工具[9]，對DEGs list (FDR<0.05 & Fold Change>10%)進行基因本體聚類[11]，選擇Benjamin=0.05為閾值篩選clusters，選擇Benjamin<0.05 得到Go Terms。

1.2.4 信號通路分析(pathways analysis)

采用在線程序DAVID (database for annotation, visualization and integrated discovery, https://david-d.nciFold Changerf.gov/) Functional Annotation Clustering工具[9]，對DEGs list (FDR<0.05 & Fold Change>10%)進行信號通路[12]聚類，選擇Benjamin=0.05為閾值篩選聚類簇，選擇Benjamin<0.05 的信號通路。

2 結(jié)果分析

2.1 主成分分析

主成分分析結(jié)果見表1。在提取的3個主成分中，協(xié)同效應(yīng)組(Syn)的主成分1因子載荷與其他3組體現(xiàn)出明顯的差異。對表1中數(shù)據(jù)進行可視化如圖1所示,結(jié)果顯示，Syn與單種藥物處理組(Myr, Rap)及單一藥物處理組(Myr, Rap)或無藥物處理組(ND)呈顯著差異，同時，Myr、Rap及ND等3組在主成分上有明顯重疊，這表明低劑量藥物處理芽殖酵母時，與對照組無顯著差異，而兩種藥物組合使用時，產(chǎn)生了顯著差異。

2.2 差異表達基因分析

分析差異表達基因數(shù)目可知，相比于無藥物處理組，協(xié)同效應(yīng)用藥導(dǎo)致2 546個基因的表達水平發(fā)生顯著變化，而其中超過89%的差異表達基因在Myr組、Rap組未出現(xiàn)。Myr組、Rap組及Syn組處理導(dǎo)致的差異表達基因列表見表2.

通過繪制韋恩圖(如圖2所示)可直觀看出，在該篩選條件下，絕大多數(shù)差異表達基因只存在于協(xié)同效應(yīng)組中，協(xié)同用藥與單一藥物處理有顯著差異。

2.3 基因本體聚類分析

生物學(xué)過程的聚類結(jié)果(如圖3所示)顯示，差異表達的基因主要與氧化還原過程(GO:0055114 oxidation-reduction process)、細胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)(GO:0034599 cellular response to oxidative stress)、三羧酸循環(huán)(GO:0006099 tricarboxylic acid cycle)、需氧呼吸(GO:0009060 aerobic respiration)、線粒體電子傳遞(泛醌至細胞色素c)(GO:0006122 mitochondrial electron transport, ubiquinol to cytochrome c)、ATP生物合成途徑(GO:0006754 ATP biosynthetic process)、線粒體電子傳遞(細胞色素c至氧)(GO:0006123 mitochondrial electron transport, cytochrome c to oxygen)、ATP合成偶聯(lián)質(zhì)子轉(zhuǎn)運(GO:0015986 ATP synthesis coupled proton transport)等過程密切相關(guān)。這些生物學(xué)過程幾乎均發(fā)生在線粒體區(qū)域中，推測線粒體相關(guān)生物學(xué)過程是協(xié)同效應(yīng)的一個重要靶點。

表1 主成分分析數(shù)據(jù)Table 1 PCA data

圖1 主成分分析Fig.1 Principle component analysis

注：紅色、藍色、綠色和粉色分別為無藥物處理組、Rap處理組、Myr處理組和協(xié)同效應(yīng)組; RC1、RC2、RC3分別為某樣本的主成分1、2、3的因子載荷。

表2 差異表達基因數(shù)目Table 2 The number of differentially expressed genes (DEGs)

注：篩選條件為FDR< 0.05，F(xiàn)old Change > 10%。

細胞組分的聚類分析結(jié)果(如圖3所示)顯示，差異表達的基因主要與線粒體(GO:0005739 mitochondrion)、線粒體基質(zhì)(GO:0005759 mitochondrial matrix)、線粒體內(nèi)膜(GO:0005743 mitochondrial inner membrane)、呼吸鏈(GO:0070469 respiratory chain)、線粒體膜間隙(GO:0005758 mitochondrial intermembrane space)、線粒體呼吸鏈復(fù)合物IV(GO:0005751 mitochondrial respiratory chain complex IV)、線粒體呼吸鏈復(fù)合物III(GO:0005750 mitochondrial respiratory chain complex III)、線粒體擬核(GO:0042645 mitochondrial nucleoid)等密切相關(guān)。這一結(jié)果也顯示，線粒體相關(guān)細胞組分是協(xié)同效應(yīng)的重要靶點。

