張 瑜，孫兆貴

(1.復旦大學 上海醫(yī)學院, 上海 200032；2.國家人口和計劃生育委員會計劃生育藥具重點實驗室(上海市計劃生育科學研究所)，上海 200032)

各類蛋白參與構成真核生物細胞結構，其產生與降解都受到精確調控。在多種蛋白質降解途徑中，泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin proteasome system, UPS)可降解真核細胞內變異、錯誤折疊以及異常聚集的蛋白，該系統(tǒng)介導的蛋白降解是一種動態(tài)可逆的蛋白翻譯后調控過程，此過程由多種泛素化酶以及去泛素化酶進行精細調控。各種泛素化酶催化泛素分子與靶蛋白結合，使靶蛋白被蛋白酶體識別而降解；而去泛素化酶正好相反，它們使泛素分子與靶蛋白解離，阻止蛋白被降解。在去泛素化酶家族中有一類重要的水解酶家族——泛素羧基末端水解酶家族(ubiquitin C-terminal hydrolases, UCH)，它們主要是將泛素羧基末端連接的分子水解下來。目前研究較多的是泛素羧基末端水解酶1(UCHL1)。

研究發(fā)現(xiàn)UCHL1蛋白特異性高表達于腦[1]與生殖細胞[2]，與神經退行性疾病[3]和生殖細胞的發(fā)育有關。泛素化蛋白的積聚是一系列神經退行性疾病的普遍標志，在阿爾茨海默病患者中淀粉樣蛋白-(amyloid-beta, Aβ)蛋白積聚促進靶蛋白氧化，研究發(fā)現(xiàn)UCHL1蛋白也是氧化應激反應的一個底物，UCHL1蛋白被氧化后失去功能，導致UPS過程中的靶蛋白不能與泛素分子分離，進而導致神經元泛素化/去泛素化機制失調，Aβ等蛋白積累，最終引起神經元退化[4]。此外，UCHL1也參與精子發(fā)生[5]、卵母細胞的成熟[6-9]以及受精[10-12]等過程。研究發(fā)現(xiàn)25周雄性UCHL1基因缺陷型gad(-/-)小鼠生精小管萎縮，生精干細胞增殖減少[13]；雌性gad(-/-)小鼠具有多精入卵的現(xiàn)象[11-12]，本文也發(fā)現(xiàn)UCHL1敲除的小鼠成熟卵母細胞數(shù)相對野生型降低，且排卵障礙。另外，UCHL1在卵母細胞減數(shù)分裂過程中發(fā)揮一定作用：抑制UCHL1表達后，豬卵母細胞停滯在第1次減數(shù)分裂中后期過渡點，進而影響卵母細胞的正常形成[14]。這一系列現(xiàn)象都說明UCHL1缺失影響生殖細胞的正常發(fā)育。另外，UCHL1的表達與腫瘤的發(fā)生也具有一定的聯(lián)系，UCHL1蛋白在腦[15]、肺[16]、腎[17]、結腸[18]、膀胱[19]、前列腺[20]等腫瘤組織中過表達，在卵巢癌中表達量減少[21]。

迄今為止UCHL1在神經與腫瘤方面的研究比較多，在生殖領域文獻較少，且研究對象主要集中在人、小鼠、大鼠，而對其他物種的研究較少。本文采用生物信息學手段，通過分析脊椎動物中各物種的UCHL1基因與蛋白序列，了解UCHL1基因的進化特點，預測UCHL1蛋白去泛素化功能在脊椎動物中是否普遍存在，以及其是否還具有其他功能，最終也為研究該基因參與生殖細胞發(fā)生的作用機理提供資料與新的思路。

1 數(shù)據的獲取

在NCBI的GENE庫中輸入“UCHL1”搜索得到304種生物的基因序列，點擊進入人的UCHL1基因相關信息，在“General gene information”部分可看到共有206種生物與人UCHL1基因直系同源，這些物種全部屬于脊椎動物(見表1)。挑選分別代表哺乳類、鳥類、魚類、爬行類、兩棲類這5類生物中的人(homo sapiens)、小鼠(mus musculus)、大鼠(rattus norvegicus)、馬(equus caballus)、獼猴(macaca mulatta)、雞(gallus gallus)、斑胸草雀(taeniopygia guttata)、斑馬魚(danio rerio)、綠海龜(chelonia mydas)、安樂蜥(anolis carolinensis)、非洲爪蟾(xenopus tropicalis)11個物種進行UCHL1基因分析。

