於得紅 汪雪玲 陳聿名 吳皓

上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科上海交通大學醫(yī)學院耳科學研究所上海市耳鼻疾病轉化醫(yī)學重點實驗室

順鉑作為一種廣譜抗癌藥，對泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤、惡性淋巴瘤、頭頸部鱗癌、軟組織肉瘤等均具有一定的治療效果。另外，順鉑對腫瘤的放療也有較好地增敏作用。順鉑腎毒性可通過利尿劑得到有效緩解。然而，劑量依賴性的順鉑耳毒性依然限制其更好地發(fā)揮療效甚至導致停藥。至今仍無FDA批準有效預防或治療順鉑耳毒性的藥物上市。盡管順鉑耳毒性無生命危險，但是其逐年升高的發(fā)生率仍然引起醫(yī)學科學研究者的廣泛關注。目前，約40-80%接受順鉑治療的成年腫瘤患者和22-74%兒童腫瘤患者出現(xiàn)永久性聽力損傷[1,2]。順鉑耳毒性嚴重降低了患者的生活質量，尤其影響兒童早期語言發(fā)育和社會認知能力。因此，闡明順鉑耳毒性作用機制，有助于探索其預防和治療策略，具有重大臨床意義。

在過去的20多年間，多種制劑和藥物被開發(fā)用于預防或治療順鉑耳毒性。其中，研究熱點聚焦于抗氧化物對順鉑耳毒性的預防和治療作用及機制的研究。順鉑通過激活線粒體途徑誘導聽覺細胞凋亡，因此，通過靶向線粒體途徑可有效抑制該途徑依賴的細胞凋亡。此外，以促炎癥反應因子為靶點制劑也具有耳毒性預防作用。最新研究聚焦于闡明順鉑如何進入耳蝸內聽覺毛細胞和其它細胞，進而研發(fā)可特異性抑制順鉑進入上述細胞途徑而不影響順鉑抗腫瘤療效的新型藥物。本文詳細闡述目前公認的順鉑導致耳蝸聽覺毛細胞和其他相關細胞的損傷或死亡等耳毒性作用機制，同時對當前具有順鉑耳毒性保護作用的代表性的抗氧化藥物的基礎和臨床研究進行總結，為未來順鉑耳毒性藥物研究開發(fā)提供理論依據(jù)和方向性指導。

1 耳蝸自身抗氧化活性防御體系

耳蝸正常功能的維護需要血管紋、螺旋韌帶和螺旋突起區(qū)域具備活躍的新陳代謝活性以促使線粒體呼吸鏈釋放電子，使氧氣（O2）轉變成超氧化物（O2-）。噪音、老齡化、使用抗生素和順鉑等耳毒性藥物等環(huán)境因素均會刺激耳蝸新陳代謝加速，進而造成氧化應激反應。大量實驗證實，順鉑耳毒性藥物或通過激活促活性氧（Reactive oxygen species,ROS）產生的酶活性或通過抑制抗氧化物產生的酶活性提高耳蝸內活性氧的產生[3]。注射順鉑的大鼠耳蝸內谷胱甘肽（GSH）活性和抗氧化物酶活性降低。有研究報道，經鼓室給藥NOX3小干擾RNA有效保護順鉑引起耳毒性[4]，提示順鉑導致ROS產生升高的主要作用靶點是NOX3 NADPH氧化酶系統(tǒng)。

耳蝸具備天然的抗氧化防御體系，包括維生素C，維生素E和含有小分量硫醇的GSH。研究發(fā)現(xiàn)，GSH主要表達于血管紋底部和中部，以及螺旋韌帶細胞內，該分布與外源性物質結合和解毒的GSH S-轉移酶分布一致[5]。另外，耳蝸表達超氧化物歧化酶（SOD），谷胱甘肽過氧化物酶(GSH.Px)和過氧化氫酶（CAT）等抗氧化物酶。SOD催化O2-變成H2O2和H2O，而CAT又可催化H2O2變成O2和H2O。GSH.Px減少H2O2和其他可能的氧化物的形成，同時通過催化還原性GSH轉化成氧化性GSH（GSSG）并清除H2O2。另外，谷胱甘肽還原酶（GR）幫助GSH從氧化型轉變成還原型，在耳蝸抗氧活防御體系中發(fā)揮重要作用。SOD的兩種亞型表達在耳蝸內。Cu/Zn-SOD定位于細胞胞質中，而Mn-SOD定位在線粒體內[6]。Mn-SOD分布在耳蝸內血管紋，螺旋韌帶，螺旋突，螺旋緣和Corti氏器等代謝活性位點[6]。在沒有這些ROS解毒作用的自身防御系統(tǒng)，ROS會通過產生脂質類過氧化物，丙二醛等對細胞造成損傷。