2.4 通路分析

通路分析結(jié)果(如圖4所示)顯示，相比于無藥物處理組，協(xié)同效應(yīng)用藥組內(nèi)147條通路發(fā)生改變，其中超過60%的通路在Myr組、Rap組沒有顯著變化。按照Benjamin由小至大排列，在前15條通路中，超過1/3的通路(包括氧化磷酸化(sce00190:Oxidative phosphorylation)、碳代謝(sce01200:Carbon metabolism)、三羧酸循環(huán)(sce00020:Citrate cycle)、丙酮酸代謝(sce00620:Pyruvate metabolism)、糖酵解(sce00010:Glycolysis / Gluconeogenesis)等)直接與線粒體功能相關(guān)，具體可見附加文件GO term & Pathways.xlsx。

圖2 差異表達基因韋恩圖 Fig.2 Venn diagram of DEGs

注：篩選條件為FDR值< 0.05且Fold change > 10%，圓形區(qū)域表示在上述篩選條件下差異表達的基因數(shù)量，顏色代表不同的實驗處理組：綠色為Syn組；藍色為Myr組；紅色為Rap組。

圖3 GO聚類分析

Fig.3 GO terms clustering analysis

注：圖3(a)中左側(cè)為不同的基因本體項目(GO terms)，右側(cè)為某項目中基因表達水平(藍色表示上調(diào)、紅色表示下調(diào)、綠色表示正常)的計數(shù)，圖3(b)、(c)類同。在滿足篩選條件的項目中，對p取負常用對數(shù)值，按大小排序，圖3(a)生物學(xué)過程取值最大的15個項目，圖3(b)分子功能取全部8項，圖3(c)細胞組分取值最大的15個項目。

圖4 通路分析Fig.4 Pathway analysis

注：圖中左側(cè)為不同的通路，右側(cè)為不同表達水平(藍色表示上調(diào)、紅色表示下調(diào)、綠色表示正常)的差異表達基因在某通路中所占比例。對p取負常用對數(shù)值，按大小排序并取值最大的15條通路繪制圖4。

3 討 論

3.1 主成分分析

主成分分析結(jié)果顯示單一藥物處理組(包括Myr, Rap)與無藥物處理組在轉(zhuǎn)錄組水平無顯著差異，說明此低劑量藥物對轉(zhuǎn)錄組產(chǎn)生極小影響，與實驗中發(fā)現(xiàn)的低劑量藥物對細胞壽命影響極小的結(jié)論相吻合。

3.2 差異表達基因數(shù)量分析

對差異表達基因列表分析顯示，協(xié)同效應(yīng)組表達水平發(fā)生顯著變化的2 546個基因中，有超過89%的差異表達基因在Myr組、Rap組未出現(xiàn)。僅在協(xié)同藥物處理時表達水平發(fā)生顯著變化的基因，簡稱為Unique to Syn。本文認為，導(dǎo)致該情況發(fā)生的原因為：1)Unique to Syn的表達受到單一藥物雷帕霉素或多球殼菌素的調(diào)控，但由于實驗中選用的藥物濃度極低(45 ng/ml Myr、450 pg/ml Rap)，未能使該類基因的表達水平達到本文選取的統(tǒng)計學(xué)篩選閾值，即未能使其顯著性差異表達；2)Unique to Syn的表達不受單一藥物雷帕霉素或多球殼菌素的調(diào)控，僅僅在兩種小分子同時處理時才會對Unique to Syn起到調(diào)控。這兩種猜想還需進一步通過實驗加以判斷。

3.3 差異表達基因聚類分析

差異基因本體聚類及通路分析結(jié)果均顯示，線粒體功能，包括線粒體相關(guān)的組分(如線粒體內(nèi)膜、外膜)和生化過程(如氧化磷酸化、三羧酸循環(huán))，可能是多球殼菌素和雷帕霉素協(xié)同效應(yīng)調(diào)控的重要靶點，后續(xù)將從實驗角度加以重點研究。線粒體的氧化反應(yīng)可能參與衰老和長壽的過程。線粒體是細胞內(nèi)活性氧的主要來源，線粒體或其DNA受到氧化損傷可能縮短壽命[13]。因此，推測線粒體相關(guān)的分子功能、細胞組分、生物學(xué)過程和信號通路是此協(xié)同效應(yīng)的一個主要靶點，其與衰老具有密不可分的關(guān)系。

4 結(jié) 論

1)研究表明，線粒體內(nèi)蛋白及核酸等氧化損傷是機體衰老的重要原因。Kovalenko等[14]提出線粒體DNA突變在組織細胞衰老過程中起著重要作用，發(fā)現(xiàn)線粒體DNA突變引起細胞凋亡才是導(dǎo)致衰老的根本因素，而并非由自由基增多引起的細胞損傷所導(dǎo)致的。

