朱 祥，堯晨光，胡康洪*

(1.湖北工業(yè)大學(xué) 中德生物醫(yī)學(xué)中心，武漢 430068；2.發(fā)酵工程教育部重點實驗室(湖北工業(yè)大學(xué))，武漢 430068)

依據(jù)中國國家疾病控制中心數(shù)據(jù)，手足口病(hand foot mouth disease，HFMD)年感染率位居丙類傳染病首位，腸道病毒71型(enterovirus 71，EV71)是引起手足口病的常見病原體，是繼脊髓灰質(zhì)炎病毒之后嚴(yán)重危害幼兒身體健康的重要病原體之一[1]。目前國內(nèi)已有EV71滅活疫苗上市，對于病毒預(yù)防已有保障，但無抗EV71特效藥物，急需深入研究病毒感染過程中的宿主調(diào)控機制，發(fā)現(xiàn)新穎的抗病毒治療靶標(biāo)，助力抗EV71特效藥開發(fā)。

EV71和宿主細(xì)胞因子作用復(fù)雜，現(xiàn)有報道顯示細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Zif268由EGR1基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)可以直接和EV71的RNA結(jié)合促進(jìn)病毒的復(fù)制[2]。另外發(fā)現(xiàn)病毒的2A蛋白酶1裂解宿主的eIF4GI或是eIF4GII，轉(zhuǎn)換宿主依賴帽子的翻譯過程為不依賴帽子的IRES翻譯過程[3]。此外有研究發(fā)現(xiàn)病毒非結(jié)構(gòu)蛋白與宿主有較為復(fù)雜的相互作用，其中2A、3C蛋白是病毒的前體蛋白水解酶，具有阻斷宿主自身抗病毒反應(yīng)的作用。2A蛋白既可抑制I型干擾素的產(chǎn)生又可阻斷細(xì)胞中少量β干擾素激活的I型干擾素信號通路，在EV71免疫逃逸過程中發(fā)揮重要作用。2A蛋白具有蛋白酶活性和轉(zhuǎn)錄激活因子功能，并切割Nup62而抑制其核轉(zhuǎn)運過程[4]。2C蛋白通過結(jié)合RelA(p65)蛋白抑制NF-kB的激活，并且重排宿主膜蛋白[5]。3C蛋白切割干擾素調(diào)節(jié)因子7(interferon regulatory factor 7，IRF7)抑制細(xì)胞應(yīng)答[6]，并通過抑制維甲酸誘導(dǎo)基因-I(retinoid acid-inducible gene-I，RIG-I)介導(dǎo)的干擾素調(diào)控因子3(interferon regulatory factor 3，IRF3)的活性和切割接頭蛋白TRIF起到抑制干擾素產(chǎn)生的作用[7]，因此干擾素不能用于治療EV71引起的手足口病。3D蛋白充當(dāng)病毒基因組復(fù)制酶，具有RNA依賴的RNA聚合酶功能，Yu等[8]發(fā)現(xiàn)EV71可以通過3D蛋白使細(xì)胞周期停滯于S期，并可以結(jié)合NLRP3增強炎癥小體的組裝[9]。Wong等[10]研究發(fā)現(xiàn)EV71感染Vero細(xì)胞0.5～6.0 h期間能夠活化PI3K/AKT通路并且通過抑制GSK-3過活性抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。對于病毒感染研究發(fā)現(xiàn)“細(xì)胞因子風(fēng)暴”可能與疾病的進(jìn)程密切相關(guān)。所以僅僅從局部出發(fā)關(guān)注某幾個基因的表達(dá)差異不足以描述這種高度復(fù)雜的調(diào)控關(guān)系。RD細(xì)胞是研究EV71與宿主相互作用的常用感染細(xì)胞系[11]。本文使用WGCNA方法構(gòu)建了與感染時間相關(guān)差異基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，通過差異基因間的關(guān)聯(lián)度識別與EV71感染相關(guān)的關(guān)鍵基因，為抗EV71藥物研究提供新視角。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)與材料

本研究9個樣本(0、4、8 h各3個)表達(dá)譜數(shù)據(jù)集來源于BEI數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)集GEOD-15323，對應(yīng)的NCBI數(shù)據(jù)集是GSE15323(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE15323)。q-PCR引物參考相關(guān)文獻(xiàn)或是自行設(shè)計，引物合成由昆泰瑞公司完成。RD細(xì)胞(rhabdomyosarcoma cells)和EV71病毒來源于武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心。培養(yǎng)細(xì)胞用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基(血清和培養(yǎng)基購自Biological Industries ?)