2 順鉑耳毒性分子作用機制

最新研究發(fā)現(xiàn)，順鉑經靜脈注射后，在大多數(shù)器官中數(shù)天或數(shù)周內即被清除，然而在耳蝸組織中卻會持續(xù)滯留數(shù)月甚至數(shù)年[7]。順鉑導致耳毒性的細胞水平和分子水平作用機制尚未完全闡明。目前，普遍公認的順鉑細胞耳毒性作用機制主要包括三大方面：

1）順鉑通過哺乳動物銅離子轉運蛋白（CTR1）、有機陽離子轉運體（OTC1-3）或機械轉換器通路（mechanotransducer，MET）介導進入耳蝸細胞胞質形成水性復合物，引起DNA損傷和交叉結合，導致分子傳感器共濟失調基因突變（ATM），誘發(fā)抑癌基因p53激活，進而提高Bcl-2相關X蛋白（Bax）表達，促使線粒體中細胞色素C釋放，最終導致capase 3激活的凋亡。鼓室內注射CTR1底物硫酸銅可有效保護順鉑引起的聽力損失[8]。OCT抑制劑甲氰咪胍的使用有效降低順鉑引起的腎毒性和耳毒性[9]。近期研究發(fā)現(xiàn)，順鉑依賴MET通路導致斑馬魚毛細胞損傷[10]。TRP（Transient receptor potentical）通路分子TRPV4，TRPA1，TRPC3，TRPML3也在耳蝸內表達，介導氨基糖苷類抗生素進入腎臟細胞[11]。然而，這些信號通路分子是否介導氨基糖苷類抗生素和順鉑進入耳蝸毛細胞，尚未見相關報道。

2）順鉑引起內耳ROS累積誘發(fā)細胞毒性。順鉑通過激活NADPH氧化酶，降低抗氧化物酶（SOD，GR，GST和GSH-Px）。ROS升高導致細胞色素從線粒體中釋放，導致細胞凋亡。普遍認為耳蝸細胞抗氧化能力降低來自以下四個方面[12]：1）順鉑與抗氧化酶的巰基基團共價結合，從而使酶失活；2）SOD和GSH.Px活化必需的銅、錫等金屬輔助因子丟失；3）ROS的升高需要消耗更多的抗氧化物酶；4）耳蝸內抗氧化物酶GSH.Px和GR活化必需的輔助因子過度消耗，如GSH，NADPH等。

3）順鉑促進細胞炎癥因子釋放，包括TNF-α,IL-β，IL-6和NF-kB釋放入細胞質。促炎癥因子和ROS產生相關聯(lián)，同時抑制IkB降解以保持NF-kB在胞質中處于失活狀態(tài)[13]。NF-kB一旦激活會被轉運至細胞核引發(fā)一系列細胞活動，包括促炎癥因子的從頭合成，促凋亡因子caspase-3和9活化，提高誘導型一氧化氮合酶活化[14]。

3 具備順鉑耳毒性預防效果的代表性抗氧化藥物

當耳蝸內有大量ROS激活時，自身抗氧化防御體系將無法完成活性氧清除，需要外源性抗氧化劑緩解氧化應激反應。其中，具有代表性的抗氧化藥物如下：

1）硫代硫酸鈉（Sodium Thiosulfate，STS）

研究證實，STS可借助其巰基基團與順鉑形成復合物使順鉑失活；或直接終止ROS活性；或保持抗氧化物酶活性等方法拮抗順鉑耳毒性[16]。STS是目前通過巰基基團拮抗順鉑耳毒性效果最佳的抗氧化物。然而，外周血液中硫代硫酸鈉極大拮抗順鉑抗腫瘤療效。研究證實，硫代硫酸鈉顯著降低人血液中游離順鉑的濃度。給予硫代硫酸鈉10 min后，血液中僅有31%順鉑，50 min后，血液中檢測不到順鉑；而未給予STS組，10 min后血液中可檢測到高達87%的順鉑，順鉑可持續(xù)檢測長于3 h[16]。