2)近年研究發(fā)現(xiàn)，線粒體DNA的突變可以引起某種通路中的信號級聯(lián)放大，最終導(dǎo)致細胞程序性死亡[13, 15]。這一研究結(jié)果為本文中所考察的協(xié)同效應(yīng)實驗現(xiàn)象的生物學(xué)解釋提供了思路，即雷帕霉素和多球殼菌素的組合調(diào)控了某種級聯(lián)放大通路，導(dǎo)致細胞壽命的顯著延長。

References)

[1]LOPEZ-OTIN C, BLASCO M A, PARTRIDGE L, et al. The hallmarks of aging[J]. Cell, 2013, 153(6): 1194-1217. DOI: 10.1016/j.cell.2013. 05.039.

[2]KENNEDY B K, BERGER S L, BRUNET A, et al. Geroscience: linking aging to chronic disease[J]. Cell, 2014, 159(4): 709-713. DOI: 10.1016/j.cell.2014.10. 039.

[3]HUANG Xinhe, LIU Jun, DICKSON R C. Down-regulating sphingolipid synthesis increases yeast lifespan[J]. PLoS Genet, 2012, 8(2): e1002493. DOI:10.1371/journal.pgen.1002493.

[4]HUANG Xinhe, LIU Jun, WITHERS B R, et al. Reducing signs of aging and increasing lifespan by drug synergy[J]. Aging Cell, 2013, 12(4): 652-660. DOI:10.1111/acel.12090.

[5]IRIZARRY R A, BOLSTAD B M, COLLIN F, et al. Summaries of Affymetrix GeneChip probe level data[J]. Nucleic Acids Res, 2003, 31(4): e15. DOI: 10.1093/nar/gng015.

[6]PEPPER S D, SAUNDERS E K, EDWARDS L E, et al. The utility of MAS5 expression summary and detection call algorithms[J]. BMC Bioinformatics, 2007, 8(273). DOI:10.1186/1471- 2105-8-273.

[7]劉建勝, 張善鎮(zhèn), 姚志洪,等. 不同表達譜芯片分析方法在藥效機制研究中的應(yīng)用[J]. 計算機應(yīng)用與軟件,2015,32(6):57-61，108. DOI:10.3969/j.issn.1000-386x.2015.06.014.

LIU Jiansheng,ZHANG Shanzhen,YAO Zhihong, et al.Application of different microarray analysis methods in pharmacological mechanism research[J].Computer Applications and Software, 2015,32(6):57-61，108. DOI:10.3969/j.issn.1000-386x.2015.06.014.

[8]賈曉東, 陳秀杰, 吳欣, 等. 基于基因表達變異性的通路富集方法研究[J]. 生物化學(xué)與生物物理進展, 2013, (12): 1256-1264. DOI:10.3724/SP.J.1206.2012.00410.

JIA Xiaodong, CHEN Xiujie, WU Xin, et al A method of pathway enrichment analysis based gene expression variability[J]. Progress in Biochemistry and Biophysics, 2013,(12):1256-1264.DOI:10.3724/SP.J.1206.2012. 00410.

[9]HUANG D W, SHERMAN B T, LEMPICKI R A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources[J]. Nat Protoc, 2009, 4(1): 44-57. DOI:10.1038/nprot.2008.211.

[10]紀相禹. 基于R語言的差異表達基因檢測研究[D]. 長春:吉林大學(xué), 2011.

JI Xiangyu. The study of differentially expressed gene detection based on r language[D]. Changchun: Jilin University, 2011.

[11]ASHBURNER M, BALL C A, BLAKE J A, et al. Gene ontology: tool for the unification of biology. The gene ontology consortium[J]. Nat Genet, 2000, 25(1): 25-29. DOI:10.1016/j.jcz.2007.05.001.

[12]KANEHISA M, GOTO S. KEGG: kyoto encyclopedia of genes and genomes[J]. Nucleic Acids Research, 2000, 28(1): 27-30.

[13]莫菲, 管德龍, 韓燕,等. 線粒體DNA及相關(guān)基因與衰老的關(guān)系[J]. 中國老年學(xué)雜志, 2016, 36(11): 2796-2799. DOI:10.3969/j.issn.1005- 9202. 2016.11.109.

[14]龍建綱. 衰老及相關(guān)疾病中線粒體損傷與保護機制研究[D]. 上海：第二軍醫(yī)大學(xué), 2006. DOI:10.7666/d.y897183.

[15]RAIMUNDO N, SONG Lei, SHUTT T E, et al. Mitochondrial stress engages E2F1 apoptotic signaling to cause deafness[J]. Cell, 2012, 148(4): 716-726. DOI:10. 1016/j.cell.2011.12.027.