高 波，王 偉，錢 躍，陳 才，鐘繼漢，沈 丹，陳 偉，宋成義

(揚(yáng)州大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009)

轉(zhuǎn)座子是染色體上可移位和自主復(fù)制的基本單位，其本質(zhì)是具有不同結(jié)構(gòu)和換位機(jī)制的移動(dòng)序列[1]。轉(zhuǎn)座子從原位點(diǎn)上單獨(dú)復(fù)制或斷裂下來(lái)，環(huán)化后插入到另一個(gè)位點(diǎn)，就像從基因組的一個(gè)位置“跳躍”到另一個(gè)位置，此基因切割整合的過(guò)程稱為轉(zhuǎn)座[2]。轉(zhuǎn)座子依據(jù)轉(zhuǎn)座機(jī)制的不同，可以分為：反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子(I類轉(zhuǎn)座子)和DNA轉(zhuǎn)座子(II類轉(zhuǎn)座子)[3]。反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子通過(guò)自身編碼的逆轉(zhuǎn)錄酶使用“copy-and-paste”機(jī)制實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)座，DNA轉(zhuǎn)座子則通過(guò)自身編碼的轉(zhuǎn)座酶使用“cut-and-paste”轉(zhuǎn)座機(jī)制[4]。

轉(zhuǎn)座子被發(fā)現(xiàn)于20世紀(jì)50年代，一直被視為“垃圾序列”、假基因[5]，然而近幾十年研究已經(jīng)證明，轉(zhuǎn)座子在基因組進(jìn)化、基因結(jié)構(gòu)、染色體重組及基因活性的調(diào)節(jié)等很多領(lǐng)域都有著不可忽視的作用[6]。例如，轉(zhuǎn)座子插入U(xiǎn)TR和CDS區(qū)域可抑制或提前終止基因表達(dá)[7]、插入基因內(nèi)部影響啟動(dòng)子功能實(shí)施[8]、或成為某些表觀調(diào)控的靶位點(diǎn)[9]。而且，轉(zhuǎn)座子可以在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)，有研究表明帶有多聚腺苷酸信號(hào)的轉(zhuǎn)座子基因插入3’端非編碼區(qū)導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄的終止[10]，帶有microRNA的結(jié)合位點(diǎn)的轉(zhuǎn)座子插入到基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中導(dǎo)致基因表達(dá)沉默等[11]。

真核生物基因組測(cè)序計(jì)劃揭示了較大基因組中轉(zhuǎn)座子序列令人震驚的豐富度，幾乎存在于所有生物體基因組，并在真核生物基因組中占據(jù)重要組成部分，尤其是脊椎動(dòng)物，如人類基因組由總數(shù)3.2×109bp的DNA序列構(gòu)成，其中約50%為各種轉(zhuǎn)座子，但大多在進(jìn)化過(guò)程中失活。目前轉(zhuǎn)座子在轉(zhuǎn)基因上的應(yīng)用研究報(bào)道較多[12-13]，但對(duì)轉(zhuǎn)座子在宿主中的功能了解較少，有研究表明轉(zhuǎn)座子可能與衰老、腫瘤和大腦功能有關(guān)[14-16]，眾多學(xué)者也推測(cè)轉(zhuǎn)座子可能在胚胎發(fā)育中發(fā)揮重要作用，但尚缺乏足夠的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，目前對(duì)各類轉(zhuǎn)座子在早期胚胎中的表達(dá)特性和功能知之甚少。本文在生物信息學(xué)分析基礎(chǔ)上，選擇9個(gè)具有代表性DNA轉(zhuǎn)座子和RNA轉(zhuǎn)座子成員，這些轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)完整，可能具有轉(zhuǎn)座活性，利用qPCR技術(shù)研究其在早期胚胎和成年組織中的時(shí)空表達(dá)，全面系統(tǒng)揭示其表達(dá)特性，為理解和認(rèn)識(shí)其功能及后續(xù)的深入研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

熒光定量PCR試劑盒FastFire qPCR PreMix(SYBR Green)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒FastQuant RT Kit (With gDNase)購(gòu)自天根生化有限公司；組織總RNA提取試劑TRIzol 購(gòu)自Invitrogen；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)。斑馬魚(yú)(danio rerio)為 Tuebingen品系，購(gòu)自國(guó)家斑馬魚(yú)資源中心，飼養(yǎng)條件為每天光照14 h，黑暗10 h，溫度為27～28 ℃。

