劉 暢，劉 安

(1.長治醫(yī)學(xué)院 中心實(shí)驗(yàn)室,山西 長治 046000；2.長治醫(yī)學(xué)院附屬和濟(jì)醫(yī)院 醫(yī)務(wù)科,山西 長治 046000)

肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是世界第3大致死癌癥，也是中國乃至亞洲最廣泛的一種癌癥。目前對于肝癌細(xì)胞癌變機(jī)制的研究尚無系統(tǒng)工作。臨床上通常采用肝移植、手術(shù)切除、肝動(dòng)脈化療栓塞等方法治療肝癌，但術(shù)后復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率偏高。有研究人員[1]發(fā)現(xiàn)，PPM1D的mRNA表達(dá)水平與肝癌患者的腫瘤體積、腫瘤分級和總體生存時(shí)間密切相關(guān)。

Mg2+依賴性蛋白磷酸酶1δ(PPM1D)，亦被稱為野生型p53誘導(dǎo)的蛋白磷酸酶1(Wip1，wild-type p53-induced phosphatase 1)。在乳腺腫瘤、卵巢透明細(xì)胞癌、胰腺癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤和髓母細(xì)胞瘤等固體腫瘤中，發(fā)現(xiàn)PPM1D常過量表達(dá)，且與癌癥患者生存狀況不佳呈正相關(guān)[2]。研究人員[1,3]發(fā)現(xiàn)，對于中分化或低分化肝癌患者，腫瘤抑制基因p53通常發(fā)生突變或表達(dá)受到抑制。PPM1D能夠抑制p53信號途徑和p38 MAPK信號通路，推測其為致癌基因[4-5]。但PPM1D的致癌機(jī)制和預(yù)后價(jià)值仍未完全闡明，針對該分子的基因治療手段也尚未見報(bào)道。

越來越多的證據(jù)表明，在多種固體腫瘤中，PPM1D是一個(gè)潛在的腫瘤相關(guān)分子，也是一個(gè)有價(jià)值的預(yù)后標(biāo)志物。PPM1D在接近59 %的肝癌患者體內(nèi)過量表達(dá)，且高表達(dá)PPM1D的患者特點(diǎn)是：AFP水平偏高、腫瘤體積偏大、TNM分期偏高、腫瘤復(fù)發(fā)率偏高、存在肝癌家族史，總體存活時(shí)間偏短[1]。文獻(xiàn)[2]使用siRNA下調(diào)PPM1D表達(dá)，發(fā)現(xiàn)能夠抑制腫瘤異種移植小鼠模型體內(nèi)肝癌細(xì)胞的增殖和遷移能力，降低其致瘤性。因此，PPM1D作為肝癌的一個(gè)潛在預(yù)后標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，它的功能及其參與的信號通路值得深入研究。本文使用生物信息學(xué)分析方法，研究PPM1D蛋白的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)與功能，可為進(jìn)一步研究PPM1D的作用機(jī)制及其作為肝癌治療靶點(diǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

以“PPM1D+物種名”為關(guān)鍵詞，在美國國立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)的GenBank數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，搜索獲得人PPM1D基因轉(zhuǎn)錄本序列和PPM1D蛋白的氨基酸序列信息。

1.2 方 法

使用Clustal2.1(http://www.clustal.org/download/current/)進(jìn)行PPM1D同源蛋白間的多重序列比對。使用MEGA6軟件，Neighbor-joining方法，Boot-strap分析重復(fù)數(shù)設(shè)置為1 000，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，并計(jì)算進(jìn)化距離[6]。使用NCBI的UniGene數(shù)據(jù)庫中EST結(jié)果分析PPM1D的組織表達(dá)特異性，PSORTII(https://psort.hgc.jp/)進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測。使用ExPASy數(shù)據(jù)庫中的ProtParam在線工具(http://web.expasy.org/protparam/)對PPM1D進(jìn)行理化性質(zhì)分析。使用SignalP 4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)和TMHMM 2.0工具(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預(yù)測PPM1D的信號肽和跨膜區(qū)域。使用NetPhosK3.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)和PhosphoSitePlus工具(http://www.phosphosite.org/homeAction.action)分析PPM1D的翻譯后修飾情況。使用SOPMA工具(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl)分析PPM1D的二級結(jié)構(gòu)，NCBI的Conserved Domain數(shù)據(jù)庫分析結(jié)構(gòu)域，SWISS-MODEL 建模服務(wù)器(https://swissmodel.expasy.org/)預(yù)測三維結(jié)構(gòu)。使用STRING數(shù)據(jù)庫(http://string-db.org/)，構(gòu)建與PPM1D相互作用的蛋白網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PPM1D蛋白多序列比對和進(jìn)化關(guān)系分析

在NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索到人PPM1D蛋白在哺乳動(dòng)物、兩棲類和魚類中的同源序列。人PPM1D蛋白的氨基酸序列與黑猩猩、獼猴、野豬、小鼠、大鼠、雞、非洲爪蟾、黃鱔和斑馬魚的相似性分別為99.34 %、98.51 %、94.05 %、89.13 %、78.45 %、73.38 %、61.02 %、54.75 %和50.94 %。圖1表明，人PPM1D蛋白與其他幾種哺乳動(dòng)物序列相似性較大，組成一支，而與兩棲類和魚類幾種動(dòng)物的序列相似性較小。人與黑猩猩的同源性最高，進(jìn)化距離為0.004，與野豬、小鼠和雞的同源蛋白進(jìn)化距離分別為0.027、0.044、0.111，進(jìn)化距離最遠(yuǎn)的是斑馬魚和黃鱔，分別為0.323、0.305。由此推測，PPM1D蛋白的同源性與物種間親緣關(guān)系呈正相關(guān)，親緣關(guān)系越近，蛋白的同源性越高，提示該蛋白在物種進(jìn)化過程中扮演一定角色。

2.2 PPM1D的組織表達(dá)特異性、亞細(xì)胞定位、信號肽與跨膜結(jié)構(gòu)域分析

根據(jù)NCBI的UniGene數(shù)據(jù)庫中EST結(jié)果顯示，PPM1D在以下正常組織均有表達(dá)，拷貝數(shù)分別是：腦34、睪丸26、肺10、腎8、腸8、子宮8、胰腺5、肝1。由此推測，PPM1D的組織表達(dá)特異性不強(qiáng)，在多數(shù)組織中均有表達(dá)。PSORTII預(yù)測，PPM1D定位于細(xì)胞核的可能性最大(60.9 %)，其次可能定位于細(xì)胞質(zhì)(13.0 %)、質(zhì)膜(8.7 %)、細(xì)胞骨架(8.7 %)、分泌系統(tǒng)囊泡(4.3 %)和高爾基體(4.3 %)。由此推測，PPM1D主要在細(xì)胞核中發(fā)揮生理功能，而在其他亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中也可能動(dòng)態(tài)存在。

SignalP 4.0預(yù)測PPM1D蛋白不含切割位點(diǎn)，無信號肽序列如圖2所示，說明該蛋白不是分泌蛋白。TMHMM 2.0預(yù)測PPM1D無跨膜結(jié)構(gòu)域如圖3所示。圖3中，紅色細(xì)線、藍(lán)色細(xì)線和粉色細(xì)線分別表示跨膜區(qū)域、膜內(nèi)部分和膜外部分。圖中PPM1D蛋白位于膜外的概率幾乎為100 %，跨膜區(qū)域和位于膜內(nèi)的概率幾乎為0。藍(lán)色細(xì)線與縱坐標(biāo)為0的基線重疊。粉色粗線用來標(biāo)識多肽鏈中跨膜區(qū)域所在位置，因PPM1D蛋白沒有跨膜區(qū)域，所以在粗線上沒有相應(yīng)標(biāo)記。

圖1 人PPM1D蛋白與其同源序列比對的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 The sequence alignment of human PPM1D protein and its homologous sequences

圖2 PPM1D蛋白的信號肽分析結(jié)果Fig.2 The analysis result of PPM1D signal peptide

圖3 PPM1D蛋白跨膜結(jié)構(gòu)分析Fig.3 Trans-membrane domain analysis of PPM1D

2.3 PPM1D蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)

人PPM1D基因(NM003620.3)位于17號染色體上(17q23.2)，編碼產(chǎn)物NP_003611.1為該基因的蛋白質(zhì)共識編碼序列。PPM1D蛋白含有605個(gè)氨基酸，分子式為C2905H4669N857O880S31，分子量為66 675.1 Da，理論等電點(diǎn)預(yù)測為9.14，屬于堿性蛋白質(zhì)。在哺乳動(dòng)物網(wǎng)織紅細(xì)胞內(nèi)半衰期為30 h，不穩(wěn)定系數(shù)為56.41，屬于不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。脂肪系數(shù)為72.99，總的平均親水性為-0.517。ExPASy數(shù)據(jù)庫中的ProtScale在線工具預(yù)測，PPM1D親水性最強(qiáng)的位點(diǎn)是第585位的精氨酸，分值為-2.878；疏水性最強(qiáng)的位點(diǎn)是第372位的纈氨酸，分值為2.189。由圖4可知，PPM1D蛋白的親水區(qū)域多于疏水區(qū)域，屬于親水蛋白質(zhì)。