為規(guī)避STS在外周血中的腫瘤抗藥性，改用鼓室內用藥，然而動物實驗中并未取得有效的聽力保護結果[17]。采用手術創(chuàng)傷較大的導管植入方式在耳蝸內給予一定量的STS，與對照組相比，STS組在實驗頻率下（2-30 kHz）下均有顯著的聽力保護效果，頻率越高，保護效果越好[18]。最新研究發(fā)現(xiàn)，高粘度透明質酸包載STS粘附于圓窗膜，可保持骨階淋巴液中高濃度STS，而血液中STS濃度較低，進而實現(xiàn)在保護順鉑引起毛細胞損傷同時降低對順鉑抗腫瘤療效的影響[19]。藥物遞送系統(tǒng)和滲透泵等的改良優(yōu)化將有助于提高STS鼓室內給藥的效率，最終實現(xiàn)STS順鉑耳毒性保護效果最大化，同時對順鉑抗腫瘤療效的影響最小化的目的。

2017年報道的隨機III期臨床試驗（NCT00716976）證實STS在給予順鉑兒童腫瘤患者中體現(xiàn)較好的保護聽力作用，且未引起不良反應[20]。腫瘤患者給予順鉑6 h后給予STS組，最后一次給予順鉑4周后測聽力。結果表明順鉑加STS組僅有28.6%的患者出現(xiàn)聽力下降，而單純順鉑組高達56.4%的患者出現(xiàn)了聽力下降[20]。然而，該研究同時發(fā)現(xiàn)，順鉑加STS組腫瘤轉移患者，三年生存率僅有45%，嚴重低于順鉑組的84%。相比而言，對于原發(fā)腫瘤，順鉑加STS組的生存率與順鉑組無差別。另一個以原發(fā)腫瘤患者給予順鉑治療患者為對象的多中心、隨機、非盲、III期臨床試驗研究（NCT00652132）已于2017年底完成[21]。STS臨床階段研究取得一定的進展，但仍需在STS給藥策略（給藥頻次、劑量）等方面進行進一步研究。

2）N-乙酰半胱氨酸（N-Acetyl Cysteine,NAC）

NAC通過多種途徑抑制順鉑引起的耳毒性，具備雙重抗氧化活性，包括直接與順鉑形成復合物或與胞質內順鉑水解復合物結合使其失活[22]。同時，NAC通過抑制JNK,p38 MAPK和NF-kB轉錄因子激活提高細胞存活，激活ERK途徑抑制細胞凋亡[23]。NAC系統(tǒng)性用藥存在與STS相同的問題，即拮抗順鉑的抗腫瘤療效。因此，NAC系統(tǒng)性用后后對順鉑耳毒性保護作用的研究報道結果各不相同。例如，鼓室內注射2%NAC在動物實驗中證實順鉑耳毒性保護作用良好，然而在在臨床研究中卻無任何效果[24]。與此相反，2013年的臨床試驗證實鼓室內給予10%NAC可有效保護順鉑引起的聽力下降，在8kHz有顯著性差異[25]。濃度提高至20%，患者出現(xiàn)內耳炎癥和無法承受的疼痛[25]。盡管鼓室內給予較高濃度藥物，然而耳蝸內淋巴液中藥物濃度并未達到理想治療濃度，大部分藥物經咽鼓管流失代謝。此外，鼓室內短時間內連續(xù)多次給藥也增加了患者的痛苦。上述臨床試驗中2周內間隔給藥共8次，引起無數(shù)患者抱怨[25]。Ciftci等[26]借助水凝膠載體系統(tǒng)經鼓室輸送NAC，初步實驗結果證實，該系統(tǒng)具備可控緩釋特性，且材料降解無需體外水分，凝結成膠體時間較普通膠體迅速。然而，在順鉑耳毒性保護動物模型上的實驗有待進一步研究。