1.2 方法

1.2.1 活性轉(zhuǎn)座子數(shù)據(jù)來(lái)源

本文所用的9種轉(zhuǎn)座子來(lái)源于前期對(duì)斑馬魚(yú)轉(zhuǎn)座子注釋結(jié)果[17]，主要通過(guò)MGEScan-nonLTR獲得L1和L2序列，通過(guò)LTRHarvest獲得ERV序列，Repbase數(shù)據(jù)中Tc1轉(zhuǎn)座酶序列進(jìn)行TBLASTN獲得Tc1轉(zhuǎn)座子超家族。其中Tc1-a、 Tc1-b、Tc1-c、Tc1-d、Tc1-e為DNA轉(zhuǎn)座子中Tc1/Mariner超家族成員，而ERV-1和ERV-2是逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)座子，L1-323和L2-21為非長(zhǎng)末端重復(fù)序列逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子(non-LTR)，ERV-1、ERV-2、L1-323和L2-21均為RNA轉(zhuǎn)座子。

1.2.2 胚胎收集

選用6～10月齡Tuebingen品系的成年斑馬魚(yú)，于收卵前一天晚上，將雌魚(yú)和雄魚(yú)按1：2的比例置于繁殖盒，并用隔板隔開(kāi)。第2天拿開(kāi)隔板，公母魚(yú)追逐產(chǎn)卵，從產(chǎn)卵開(kāi)始計(jì)時(shí)，約10～15 min后收卵，置于50 mm培養(yǎng)皿，倒入E3培養(yǎng)液，放入28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵化，分別收集8個(gè)發(fā)育階段胚胎，包括0.75(卵裂期)、2.00 (卵裂期/64-細(xì)胞)、3.00(囊胚期)、6.00(原腸期)、12.00(體節(jié)期/5-體節(jié))、15.00(14-體節(jié))、24.00(咽囊期)、48.00 h(孵化期)。收集各發(fā)育階段胚胎適量，同一時(shí)間段至少收集3個(gè)平行樣，置于1.5 ml的無(wú)核酸酶的離心管中，液氮速凍后，再放入-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 成魚(yú)組織器官收集

用大頭針?lè)謩e固定斑馬魚(yú)的頭部和尾部，用解剖剪去除從泄殖腔到鰓蓋下緣一側(cè)，暴露內(nèi)臟器官，收集心臟、肝臟、睪丸、卵巢、肌肉、大腦等主要臟器，每種臟器至少收集3個(gè)平行樣，置于1.5 ml的無(wú)核酸酶的離心管中，液氮速凍后，再放入-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 RNA提取

用Trizol法提取胚胎和組織總RNA，具體方法參照試劑使用說(shuō)明。將獲得的總RNA跑瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量，并用微量核酸濃度測(cè)定儀測(cè)定RNA體積分?jǐn)?shù)和純度，質(zhì)量合格者-70 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA

逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，主要包括兩步：先用DNase處理總RNA，去除污染的基因組，再用逆轉(zhuǎn)錄酶合成用于熒光定量實(shí)驗(yàn)的cDNA第一鏈。逆轉(zhuǎn)錄體系包括1 μg總RNA，2 μL 5×gDNA Buffer，2 μL 10×Fast RT Buffer，1 μL RT Enzyme Mix，2 μL FQ-RT Primer Mix，RNase-Free ddH2O補(bǔ)足至20 μL。先42 ℃孵育15 min，再95 ℃孵育3 min，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)

根據(jù)斑馬魚(yú)9個(gè)轉(zhuǎn)座子編碼框序列，用Primer5設(shè)計(jì)9對(duì)qPCR引物，并以斑馬魚(yú)延伸因子EF-1作為內(nèi)參基因，引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成，具體序列見(jiàn)表1。qPCR反應(yīng)體系包括：cDNA第一鏈1μL，2×SuperReal PreMix Plus10 μL，正反向引物(10 μmol/L)各0.6 μl，RNase-Free H2O補(bǔ)足至20 μL。使用Roche熒光定量PCR儀進(jìn)行，先95 ℃預(yù)變性15 min，再進(jìn)行40個(gè)循環(huán)：95 ℃10 s，60 ℃20 s，72 ℃20 s，最后72 ℃10 min。每個(gè)發(fā)育階段或每個(gè)組織器官設(shè)3個(gè)平行樣本，每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用2-ΔΔCt方法對(duì)qPCR結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)表示，使用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理和分析，表達(dá)差異用單因素方差分析，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)座子在斑馬魚(yú)胚胎不同發(fā)育階段表達(dá)水平