1.2 加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

1.2.1 構(gòu)建差異表達(dá)譜矩陣數(shù)據(jù)

芯片數(shù)據(jù)中實際每一行對應(yīng)一個探針序列號，多個探針對應(yīng)同一個基因，通過數(shù)據(jù)控制將探針檢測值的差異系數(shù)小于50%的探針剔除，并采用SAM方法對保留的探針組進(jìn)行篩選，設(shè)定SAM參數(shù)為FDR≤0.05。通過3個時間點之間的兩兩比較，對篩選的探針組取合集，構(gòu)建基因表達(dá)譜矩陣。

1.2.2 離群樣本的檢測

離群樣本定義為在聚類樹圖中某個樣本高度分離于集體樣本或是分類樣本。離群樣本對網(wǎng)絡(luò)模塊的分析結(jié)果具有較大的影響，進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建前需要檢查離群樣本的存在性，去除離群值。本研究將9個樣本的基因表達(dá)值矩陣根據(jù)其馬氏距離繪制樹形圖，剔除離群樣本。

1.2.3 基因模塊分析

WGCNA方法在生物信息學(xué)中屬于系統(tǒng)生物學(xué)分析工具，使用該方法依賴的前提假設(shè)是生物網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點的連接度分布分析服從冪律分布。WGCNA方法使用一種巧妙的方法將基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行冪律分布擬合。具體方法為對基因表達(dá)值的皮爾森相關(guān)系數(shù)取n次冪指數(shù)加權(quán)，轉(zhuǎn)換基因表達(dá)皮爾生相關(guān)系數(shù)矩陣Sij為鄰接系數(shù)矩陣Aij。相關(guān)系數(shù)值的分布在β次冪作用下逐漸趨于無尺度分布。其中算法定義了無尺度分布的擬合系數(shù)應(yīng)滿足方程的R2>0.8，表達(dá)數(shù)據(jù)可轉(zhuǎn)換為調(diào)控關(guān)系數(shù)據(jù)。動態(tài)剪切數(shù)聚類方法對擬合后的無尺度分布數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析獲取共表達(dá)模塊，模塊內(nèi)的基因代表著一類表達(dá)模式類似的基因簇，使用顏色命名模塊。如圖1所示顯示W(wǎng)GCNA算法的基本步驟。

圖1 WGCNA算法基本步驟Fig.1 WGCNA basic steps

1.3 基因富集分析

利用生物信息學(xué)在線軟件DAVID進(jìn)行基因富集分析和通路富集分析[12]，使用統(tǒng)計學(xué)方法Fisher Exact檢驗計算p值，注釋模塊所具有的生物學(xué)功能。

1.4 樞紐基因篩選

樞紐基因的篩選可以直接使用閾值法，選擇連接度排在網(wǎng)絡(luò)模塊前3位的基因，或是使用TOM(拓?fù)渚仃?導(dǎo)出網(wǎng)絡(luò)圖到VisANT軟件對網(wǎng)絡(luò)模塊進(jìn)行可視化，設(shè)定權(quán)重值篩選樞紐基因。

1.5 qPCR驗證篩選基因的轉(zhuǎn)錄水平

為了驗證樞紐基因在病毒感染中的表達(dá)差異，本文使用EV71感染8 h后的細(xì)胞進(jìn)行提取總RNA、反轉(zhuǎn)錄和qPCR檢測[11]。

選擇基因表達(dá)時間序列數(shù)據(jù)中持續(xù)性上調(diào)3個基因，合并上述8個樞紐基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本表達(dá)情況驗證。本文涉及到的基因引物見表1，引物由昆泰銳(武漢)公司合成。qPCR試驗按照Takara公司的PrimeScript RT reagent kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Premix Ex Taq II試劑盒說明書操作。