表1脊椎動物中與人UCHL1直系同源的物種數(shù)

Table1ThenumberoforthologousspeciesofhumanUCHL1invertebrates

中文名英文名物種數(shù)哺乳類mammals99鳥類birds58硬骨魚類bonyfishes34蜥蜴類lizard4龜類turtles3兩棲類amphibians2鱷類crocodylia4軟骨魚類cartilaginousfishes1腔棘魚類coelacanths1

2 UCHL1基因特點分析

核酸序列分析表明UCHL1基因序列長度變化(見表2)， 除斑馬魚、雞、斑胸草雀外，其他物種的基因長度大約都在11 000 bp左右，外顯子個數(shù)基本集中在9個左右，mRNA長度基本集中在1 100 bp左右， UCHL1蛋白序列的平均長度為223 aa。這說明UCHL1在漫長的進化過程中，雖然不同生物所處的環(huán)境不同，但編碼序列比較保守，從魚類到哺乳類的變化都較小，這種進化的保守性說明這些編碼基因對于蛋白自身功能是非常重要的，無論外界環(huán)境如何變化或受到何種刺激，它們在生物進化的過程中不會輕易改變。相對于外顯子，大部分內含子不含有功能原件，所承受的選擇壓力相對較小，其變異要遠多于外顯子。分析顯示，雞、斑胸草雀、斑馬魚的基因序列長度要遠小于其他8種生物，所以又查詢了鳥類與魚類中的幾種生物，如：鵪鶉(coturnix japonica)的UCHL1基因序列長度為4 373 bp，大山雀(parus major)為5 063 bp，家鴿(columba livia)為4 546 bp，白尾鹲(phaethon lepturus)為4 509 bp，斑鼠鳥(speckled mousebird)為4 396 bp,這些生物的基因長度大約在4 000～5 000 bp；斑點叉尾鮰(ictalurus punctatus)的UCHL1基因序列長度為4 054 bp，羊頭魚(sheepshead minnow)為4 751 bp，珍珠瑪麗魚(sailfin molly)為4 274 bp，半滑舌鰨(cynoglossus semilaevis)為3 884 bp，紅鰭東方鲀(takifugu rubripes)為3 223 bp，這些生物的基因長度約在3 000～5 000 bp，也就是大部分魚類和鳥類的UCHL1基因序列長度要比人等其他生物的短。進一步將雞、斑胸草雀、斑馬魚這3種生物的外顯子和內含子與人類進行對比發(fā)現(xiàn)，除斑胸草雀外顯子長度變化較大外，其他3種生物外顯子長度變化非常小，而4種生物的內含子長度變化非常大如圖1所示。這提示對內含子進行研究可能有助于了解UCHL1對環(huán)境的適應變化。

表2 UCHL1基因特點分析Table 2 Gene characteristic analysis of UCHL1

圖1 人、斑馬魚、雞、斑胸草雀的外顯子、內含子長度對比Fig.1 Comparison of exons and introns length in Homo sapiens, Danio rerio, Gallus gallus and Taeniopygia guttata