通過(guò)qPCR法檢測(cè)了9種轉(zhuǎn)座子在斑馬魚(yú)胚胎7個(gè)發(fā)育階段相對(duì)表達(dá)水平，結(jié)果如圖1、2所示，DNA轉(zhuǎn)座子從6.00 h階段開(kāi)始表達(dá)，呈現(xiàn)先下降再上升或逐漸上升的表達(dá)趨勢(shì)。 反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子啟動(dòng)表達(dá)時(shí)間不一致，其中ERV-1和L2-21在3.00 h階段，L1-323在6.00 h，ERV-2在15.00 h階段。而且3個(gè)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在24.00 h時(shí)期表達(dá)水平顯著上升。

表1 目的基因和內(nèi)參基因引物序列Table 1 Primer sequences of targeted gene and reference gene

圖1 DNA轉(zhuǎn)座子在斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育節(jié)點(diǎn)表達(dá)水平檢測(cè)Fig.1 Expression level of DNA transposons at development nodes of zebrafish 注：不同字母表示差異顯著(P<0.05)

2.2 轉(zhuǎn)座子在成年斑馬魚(yú)各組織表達(dá)水平

提取成年斑馬魚(yú)心臟、大腦、肝臟、肌肉、睪丸、卵巢等組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此cDNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR，檢測(cè)各組織轉(zhuǎn)座子表達(dá)水平。結(jié)果如圖3、4所示，DNA和RNA轉(zhuǎn)座子在大腦和心臟的表達(dá)水平顯著高于其他組織；卵巢和肝臟的轉(zhuǎn)座子表達(dá)水平高于肌肉和睪丸；睪丸組織轉(zhuǎn)座子表達(dá)水平最低。

圖2 反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育節(jié)點(diǎn)表達(dá)水平檢測(cè)Fig.2 Expression level of retotransposons at development nodes of zebrafish

注：不同字母表示差異顯著(P<0.05)

圖3 斑馬魚(yú)不同組織DNA轉(zhuǎn)座子表達(dá)水平比較Fig.3 Expression level of DNA transposons in different tissues of zebrafish

注：不同字母表示差異顯著(P<0.05)

圖4 斑馬魚(yú)不同組織反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子表達(dá)水平比較Fig.4 Expression level of retrotransposons in different tissues of zebrafish

注：不同字母表示差異顯著(P<0.05)

3 討 論

轉(zhuǎn)座子在動(dòng)物基因組中占很大比例，占斑馬魚(yú)基因組54.96%。當(dāng)轉(zhuǎn)座元件入侵一個(gè)新的基因組后，增加了拷貝數(shù)，同時(shí)也積累了突變，最終導(dǎo)致失活的拷貝。由于轉(zhuǎn)座子可能對(duì)基因組產(chǎn)生不利影響，宿主采用各種機(jī)制沉默活性轉(zhuǎn)座子，如siRNAs和piRNAs，后者通常來(lái)源于轉(zhuǎn)座子元件，可在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平阻斷轉(zhuǎn)座子表達(dá)[18-19]。轉(zhuǎn)座子一直被認(rèn)為是“垃圾”DNA，沒(méi)有明確的功能。但近年來(lái)研究表明，轉(zhuǎn)座子可被調(diào)控和定位表達(dá)。例如，在果蠅和小鼠胚胎檢測(cè)到反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子家族表達(dá)[20-21]。在熱帶爪蟾早期發(fā)育階段，來(lái)自Tc1家族的一個(gè)DNA轉(zhuǎn)座子在背部區(qū)域特異表達(dá)，這個(gè)區(qū)域最終形成神經(jīng)系統(tǒng)[22]，提示這些轉(zhuǎn)座子可能在早期胚胎發(fā)育階段具有生物功能。本文前期通過(guò)生物信息學(xué)分析，獲得斑馬魚(yú)9個(gè)疑似活性轉(zhuǎn)座子，qPCR檢測(cè)結(jié)果表明，在斑馬魚(yú)早期發(fā)育階段及成魚(yú)各主要臟器，無(wú)論是DNA轉(zhuǎn)座子還是反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子均有表達(dá)活性，并具有時(shí)空特異性，在胚胎2 h及之前時(shí)期，9個(gè)轉(zhuǎn)座子均無(wú)表達(dá)，3 h及之后幾個(gè)階段，轉(zhuǎn)座子均出現(xiàn)表達(dá)活性，且不同轉(zhuǎn)座子活性差異較大。轉(zhuǎn)座子在成年魚(yú)主要臟器也有表達(dá)活性，不同組織間差異顯著。上述結(jié)果提示轉(zhuǎn)座子的表達(dá)元件可能與胚胎發(fā)育和組織功能調(diào)控有關(guān)。