表1 引物列表Table 1 Primers list

注：F為上游引物，R為下游引物。

2 結(jié)果分析

2.1 數(shù)據(jù)基本信息

GSE15323全基因組表達(dá)數(shù)據(jù)包含有9個樣本的病毒感染細(xì)胞數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)均經(jīng)過了背景校正和標(biāo)準(zhǔn)化處理。由于數(shù)據(jù)中包含的探針數(shù)量太大，含有56 475個探針組，質(zhì)量低且差異性不強的數(shù)據(jù)太多，會造成數(shù)據(jù)分析時背景過大的情況，為了減少噪音和計算機分析的運行負(fù)荷，先篩選差異基因保留顯著性較高的探針組。使用R語言中的siggene包實現(xiàn)差異基因篩選，濾除不顯著的探針組后得到6 642個探針組(q<0.05)納入本文的重點研究。

2.2 樣本數(shù)據(jù)初篩

通過聚類得到病毒感染細(xì)胞的樣本聚類圖，發(fā)現(xiàn)9個樣本可明顯分為3類，這和試驗設(shè)計一致，因為設(shè)計的感染時間是分為3個時間點，0、4 h感染時間點內(nèi)的類中距離相對較近說明組內(nèi)的樣本一致性較強，8 h感染時間點內(nèi)的類中距離較遠(yuǎn)，說明該組內(nèi)樣本因為病毒感染持續(xù)到后期有大量基因出現(xiàn)表達(dá)變化導(dǎo)致樣本一致性較弱。圖2聚類樹圖結(jié)果顯示9個樣本不存在離群樣本，將所有樣本納入后續(xù)網(wǎng)絡(luò)建模分析。

圖2 樣本聚類樹Fig.2 Samples clustering

2.3 閾值選擇與網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析

選擇合適的鄰接矩陣權(quán)重參數(shù)β進(jìn)行基因表示數(shù)值無尺度擬合。參數(shù)的擬合區(qū)間為1～30，對某節(jié)點連接度的對數(shù)log(i)與該節(jié)點出現(xiàn)概率的對數(shù)log(p(i))建立線性模型，參數(shù)β擬合情況通過線性回歸系數(shù)R2反映，選擇R2首次接近0.9的β作為構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)模塊的目標(biāo)β值。針對本文芯片數(shù)據(jù)選擇β為9。β擬合情況如圖3所示。其中, 圖3的橫軸代表權(quán)重參數(shù)β, 圖3(a)的縱軸表示對應(yīng)網(wǎng)絡(luò)中l(wèi)og(i)和log(p(i))的線性相關(guān)系數(shù)R2，該系數(shù)越高(至少要達(dá)到0.8，完美的無尺度網(wǎng)絡(luò)模型適用指數(shù)是1)，表明該網(wǎng)絡(luò)越趨近于無尺度網(wǎng)絡(luò)；圖3(b)的縱軸代表模型中所有基因接鄰系數(shù)的均值，反映網(wǎng)絡(luò)的平均連接水平。

圖3 參數(shù)β擬合情況Fig.3 Parameter β fitting

2.4 TOM模塊聚類和模塊與感染時間關(guān)聯(lián)

選擇β=9計算網(wǎng)絡(luò)拓?fù)渲丿BTOM，利用層次聚類法得到基因系統(tǒng)聚類樹。根據(jù)動態(tài)分層剪切數(shù)算法挖掘出基因模塊，設(shè)定每一個基因模塊的最小基因數(shù)為100，基因聚類的高度上限為0.995?；蚰K構(gòu)建完成后，計算每個基因模塊的特征向量基因(module eigengene,ME)。

如圖4所示，通過動態(tài)層次聚類本文得到了18個模塊，其中g(shù)rey模塊表示不屬于任何模塊的聚類。

圖4 動態(tài)分層聚類Fig.4 Dynamic hierarchical cluster

對于這18個模塊和感染時間的關(guān)聯(lián)性，本文使用模塊的第一主成分和感染時間的相關(guān)系數(shù)進(jìn)行定量化。分析得出pink模塊和darkgreen模塊和感染時間的關(guān)聯(lián)性最高, 如圖5所示。

