吳皓 陶永

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院耳科學(xué)研究所上海市耳鼻疾病轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

伴隨著生物科學(xué)日新月異的發(fā)展，耳科學(xué)的基礎(chǔ)研究也有了長足的進(jìn)步。電子顯微鏡技術(shù)的發(fā)展，生物學(xué)已經(jīng)在介觀、微觀領(lǐng)域取得諸多突破，聽覺研究也從毛細(xì)胞延伸到突觸及聽覺中樞；基因編輯技術(shù)的進(jìn)步，內(nèi)耳的基因調(diào)控越來越精準(zhǔn)、高效，耳聾模式動(dòng)物的基因治療有了重大突破；單細(xì)胞圖譜理念的推廣也使聽覺發(fā)育的研究越來越精細(xì)化。近兩年耳科學(xué)主要研究進(jìn)展梳理如下：

1 耳聾機(jī)制研究

后天性聾（噪音性、老年性、免疫性、藥物性等）的發(fā)病率日漸增高，其研究也越來越深入，尤其是后天性聾早期的突觸病變以及免疫性耳聾的研究取得了一定的進(jìn)展。通過突觸退化及內(nèi)耳免疫在耳聾發(fā)病機(jī)制的研究，可以探索耳聾發(fā)生機(jī)制并研發(fā)聽力保護(hù)性治療方案。

1.1 突觸研究

噪音性聾和老年性聾在發(fā)病早期常無法檢測(cè)到聽閾的上移和螺旋神經(jīng)節(jié)的凋亡，但近年來的深入研究表明聽力下降早期即有突觸的退化，稱為“隱性聽力下降”。耳蝸突觸退化是造成“隱性聽力損失”的主要原因，是噪音性聾和老年性聾的早期病理改變之一，也是噪音背景下言語識(shí)別率低的主要原因。螺旋神經(jīng)節(jié)與毛細(xì)胞之間突觸的消失早于毛細(xì)胞的凋亡，突觸的缺失并不影響聽性腦干誘發(fā)電位(ABR)的閾值，只能通過高分辨率的共聚焦顯微鏡檢測(cè)。

噪音暴露后突觸廣泛的消失而不伴毛細(xì)胞明顯凋亡的現(xiàn)象廣泛存在于小鼠、大鼠、豚鼠、沙鼠和猴子。由于內(nèi)毛和外毛細(xì)胞的突觸前和突觸后表達(dá)的離子通道和輸入電阻的不同，內(nèi)毛和外毛的突觸敏感性有差異[1]。突觸的退化可能和谷氨酸興奮毒性有關(guān)，但具體機(jī)制尚不清楚，也缺乏有效的檢測(cè)方式。激光的瞬時(shí)光波損傷可破壞大鼠外毛細(xì)胞的纖毛，并導(dǎo)致ABR閾值上移，免疫組化結(jié)果表明突觸變少。這種單次高強(qiáng)度的刺激即可導(dǎo)致突觸病變，表明突觸損傷不需要谷氨酸長期刺激突觸后膜[2]。

接受噪音暴露后的豚鼠，其毛細(xì)胞的突觸退化后可有部分恢復(fù)，但是這可能只是突觸連接或受體蛋白的短暫改變所致，不一定是因?yàn)橥挥|再生[3]。小鼠的研究結(jié)果表明隱性聽力損失是可以被部分治療和預(yù)防的[4]。突觸退化的研究不但有助于探明聽力損失的病理機(jī)制，也為聽力保護(hù)的策略研究提供新思路，同時(shí)也有利于研發(fā)更為敏感的聽力檢測(cè)方法。

1.2 內(nèi)耳免疫

自身免疫性內(nèi)耳病是免疫相關(guān)的以膜迷路積水、螺旋神經(jīng)節(jié)變性、炎性滲出和毛細(xì)胞變性為主要表現(xiàn)的疾病。聽覺創(chuàng)傷后對(duì)耳蝸進(jìn)行RNA測(cè)序、基因芯片檢測(cè)和實(shí)時(shí)定量PCR的研究發(fā)現(xiàn)，化學(xué)因子和細(xì)胞因子可以募集免疫細(xì)胞到耳蝸。目前已證實(shí)噪音損傷和耳毒性藥物可誘發(fā)TLR4(Toll like receptor 4)激活、促炎細(xì)胞因子和化學(xué)因子釋放等過程。有報(bào)道顯示毛細(xì)胞受損后CX3CR1+(Chemokine(C-X3-C motif)receptor 1)巨噬細(xì)胞調(diào)節(jié)CD45+細(xì)胞大量釋放[5]。