確定NAC對順鉑耳毒性保護作用的給藥劑量以及聯(lián)合順鉑給藥方案優(yōu)化的I期臨床試驗（NCT02094625）正在進行中[27]。根據(jù)這項研究，年齡在1-21歲的30名腫瘤患者接受順鉑4h后，靜脈注射NAC 30min，持續(xù)3個用藥周期。試驗已于2018年2月完成。

3）D-甲硫氨酸（D-Methionine）

D-甲硫氨酸是L-甲硫氨酸的異構體，已被證實具有順鉑耳毒性保護作用。D-甲硫酸鈉通過直接與順鉑形成復合物使其失活、保護內源性抗氧化物酶活性發(fā)揮順鉑耳毒性保護作用。Campbell等[28]報道順鉑促進了脂質過氧化反應的分子標志物丙二醛形成，顯著抑制SOD，CAT，GR和GSH-Px活性。順鉑用藥前30 min給予D-甲硫氨酸有效保存GR，SOD和CAT活性，同時導致丙二醛顯著降低。然而，并未觀察到對GSH-Px活性保護作用[28]。當系統(tǒng)性多次給藥后，D-甲硫氨酸在動物實驗中表現(xiàn)出聽力保護作用[28]。

與含巰基基團的其他抗氧化劑相似，D-甲硫氨酸經系統(tǒng)性用藥后也存在拮抗順鉑抗腫瘤療效的難題。Ekborn等[29]詳盡研究了D-甲硫氨酸和順鉑合用時藥物代謝動力學的改變，與順鉑單獨用藥相比，聯(lián)合用藥將順鉑藥物濃度-時間曲線下面積（AUC）降低了近30%，這也是D-甲硫氨酸拮抗順鉑抗腫瘤療效的主要原因。D-甲硫氨酸對順鉑抗腫瘤療效的拮抗作用強度因腫瘤類型、動物模型、給藥頻次以及兩藥劑量比例不同而呈現(xiàn)不同的效果。因此，關于順鉑與D-甲硫氨酸之間藥物相互作用的機制的相關研究有待進一步進行。D-甲硫氨酸分子量比較小，適合局部鼓室內給藥。已有研究證實，D-甲硫氨酸經圓窗膜給藥后體現(xiàn)出動物水平上的順鉑耳毒性保護作用，但其對順鉑抗腫瘤療效是否有抵抗作用并不明確[30]。

一項II期臨床試驗（MRX-1024）研究發(fā)現(xiàn)，口服的D-甲硫氨酸的放療和化療聯(lián)合使用的患者，10kHz下有較好的聽力保護作用。然而，在沒有放療情況下，不明確D-甲硫氨酸的安全性和有效性[31]。同時，未見其他有類似保護作用的研究報道發(fā)表。

4 結語

具有順鉑耳毒性保護作用的抗氧化物臨床試驗研究正在逐步開展，其研究結果往往存在很大爭議。臨床試驗研究受各種因素制約，包括給藥方案制定、聯(lián)合使用方案、給藥途徑、聽力檢測時間及方法、耳毒性級別評價、隊列人數(shù)多少、患者年齡、腫瘤類型以及腫瘤是否發(fā)生轉移等。抗氧化物順鉑耳毒性保護作用的臨床應用有待于臨床試驗研究的進一步完善。同時，隨著順鉑耳毒性作用機制機制研究的不斷深入，新的分子機制將為其預防治療提供新的作用靶點。最新研究發(fā)現(xiàn)，細胞周期素依賴性激酶2（CDK2）抑制劑kenpaullone鼓室給藥后有效降低成年小鼠順鉑耳毒性[32]。以上結果提示，CDK2抑制劑或許有望成為新一代順鉑耳毒性保護藥物?？偠灾?，順鉑耳毒性發(fā)生率極高，嚴重影響腫瘤患者生活質量，尤其兒童患者。安全、有效、且不影響順鉑抗腫瘤療效的順鉑耳毒性保護作用的研究將聚焦于新作用靶點藥物的開發(fā)，借助藥物遞送系統(tǒng)提高療效或兩種不同作用機制藥物的聯(lián)合應用。

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