圖5 模塊與感染時間的關(guān)聯(lián)性Fig.5 Relationship between modules and infected time

從圖5中可以看出pink模塊和感染時間呈負(fù)關(guān)聯(lián)性，相關(guān)系數(shù)為-0.94，darkgreen模塊和感染時間呈正關(guān)聯(lián)性，相關(guān)系數(shù)為0.97。還有相關(guān)性較強的其他模塊比如orange模塊和black模塊，本文對關(guān)聯(lián)性最強的pink模塊和darkgreen模塊進(jìn)行生物功能注釋。

呈現(xiàn)加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的一種直觀方式是熱圖，將所有基因加權(quán)共表達(dá)值轉(zhuǎn)換得到的拓?fù)渲丿B矩陣?yán)L制于一副全像素圖中，可以明顯看到圖6中有顏色較深區(qū)域，展示的即是加權(quán)共表達(dá)模塊。

圖6 基于TOM矩陣的加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)熱圖Fig.6 Heatmap of network based on TOM matrix

注：圖中基于所有基因的TOM矩陣?yán)L制，熱圖中每行及每列均對應(yīng)一個基因，顏色越深，提示基因間的拓?fù)渲丿B度越高，基因間的調(diào)控關(guān)系越強。圖中的左側(cè)和上側(cè)為基因聚類樹圖中的基因模塊。

2.5 基因模塊的功能分析

通過GO富集分析和通路富集分析可以得到目標(biāo)模塊在基因本位角度和代謝通路角度的信息。其中p值小于0.05的結(jié)果見表2。GO富集分析結(jié)果顯示目標(biāo)模塊主要參與前剪切體的反式組裝、cAMP的應(yīng)答、U5 snRNP、翻譯起始、膜結(jié)構(gòu)、多聚腺苷酸尾的結(jié)合，可能與手足口病的發(fā)生有一定的關(guān)聯(lián)。通路富集分析結(jié)果顯示目標(biāo)模塊高度富集于核糖體通路。

2.6 樞紐基因網(wǎng)絡(luò)展示

結(jié)合模塊基因富集分析和通路富集分析的結(jié)果，將目標(biāo)模塊pink模塊和darkgreen模塊中的基因調(diào)控關(guān)系進(jìn)行可視化展示。如圖7、8所示(同一模塊中拓?fù)渲丿B值相同)，其中pink模塊的權(quán)重值區(qū)間設(shè)置為0.40～1.00，選擇連接度大于或等于7視為樞紐基因，設(shè)置darkgreen模塊的權(quán)重值區(qū)間為0.38～1.00，選擇連接度大于或等于8視為樞紐基因。從pink模塊的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)可以看出3個基因ABLIM1、CTSS和SUPT7L形成一定的核心，其余基因圍繞在其周圍，這種狀態(tài)呈現(xiàn)出小世界性。

表2GO功能富集分析和KEGG代謝通路富集分析結(jié)果

Table2ResultofenrichmentanalysisofGOandKEGGpathway

ModuleDescriptionp?valueenrichmentanalysiscisassemblyofpre?catalyticspliceosome3．1×10-5GOU5snRNP9．7×10-5GOpinkresponsetocAMP1．3×10-4GOAlzheimersdisease7．0×10-3pathwaytranslationalinitiation2．1×10-7GOmembrane7．2×10-6GOdarkgreenpoly(A)RNAbinding1．0×10-4GORibosome2．9×10-3pathway

圖7 pink模塊共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)Fig.7 Network of pink module

圖8 darkgreen模塊共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)Fig.8 Network of darkgreen module

darkgreen模塊形成的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)沒有明顯的小世界性或是成簇性，只有4個基因CXCL9、RPS4X、CD55和HSPA13的連接度較高。表3顯示目標(biāo)模塊中的關(guān)鍵節(jié)點基因。

2.7 目標(biāo)基因的驗證結(jié)果

為了比較目標(biāo)基因的檢測可靠性，將3個持續(xù)性上調(diào)的差異基因TXNIP、FOS和EGR1納入驗證試驗。q-PCR的結(jié)果如圖9所示?？v坐標(biāo)是相對表達(dá)值log 2處理后的數(shù)據(jù)，柱形圖高度為1表示感染24 h該基因的表達(dá)強度為原來2倍。比較芯片數(shù)據(jù)和q-PCR數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)9個基因的變化方向是一致的，有2個基因上、下調(diào)情況不明顯，其中3個持續(xù)性上調(diào)基因在原始芯片和q-PCR試驗中表達(dá)趨勢相同。