內(nèi)耳存在免疫自適應(yīng)現(xiàn)象，內(nèi)耳細(xì)胞在免疫應(yīng)答后表型不一的機(jī)制仍待研究。支持細(xì)胞和巨噬細(xì)胞參與了耳毒性過程，但是這些細(xì)胞如何感知耳毒性的發(fā)生？除了傳統(tǒng)的鈣離子信號(hào)通路，ROS和ATP信號(hào)通路也參與了耳毒性過程[6]。另外，CX3CL1/CX3CR1信號(hào)通路介導(dǎo)了毛細(xì)胞損傷后巨噬細(xì)胞對(duì)毛細(xì)胞的保護(hù)作用[7]。對(duì)能遷移進(jìn)入耳蝸的免疫細(xì)胞類型的鑒定，并探明其參與內(nèi)耳免疫應(yīng)答中分泌因子的過程、細(xì)胞中的相互作用，鑒定內(nèi)耳在損傷后免疫應(yīng)答的損傷相關(guān)分子節(jié)律，可為耳毒性和噪音性聾相關(guān)藥物研發(fā)提供靶點(diǎn)[8]。

2 毛細(xì)胞發(fā)育及再生

哺乳動(dòng)物內(nèi)耳毛細(xì)胞不可再生是內(nèi)耳發(fā)育研究及耳聾治療的瓶頸，近年來關(guān)于毛細(xì)胞發(fā)育的基因調(diào)控和毛細(xì)胞再生的探索取得了一定的成果。目前新生小鼠的毛細(xì)胞經(jīng)調(diào)控后可實(shí)現(xiàn)再生，然而成年動(dòng)物耳蝸仍不能實(shí)現(xiàn)毛細(xì)胞再生，是毛細(xì)胞再生領(lǐng)域最大的桎梏。

2.1 毛細(xì)胞發(fā)育

隨著轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制備周期的縮短，利用基因調(diào)控來研究毛細(xì)胞發(fā)育越來越便捷。代表性研究包括在毛細(xì)胞轉(zhuǎn)分化之前敲除Six1(Sine oculis-related homeobox 1)基因可見毛細(xì)胞數(shù)目減少并伴感覺上皮的缺陷，表明轉(zhuǎn)分化過程中的Sox2(SRY(sex determining region Y)-box 2)的下調(diào)依賴于Six1，實(shí)驗(yàn)表明Fgf8(Fibroblast growth factor 8)表達(dá)亦依賴于Six1[9]。Esrp1(Epithelial splicing regulatory protein 1)基因敲除小鼠可表現(xiàn)為耳蝸形態(tài)改變、毛細(xì)胞轉(zhuǎn)分化和細(xì)胞壽命變化，說明Esrp1基因是耳蝸發(fā)育的關(guān)鍵基因之一[10]。小鼠耳蝸條件性敲除Stat3(Signal transducer and activator of transcription 3)基因可以抑制毛細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化，抑制Notch1信號(hào)通路可以促進(jìn)STAT3的磷酸化[11]。Ick(Intestinal cell kinase)基因缺失可導(dǎo)致動(dòng)纖毛I(xiàn)FT（Intraflagellar transport）異位表達(dá)，導(dǎo)致毛細(xì)胞極性的變化，從而影響聽力，證明了纖毛運(yùn)動(dòng)與毛細(xì)胞極性之間的相關(guān)性[12]。支持細(xì)胞敲除Connexin26和Connexin30可阻止內(nèi)毛細(xì)胞的成熟[13]。

2.2 毛細(xì)胞再生研究

Atoh1 是 basic helix-loop-helix(BHLH)家族轉(zhuǎn)錄因子，是毛細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的關(guān)鍵基因。Atoh1在E12.5開始表達(dá)后誘導(dǎo)支持細(xì)胞向毛細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，最近證實(shí)Sox2下調(diào)是Atoh1激活形成毛細(xì)胞的必要條件，可解釋雖然頂圈細(xì)胞更早退出有絲分裂期，但Atoh1的表達(dá)和轉(zhuǎn)分化從底圈開始[14]。