3 UCHL1蛋白序列同源性分析

用EMBL-EBI中的Clustal Omega程序對11種生物UCHL1基因編碼的氨基酸序列進行保守性分析如圖2所示，另外再用NCBI中的Blast程序對每兩個物種的氨基酸序列進行同源性對比，發(fā)現(xiàn)11個物種之間的同源性都在60%以上(未展示數(shù)據), 說明UCHL1氨基酸序列在進化上也是高度保守的。本文以人的UCHL1氨基酸序列為基礎，通過UniProt數(shù)據庫中的子數(shù)據庫UniProtKB查詢UCHL1蛋白的相關信息，人的UCHL1蛋白由223個氨基酸分子構成，據文獻報道[22]第5～10個氨基酸區(qū)域——PMEINP(脯氨酸、甲硫氨酸、谷氨酸、異亮氨酸、天冬氨酸、脯氨酸)以及第211～216個氨基酸區(qū)域——EVRFSA(谷氨酸、纈氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸、丙氨酸)是與泛素分子相互作用的部位；第90個氨基酸C(半胱氨酸)是該蛋白的親核位點；第161個氨基酸H(組氨酸)是該蛋白的質子供體；第176位氨基酸D(天冬氨酸)對酶活性具有重要作用[23]。根據序列同源性對比，本文發(fā)現(xiàn)除了非洲爪蟾、綠海龜之外，其余9種生物都具有PMEINP區(qū)域，另外這11種生物都具有EVRFSA區(qū)域，說明這兩個區(qū)域的序列在進化上高度保守，是與泛素分子相互作用所必需的。C90、H161、D176這3個氨基酸在11種生物中也都高度保守。

除此之外，UCHL1蛋白C末端的第220位氨基酸被認為是UCHL1向膜定位的一個關鍵氨基酸。據文獻報道[24]UCHL1在神經元中分為兩種形式：可溶性細胞質蛋白和膜關聯(lián)蛋白，C末端發(fā)生法尼基化促進UCHL1向膜定位，使膜關聯(lián)蛋白比例增多，進而導致α-突觸核蛋白積聚，產生細胞毒性。但另外也有文獻[25]反對該觀點，認為C末端的法尼基化與UCHL1的膜定位無關，該文獻發(fā)現(xiàn)用法尼基化抑制劑或是使C220殘基突變都沒有降低膜關聯(lián)UCHL1蛋白的含量，反而是C末端220-223位氨基酸(CKAA)缺失導致蛋白可溶性喪失，也使UCHL1喪失與底物結合的能力，增加了神經元細胞的死亡。盡管這兩個實驗結果仍值得進一步的重復與探討，但它們都表明C末端的氨基酸在神經元細胞正常生存過程中發(fā)揮著重要作用。通過序列同源對比分析，除了安樂蜥與非洲爪蟾外，UCHL1蛋白序列第220位氨基酸都是半胱氨酸，這提示本文該位點在進化過程中具有高度保守性，其相關功能值得進一步分析。另外安樂蜥與非洲爪蟾第220位氨基酸是絲氨酸，該位點的突變是否會造成神經元細胞損傷也需要進一步的研究。

圖2 UCHL1氨基酸序列保守區(qū)域分析Fig.2 Conservative region analysis of amino acid sequences

注：下劃線部分表示UCHL1發(fā)揮作用所需要的活性位點和區(qū)域；星號表示同源性較高的氨基酸。

4 UCHL1基因的分子進化樹

通過氨基酸序列同源性對比獲得這11種生物的分子進化樹如圖3所示。進化樹可分為5組：第1組包括斑馬魚(danio rerio)和非洲爪蟾(xenopus tropicalis)；第2組包括綠海龜(chelonia mydas)和安樂蜥(anolis carolinensis)；第3組包括雞(gallus gallus)和斑胸草雀(taeniopygia guttata)；第4組包括小鼠(mus musculus)、大鼠(rattus norvegicus)和馬(equus caballus)；第5組包括人(homo sapiens)、獼猴(macaca mulatta)。該分子進化趨勢與物種進化趨勢一致。