表3 目標(biāo)模塊中的關(guān)鍵節(jié)點基因Table 3 Hub genes of targeted modules

圖9 11個基因的相對表達(dá)Fig.9 Relatively expression of 11 genes

3 討 論

本文首先從NCBI的GEO數(shù)據(jù)庫下載EV71感染相關(guān)的表達(dá)譜數(shù)據(jù)集GSE15323(含有9個樣本)，使用WGCNA方法構(gòu)建了18個模塊，并重點關(guān)注感染時間高關(guān)聯(lián)性的pink模塊和darkgreen模塊，對目標(biāo)模塊進(jìn)行GO功能注釋、KEGG通路富集分析和共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)可視化展示，從中篩選了8個Hub基因。pink模塊GO術(shù)語富集為cis assembly of pre-catalytic spliceosome、response to cAMP和 U5 snRNP，darkgreen模塊GO術(shù)語富集為translational initiation、membrane和poly(A) RNA binding；pink模塊沒有富集到顯著的通路，darkgreen模塊富集的通路為Ribosome。

WGCNA方法篩選的基因RPS4X、HSPA13、ABLIM1、MPDU1、CXCL9、CD55、SUPT7L和CTSS在EV71感染中可能具有重要作用。Wang等[13]調(diào)研細(xì)胞因子和病毒感染關(guān)系發(fā)現(xiàn)，CXCL9在腦干腦炎患者血漿中含量比正常人有顯著升高，比較CXCL9在感染EV71的肺水腫患者血漿中含量比無癥狀腦干腦炎患者和正常組有顯著升高，并且隨著病情加重CXCL9表達(dá)值逐漸上升。CD55分子被確定為腸道病毒屬的Echovirus 1病毒的細(xì)胞受體，并且CD55會誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞的c-FOS基因表達(dá)[14]。其余的6個基因RPS4X、HSPA13、ABLIM1、MPDU1、SUPT7L和CTSS沒有發(fā)現(xiàn)和EV71有間接或是直接的關(guān)系。TXNIP、EGR1和c-FOS這3個基因中的TXNIP和EGR1在病毒感染細(xì)胞過程中可能發(fā)揮重要作用。硫氧蛋白相互作用蛋白(thioredoxin interacting protein,TXNIP),該蛋白是細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的重要因子，維持細(xì)胞氧化還原壓力的平衡，而EV71感染細(xì)胞后通過增加NOX2介導(dǎo)的ROS產(chǎn)物上調(diào)氧化還原壓力[15]。EGR1(early growth response 1)，是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，又稱為鋅指蛋白268(Zif268，zinc finger protein 268)或神經(jīng)生長因子誘導(dǎo)蛋白A(NGFI-A，nerve growth factor-induced protein A)，其靶向激活細(xì)胞分化和有絲分裂的必需基因，被認(rèn)為是一種腫瘤抑制基因[16]，報道顯示EGR1可以直接和EV71的RNA結(jié)合促進(jìn)病毒的復(fù)制，并且其促進(jìn)方式不依賴于病毒的IRES結(jié)構(gòu)。有文獻(xiàn)報道[17]EV71感染RD細(xì)胞8 h后c-FOS基因表達(dá)上調(diào)3.34倍和本文的q-PCR結(jié)果較為接近。

4 結(jié) 語

本文成功構(gòu)建了與EV71感染時間相關(guān)的差異基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，挖掘出8個關(guān)鍵基因RPS4X、HSPA13、ABLIM1、MPDU1、CXCL9、CD55、SUPT7L和CTSS，經(jīng)q-PCR實驗驗證3個持續(xù)上調(diào)的基因TXNIP、EGR1、c-FOS和8個樞紐基因的轉(zhuǎn)錄水平與芯片數(shù)據(jù)一致，其中TXNIP、EGR1、c-FOS表達(dá)上調(diào)超過2.5倍，CXCL9下調(diào)4.5倍。這些關(guān)鍵基因的發(fā)現(xiàn)可能為EV71感染機制研究和抗病毒藥物靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)提供一定參考。

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