圖4 ProtScale分析PPM1D蛋白的親疏水性Fig.4 Hydrophobicity profile of the PPM1D protein analyzed by ProtScale

2.4 PPM1D蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)、三維結(jié)構(gòu)預(yù)測及翻譯后修飾分析

由圖5知，在PPM1D蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)中，隨機(jī)卷曲(圖中橘色)占47.6 %，α-螺旋(圖中藍(lán)色)占23.8 %，延伸鏈(圖中紅色)占21.16 %，β-轉(zhuǎn)角(圖中綠色)占7.44 %。NCBI的Conserved Domain數(shù)據(jù)庫預(yù)測PPM1D蛋白屬于蛋白磷酸酶2C(Protein phosphatase 2C, PP2C)超家族的一員(如圖6所示)，PP2C是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶。PPM1D含有一個(gè)PP2Cc(Complementary DNA encoding the isoform of protein phosphatase 2C)結(jié)構(gòu)域，PP2Cc是約42 kDa的單體酶，含有約390個(gè)氨基酸，與PP2C1異構(gòu)體相似性達(dá)76%,其底物特異性不強(qiáng)，活性依賴于二價(jià)陽離子(主要是錳和鎂)，確切的生理作用尚不清楚[7]。使用SWISS-MODEL 建模服務(wù)器預(yù)測PPM1D蛋白三維結(jié)構(gòu)(如圖7所示)，序列與模板相似度為30.09 %，三維結(jié)構(gòu)預(yù)測表明其符合PP2C結(jié)構(gòu)域模型特點(diǎn)。

使用NetPhosK 3.1和PhosphoSitePlus分析PPM1D翻譯后修飾情況，發(fā)現(xiàn)絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸位點(diǎn)能夠被磷酸化。根據(jù)PPM1D能夠使其互作蛋白發(fā)生去磷酸化，探索其磷酸化程度及動(dòng)態(tài)變化能夠加深對該蛋白功能的理解。此外，賴氨酸會(huì)發(fā)生乙?；?、甲基化和泛素化修飾，針對該蛋白如何發(fā)生泛素化及降解，可以進(jìn)一步探索。

圖5 SOPMA預(yù)測PPM1D蛋白二級結(jié)構(gòu)Fig.5 Predicted secondary structure of PPM1D protein by SOPMA

圖6 PPM1D蛋白保守結(jié)構(gòu)域Fig.6 Conserved domain of PPM1D protein

圖7 PPM1D三維結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.7 Three dimensional structure prediction of PPM1D

2.5 PPM1D蛋白質(zhì)相互作用分析

利用STRING數(shù)據(jù)庫搜索與PPM1D相互作用的蛋白質(zhì)信息，設(shè)置為高置信度0.7，數(shù)量限制在10個(gè)以內(nèi)，構(gòu)建PPM1D蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)如圖8所示。與PPM1D相互作用的蛋白主要有TP53、ATM(ataxia telangiectasia mutated)、MDM2(murine double minute 2)、CHEK1(checkpoint kinase 1)、CHEK2(checkpoint kinase 1)、RIPK4(receptor interacting protein kinase 4)和APPBP2(Amyloid beta precursor protein (cytoplasmic tail) binding protein 2)。值得關(guān)注的是，互作蛋白中包括MDM2、RIPK4和APPBP2。

圖8 STRING預(yù)測PPM1D蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig.8 Protein-protein interaction network for PPM1D predicted by STRING