哺乳動(dòng)物內(nèi)耳中具有類似干細(xì)胞性質(zhì)的聽覺祖細(xì)胞，通過分選不同部位Lgr5(Leucine rich repeat containing G protein coupled receptor)陽性和陰性的細(xì)胞后利用RNA-seq對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分析比對(duì)，發(fā)現(xiàn)了一系列與細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)化相關(guān)的分子特異性地在Lgr5陽性的祖細(xì)胞之中表達(dá)并與細(xì)胞的再生能力直接相關(guān)，針對(duì)這些分子進(jìn)行調(diào)控極有可能增強(qiáng)毛細(xì)胞再生。轉(zhuǎn)分化的研究也有不少進(jìn)展：Notch信號(hào)通路中的Hes/Hey轉(zhuǎn)錄因子可以通過結(jié)合Atoh1啟動(dòng)子區(qū)域在發(fā)育過程中調(diào)控細(xì)胞命運(yùn)[15]，通過調(diào)控多個(gè)細(xì)胞命運(yùn)相關(guān)的基因p27,Atoh1,Pou4f3(POU domain,class 4,transcription factor 3)等實(shí)現(xiàn)了在成年動(dòng)物中毛細(xì)胞的功能性再生[15]。表觀遺傳性在毛細(xì)胞再生中的作用取得了一定進(jìn)展，包括組蛋白去甲基化酶LSD1通過與毛細(xì)胞發(fā)育及轉(zhuǎn)分化相關(guān)的H3K4調(diào)控甲基化修飾水平以及相關(guān)基因表達(dá)，為斑馬魚毛細(xì)胞再生所必需[16]。microRNA如mir-183、mir-210的發(fā)現(xiàn)亦為實(shí)現(xiàn)支持細(xì)胞到毛細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化提供了新思路[17,18]。

除了調(diào)控支持細(xì)胞的基因?qū)崿F(xiàn)再生，研究人員也致力于在體外誘導(dǎo)分化出毛細(xì)胞，再使用細(xì)胞治療的方法將新的毛細(xì)胞植入內(nèi)耳完成再生。借助于近年來日趨成熟的類器官培養(yǎng)方法，誘導(dǎo)的人類多能干細(xì)胞可向聽覺細(xì)胞分化并最終獲得了具有電生理功能的毛細(xì)胞[19]。Lgr5陽性聽覺祖細(xì)胞的3D培養(yǎng)體系通過優(yōu)化條件實(shí)現(xiàn)了體外高效率的毛細(xì)胞誘導(dǎo)分化[20]。這些體外誘導(dǎo)技術(shù)能夠高度模擬生理?xiàng)l件下的內(nèi)耳中細(xì)胞復(fù)雜的調(diào)控系統(tǒng)。已有研究利用小鼠胚胎干細(xì)胞3D分化系統(tǒng)揭示了組蛋白抑制性蛋白復(fù)合物對(duì)于聽覺細(xì)胞發(fā)育重要因子Pax2(Paired box gene 2)的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制[21]。

3 聽覺保護(hù)研究

得益于轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)理念的深入，耳聾的研究逐漸從實(shí)驗(yàn)室走向臨床，目前在歐美已經(jīng)有多項(xiàng)耳聾治療的臨床研究。基礎(chǔ)研究-臨床實(shí)驗(yàn)這一模式的成功，既為耳聾的治療提供更多手段，也極大推動(dòng)了耳聾的基礎(chǔ)研究。

3.1 促進(jìn)毛細(xì)胞再生的藥物

已有不少針對(duì)毛細(xì)胞再生從而改善聽力的臨床試驗(yàn)正在開展。其中美國諾華制藥公司自2014年開始的利用腺病毒載體將Atoh1基因?qū)朊月穼?shí)現(xiàn)支持細(xì)胞到毛細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的實(shí)驗(yàn)，目前已處于二期臨床（ClinicalTrials.gov Identifier:NCT02132130）階段。小分子藥物方面，應(yīng)用Notch信號(hào)通路抑制劑LY356480治療感音神經(jīng)性耳聾也已在歐洲進(jìn)入二期臨床（ISRCTN59733689）。美國Frequency Therapeutics的新型轉(zhuǎn)分化藥物FX-322的經(jīng)鼓膜注射方案在澳洲進(jìn)入臨床一期研究(ACTRN12617000704392）。未來幾年可能有更多進(jìn)入臨床的再生藥物。

3.2 保護(hù)性藥物

目前已知的保護(hù)聽力下降的臨床藥物實(shí)驗(yàn)有：JNK激酶抑制劑（鼓室凝膠）、Atoh1轉(zhuǎn)錄因子（迷路注射）、D-蛋氨酸（口服）、N-乙酰半胱氨酸（口服/鼓室給藥）、硫代硫酸鈉（全身給藥）和依布硒啉（口服），均為I-II期臨床實(shí)驗(yàn)。除了Atoh1調(diào)節(jié)毛細(xì)胞再生外，其他藥物皆是通過抑制氧化應(yīng)激來減少噪音或耳毒性藥物對(duì)毛細(xì)胞的損傷。