圖3 UCHL1基因系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of UCHL1

5 人類UCHL1蛋白二級結構分析

在UniProt數(shù)據庫的子數(shù)據庫UniProtKB中查詢UCHL1(Homo Sapiens)蛋白的結構信息，在“3D structure databases”部分得到該蛋白在PDBe數(shù)據庫中的編號2ETL。UCHL1蛋白由223個氨基酸分子組成，其二級結構包括7個α-螺旋，6個β-折疊，22個β-轉角，3個γ-轉角。其中C90位于第3個α-螺旋，H161位于第3個β-折疊，D176位于第18個β-轉角(如圖4、5所示)，這3個元素形成一個三角形的排列，并產生疏水性接觸。UCHL1蛋白與底物結合時，其空間構象發(fā)生改變，氫鍵斷裂使活性位點暴露而產生水解酶活性，底物被釋放時又恢復無活性的狀態(tài)[26]，據文獻報道[26]UCHL1蛋白中I93M突變可能是造成帕金森綜合征的原因之一，該位點位于第3個α-螺旋的位置，也是C90所在的位置，I93M突變可能會導致C90、H161、D176三角構型改變，進而改變活性中心結構而影響UCHL1的功能。另外有研究推測S18Y多態(tài)性變異可抑制帕金森綜合征，這種變異提高了神經細胞抗氧化能力，保護其免受氧化傷害[27]。S18位于第1個-螺旋，由于位于該位置的氨基酸類型在物種中比較多變，從結構角度無法判斷S18Y多態(tài)性變異如何降低帕金森綜合征的易感性[26]。

圖4 人類UCHL1二級結構平面圖Fig.4 Secondary structure ichnography of human UCHL1

注:圖中紅色條帶表示已知的突變，綠色條帶表示UCHL1活性位點。

圖5 人類UCHL1二級結構立體圖Fig.5 Secondary structure graphic model of human UCHL1

注:由黑色虛線構成的三角形為UCHL1活性區(qū)域。

6 結 論

1)通過NCBI數(shù)據庫中Gene、Protein等子數(shù)據庫分析UCHL1在不同生物中的基因與蛋白特征，發(fā)現(xiàn)UCHL1在進化中具有高度保守性，其細微差異體現(xiàn)的分子進化趨勢與物種進化趨勢完全一致。首先UCHL1基因組長度在進化過程中變化較大，外顯子個數(shù)變化較小，內含子方面變異較大，氨基酸的個數(shù)基本維持在223個左右，這說明該蛋白具有的功能對生物自身的生存是非常重要的，即UCHL1通過其水解作用自靶蛋白解離泛素分子以維持蛋白降解平衡。其次，不同生物的UCHL1蛋白序列同源性也很高，一般在60%以上，與UCHL1功能相關的序列區(qū)域和位點在不同生物中也都高度保守。若這些位點或區(qū)域氨基酸發(fā)生突變，蛋白功能受損，將會影響生物體機能的正常運行。目前為止只有人類的UCHL1二級結構得到了精確分析，通過上述同源性比較，預測其中的某些結構區(qū)域在不同生物中也可能是高度保守的，比如C90、H161、D176所形成的三角疏水區(qū)域等。

2)通過上述進化分析，本文預測UCHL1的去泛素化功能在脊椎動物中是普遍存在的，可以根據UCHL1在人體中的組織特異性分布去推測其在其他生物體內的分布，使用身體構造更加簡單的模式動物，通過各種基因編輯方法研究該基因在某些組織中是否發(fā)揮相應的功能。例如：UCHL1發(fā)揮水解作用的位點在物種進化中存在高度保守性，可嘗試對這些位點進行點突變，或敲除相應的基因序列使其無法編碼功能氨基酸位點，或者表達一種配體蛋白與UCHL1蛋白結合使其構象改變而不能發(fā)揮水解作用等。

3)UCHL1除了去泛素化酶作用，以二聚體形式存在時會發(fā)揮泛素連接酶的作用，但關于該作用的研究相對較少，有文獻曾經報道[28]UCHL1以二聚體形式存在時會導致聚泛素化的-突觸核蛋白(-synuclein)的積聚，進而導致神經元受損。根據以上進化信息，該連接酶作用可能在各種生物中普遍存在，值得進一步研究。

4)綜上所述，進化上的高度保守性表明，UCHL1雖然僅僅在大腦和生殖腺特異性高表達，但它是一種生物體發(fā)揮正常機能所必需的基因。不論是神經疾病還是生殖疾病方面，該基因的功能得到肯定，而在作用機制研究方面卻停滯不前。另外，無論是其去泛素化酶作用還是泛素連接酶作用，還需要研究者們通過更多的實驗來探索與證實。隨著基因工程技術的突破性進展，預期對UCHL1基因的研究會有質的突破。

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