3 討 論

對于腫瘤患者，腫瘤抑制基因p53通常發(fā)生突變或表達(dá)受到抑制，研究者曾一度嘗試通過逆轉(zhuǎn)p53的腫瘤抑制活性進(jìn)行癌癥治療。PPM1D能夠由p53激活表達(dá)，其產(chǎn)物作為一種絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶，是細(xì)胞生長和應(yīng)激反應(yīng)的重要調(diào)控分子，能夠使關(guān)鍵的細(xì)胞周期檢查點(diǎn)蛋白和細(xì)胞損傷修復(fù)相關(guān)蛋白(如：p53、ATM、p38MAPK等)去磷酸化，從而抑制相關(guān)蛋白表達(dá)，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮作用。PPM1D能夠以p53依賴的方式，在電離輻射和紫外線等脅迫環(huán)境下表達(dá)[8]。通過使p38 MAPK第180位蘇氨酸殘基去磷酸化，PPM1D能夠調(diào)節(jié)p38 MAPK信號通路，抑制p38 MAPK的激酶活性和p53的腫瘤抑制活性[9-10]。另外，PPM1D能夠抑制p16INK4A和p19ARF等腫瘤抑制因子的活性[5]，也能夠與RAS、MYC和ERBB2等致癌基因協(xié)同作用[11-12]。由此可知，PPM1D能夠負(fù)反饋調(diào)節(jié)p53，PPM1D受p53激活后，其產(chǎn)物又能使p53去磷酸化，發(fā)揮拮抗作用[9]。在腫瘤組織中，PPM1D通常過量表達(dá)。但是，若PPMD1的3’端編碼區(qū)發(fā)生截短突變，其負(fù)調(diào)控活性會(huì)受到影響[13-14]。

本文通過STRING預(yù)測知PPM1D與MDM2存在相互作用。除PPM1D以外，MDM2也能由p53激活表達(dá)，作為一種負(fù)調(diào)控因子的MDM2是一種E3泛素連接酶，能夠?qū)е聀53泛素化，蛋白酶體發(fā)生降解[15-16]。在多種惡性腫瘤中都發(fā)現(xiàn)MDM2過量表達(dá)。Sriraman等[17]認(rèn)為MDM2和PPM1D擁有不同的拮抗機(jī)制，單獨(dú)靶向其一都不足以完全激活p53。研究發(fā)現(xiàn)，同時(shí)使用這兩種分子各自的靶向藥物(Nutlin-3a和GSK2830371)處理腫瘤細(xì)胞，能夠顯著增強(qiáng)p53活性，抑制或阻滯腫瘤進(jìn)程。目前，聯(lián)合用藥已成為腫瘤藥物治療的研究熱點(diǎn)。若兩種或藥物協(xié)同作用，使用聯(lián)合治療法能夠增強(qiáng)療效，降低每種藥物的副作用。針對PPM1D與MDM2聯(lián)合用藥的顯著療效，有望為下一步開發(fā)聯(lián)合用藥策略提供思路。

STRING預(yù)測知APPBP2能夠與PPM1D相互作用。Hirasawa等[18]發(fā)現(xiàn)APPBP2和PPM1D在卵巢透明細(xì)胞癌中都過量表達(dá)，可作為潛在靶點(diǎn)和預(yù)后標(biāo)志物。因此，PPM1D與相互作用蛋白之間的關(guān)系及參與的具體生理生化過程具有一定的研究價(jià)值，有助于闡明PPM1D的作用機(jī)制和生理功能。

4 結(jié) 論

1)PPM1D的理論分子量為66.6751 kDa，理論等電點(diǎn)為9.14，預(yù)測為堿性蛋白質(zhì)。不穩(wěn)定系數(shù)為56.41，預(yù)測為不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。脂肪系數(shù)為72.99，總平均親水性為-0.517，預(yù)測為親水蛋白質(zhì)。

2)PPM1D的二級結(jié)構(gòu)主要為隨機(jī)卷曲，屬于PP2C超家族，含有一個(gè)PP2Cc結(jié)構(gòu)域。無信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域，含有磷酸化、乙?；?、甲基化和泛素化修飾位點(diǎn)。該蛋白表達(dá)的組織特異性不強(qiáng)，定位于細(xì)胞核的可能性較大。系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，人PPM1D蛋白與哺乳動(dòng)物(如：黑猩猩、獼猴)序列相似性較大，組成一支，而與兩棲類和魚類(如：非洲爪蟾、斑馬魚)的序列相似性較小，該蛋白的同源性與物種間親緣關(guān)系呈正相關(guān)。與PPM1D相互作用的蛋白主要是細(xì)胞周期檢查點(diǎn)蛋白(如：CHEK1、CHEK2)和細(xì)胞損傷修復(fù)相關(guān)蛋白(如：p53、ATM、p38MAPK)。

3)本文通過生物信息學(xué)方法，構(gòu)建PPM1D的系統(tǒng)進(jìn)化樹，分析PPM1D蛋白的理化性質(zhì)、組織特異性、亞細(xì)胞定位、結(jié)構(gòu)域及相互作用蛋白質(zhì)，為全面認(rèn)識PPM1D，研究其功能及參與的具體信號通路提供一定的參考。

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