4 耳聾治療研究

小鼠是研究內(nèi)耳基因治療常用動(dòng)物模型，耳蝸中階、圓窗、卵圓窗是內(nèi)耳基因治療的傳統(tǒng)手術(shù)徑路。近年來利用經(jīng)典的病毒和熱門的CRISPR/Cas9，通過基因替代、基因沉默、基因編輯等方法在內(nèi)耳基因治療上均取得一定進(jìn)展。

4.1 病毒載體

腺病毒在內(nèi)耳轉(zhuǎn)染的研究已有20多年歷史。腺病毒可以轉(zhuǎn)染內(nèi)耳細(xì)胞，但有一定的耳毒性[22]。不同血清型的腺相關(guān)病毒（AAV）可以轉(zhuǎn)染內(nèi)耳不同類型細(xì)胞，通過計(jì)算機(jī)技術(shù)研發(fā)合成的AAV2/Anc80L65可以高效轉(zhuǎn)染耳蝸毛細(xì)胞[23]。除了提高病毒本身的轉(zhuǎn)染效率，亦有研究證實(shí)Exosome可協(xié)助蛋白、核酸進(jìn)入細(xì)胞，并可以提高AAV在內(nèi)耳的轉(zhuǎn)染效率[24]。

隨著病毒效率的提高，利用病毒載體成功治療遺傳性耳聾的報(bào)道有：AAV8-whirlin通過后半規(guī)管注射可以部分恢復(fù)Whirlin-/-小鼠的聽力和前庭功能[25]；Ush1c綜合征表現(xiàn)為先天性耳聾、前庭障礙和色素性視網(wǎng)膜炎，Ush1c突變小鼠不能正確翻譯harmonin蛋白，經(jīng)圓窗注射AAV2/Anc80.CMV.harmonin-b可以恢復(fù)聽力和前庭功能[26]；AAV攜帶人工合成miRNA可以結(jié)合于Tmc1(Transmembrane channel-like gene family 1)突變基因，抑制突變基因的轉(zhuǎn)錄，從而抑制顯性遺傳導(dǎo)致的聽力下降[27]。

現(xiàn)階段基因治療僅限于小鼠新生階段干預(yù)，首要原因是缺少安全有效的手術(shù)徑路，最近證實(shí)成年小鼠后半規(guī)管注射可以轉(zhuǎn)染耳蝸細(xì)胞，為成年小鼠基因治療提供了技術(shù)支持[28]。

4.2 基因編輯

隨著CRISPR/Cas9基因編輯工具效率的提高，利用基因編輯工具在體治療遺傳性疾病成為可能。核糖核酸蛋白（RNP）介導(dǎo)的CRISPR/Cas9可在小鼠耳蝸毛細(xì)胞進(jìn)行基因編輯并敲除Math1-GFP小鼠的GFP基因[29]。Tmc1點(diǎn)突變(c.T1235A)小鼠表現(xiàn)為遲發(fā)性耳聾，經(jīng)RNP介導(dǎo)的CRISPR/Cas9治療后聽力明顯恢復(fù)，毛細(xì)胞存活率明顯提升?；驕y(cè)序結(jié)果表明基因編輯脫靶率極低，證實(shí)了內(nèi)耳基因編輯的安全性[30]。首次證實(shí)了可通過基因編輯技術(shù)實(shí)現(xiàn)內(nèi)耳基因精準(zhǔn)治療，為遺傳性耳聾的治療提供了新的途徑?；蚓庉嬛委煹膬?yōu)勢(shì)在于可精準(zhǔn)靶向致病基因，而且徹底去除了遺傳性耳聾的病因。

4.3 干細(xì)胞移植

人的體細(xì)胞可在體外誘導(dǎo)成多能干細(xì)胞。目前可通過基因調(diào)控分化為有功能的毛細(xì)胞，提供了人類內(nèi)耳細(xì)胞的體外篩選平臺(tái)[19]。干細(xì)胞移植一直是耳聾治療的潛在方案，骨髓、脂肪和臍帶來源的間質(zhì)干細(xì)胞是可能的方案。隨著干細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展，骨髓來源的間質(zhì)干細(xì)胞是最有可能用于內(nèi)耳細(xì)胞的替代治療方案[31]。