轉(zhuǎn)座子發(fā)生轉(zhuǎn)錄的功能之一可能是產(chǎn)生非編碼RNAs，如非洲爪蟾Tc1-2_Xt[22]。本文中9種轉(zhuǎn)座子均發(fā)生轉(zhuǎn)錄，其中斑馬魚(yú)Tc1-a、 Tc1-b、Tc1-c、Tc1-d、Tc1-e和非洲爪蟾的Tc1-2_Xt均為DNA轉(zhuǎn)座子中Tc1/Mariner超家族成員，均在早期胚胎中表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)這些Tc1/Mariner超家族成員可能參與早期胚胎發(fā)育調(diào)控。另外，本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明大腦和心臟中的表達(dá)水平顯著高于其他4個(gè)組織，提示轉(zhuǎn)座子在大腦和心臟組織中可能起重要生物學(xué)功能，Upton等[23]研究中也發(fā)現(xiàn)L1可能與腦細(xì)胞功能有關(guān)，在部分腦細(xì)胞表達(dá)和轉(zhuǎn)座活性明顯高于一切周圍其他細(xì)胞，進(jìn)一步證實(shí)L1可能在腦功能調(diào)控中發(fā)揮作用。本文發(fā)現(xiàn)大多轉(zhuǎn)座子在睪丸組織中表達(dá)水平低，可能有利于保持遺傳的穩(wěn)定性。本文9種轉(zhuǎn)座子均具有完整的轉(zhuǎn)座酶編碼序列，雖然本實(shí)驗(yàn)不能確定能否表達(dá)出活性轉(zhuǎn)座酶，但在此基礎(chǔ)上，本文將克隆并構(gòu)建轉(zhuǎn)座酶表達(dá)載體，進(jìn)一步驗(yàn)證是否具有轉(zhuǎn)座活性。

研究結(jié)果表明，在斑馬魚(yú)早期胚胎發(fā)育階段，DNA轉(zhuǎn)座子和RNA反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子表達(dá)水平和表達(dá)趨勢(shì)呈現(xiàn)出明顯的差異。提示兩類轉(zhuǎn)座子發(fā)揮生物功能的機(jī)制可能不同。部分反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子表達(dá)啟動(dòng)時(shí)間早于DNA轉(zhuǎn)座子，但兩者在胚胎2 h前均檢測(cè)不出表達(dá)活性，說(shuō)明早期胚胎母源mRNAs中無(wú)轉(zhuǎn)座子或比例很低，轉(zhuǎn)座子的表達(dá)可能對(duì)合子發(fā)育具有調(diào)控作用。

4 結(jié) 論

1)9種轉(zhuǎn)座子在斑馬魚(yú)胚胎早期不同階段具有轉(zhuǎn)錄活性，其中5個(gè)DNA轉(zhuǎn)座子從6 h階段開(kāi)始表達(dá)，總體呈現(xiàn)先下降再上升表達(dá)趨勢(shì)；4個(gè)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子表達(dá)起始時(shí)間存在不一致性，最早為3 h，總體呈現(xiàn)持續(xù)上升表達(dá)趨勢(shì)。

2)9種轉(zhuǎn)座子在成年魚(yú)大腦、心臟、卵巢、肝臟、肌肉和睪丸均有轉(zhuǎn)錄活性，其中心臟和大腦的表達(dá)水平顯著高于其他4種組織，為研究轉(zhuǎn)座子功能提供重要參考。

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