4.4 神經(jīng)營養(yǎng)因子

新生階段大鼠內(nèi)耳注射腺病毒介導(dǎo)的NT-3(Neurotrophin-3)可以加速大鼠聽力的發(fā)育，表明了NT-3可能參與了聽覺發(fā)育過程[32]。噪音暴露前在小鼠耳蝸圓窗注射NT-3可以促進(jìn)突觸的再生[33]。噪音暴露前利用AAV在小鼠內(nèi)耳過表達(dá)NT-3，可明顯避免噪音導(dǎo)致的突觸丟失[34]。

5 前庭系統(tǒng)研究

前庭系統(tǒng)高通量轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)使毛細(xì)胞轉(zhuǎn)錄、纖毛發(fā)育、損傷后的細(xì)胞應(yīng)答、非哺乳動(dòng)物毛細(xì)胞再生的機(jī)制研究有了新的進(jìn)展。而前庭細(xì)胞多態(tài)性的分子機(jī)制、脊柱動(dòng)物前庭細(xì)胞成熟性/可塑性調(diào)控、前庭自發(fā)再生后的功能恢復(fù)以及前庭神經(jīng)元的再生仍是研究的難點(diǎn)[35]。

通過單細(xì)胞RNA-Seq已經(jīng)重現(xiàn)了新生小鼠橢圓囊毛細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過程中的基因表達(dá)變化，可以進(jìn)一步研究I型、II型前庭毛細(xì)胞及支持細(xì)胞等不同細(xì)胞亞型在發(fā)育階段的基因表達(dá)差異，從而建立相應(yīng)的篩選文庫[35]。然而如何證實(shí)這些差異基因是必需的調(diào)控基因是研究的瓶頸。

通過胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化可以在體外培養(yǎng)出前庭感覺上皮細(xì)胞，并能檢測(cè)到有機(jī)械門控通道的I、II型前庭毛細(xì)胞[36]。

隨著體外3D器官培養(yǎng)技術(shù)和CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的發(fā)展，前庭系統(tǒng)基因調(diào)控研究借助這些高通量研究技術(shù)可以很快推進(jìn)。

6 耳科研究新技術(shù)

顯微鏡技術(shù)的發(fā)展和在體成像技術(shù)的提高，使得耳科學(xué)的研究可以在保持聽覺通路完整性的前提下開展，也可以在更微觀的層面探索聽覺機(jī)制。

6.1 雙光子技術(shù)

單光子共聚焦顯微鏡已經(jīng)在耳科學(xué)得到了廣泛應(yīng)用，但僅限于觀察平面組織。雙光子成像具有高分辨率、高速、可穿透一定厚度組織的特點(diǎn)，可以非侵入地對(duì)在體組織進(jìn)行觀察。通過熒光蛋白或熒光染料標(biāo)記，或是結(jié)合光遺傳學(xué)，將細(xì)胞中的定位與表達(dá)技術(shù)相結(jié)合，可在生命體和細(xì)胞仍具有活性的狀態(tài)下對(duì)其功能進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察?？梢匝芯刻幱谏頎顟B(tài)的活體動(dòng)物的神經(jīng)系統(tǒng)。雙光子技術(shù)已經(jīng)是神經(jīng)科學(xué)研究的重要工具，也逐漸在耳科研究中得到應(yīng)用。將分離的小鼠耳蝸孵育于含鈣離子敏感的染料（Oregon Green BAPTA 488AM）培養(yǎng)基，在卵圓窗進(jìn)行機(jī)械刺激模擬聲波振動(dòng)基底膜，用雙光子成像系統(tǒng)記錄外毛細(xì)胞的鈣離子變化，從而實(shí)現(xiàn)保持耳蝸器官完整性的同時(shí)進(jìn)行聽覺生理研究[37]。

6.2 活細(xì)胞成像

非侵襲性活細(xì)胞成像和標(biāo)記技術(shù)為內(nèi)耳形態(tài)研究提供了時(shí)空動(dòng)態(tài)、高清記錄的可能。Light-sheet顯微成像技術(shù)可以記錄長時(shí)間活體組織影像，并且多維度、長時(shí)程、高分辨率、光毒性小，為內(nèi)耳組織結(jié)構(gòu)學(xué)研究提供新的可能[37]。

組織透明質(zhì)化和激光切割工具的出現(xiàn)，為基底膜的機(jī)械生物力學(xué)研究增添了新的工具[38]。

綜之，耳科學(xué)在近年來呈現(xiàn)蓬勃發(fā)展的勢(shì)頭：研究的手段越來越多，研究的領(lǐng)域越來越廣，研究的程度越來越深，無論是基礎(chǔ)研究還是轉(zhuǎn)化研究都取得了可喜的成果。希望在國內(nèi)外耳科研究人員的共同努力下，共同推動(dòng)學(xué)科的跨越式發(fā)展。

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