林清英* 林 真 林 嫻 高 暉

（福建生物工程職業(yè)技術(shù)學院，福建 福州 350002）

復(fù)方石斛飲品為我院自主研發(fā)產(chǎn)品，是以鐵皮石斛為主要原 料，配伍桑葉、桑椹等多味中藥，經(jīng)提取、純化、配置而成的一種功能性飲品，具有滋陰清熱、養(yǎng)胃生津、益氣作用，可用于肺胃陰虛，津虧煩渴，內(nèi)熱消渴等證，也可作為糖尿病患者日常飲品，具有輔助降血糖作用。有關(guān)鐵皮石斛、桑葉、桑椹等各組方原料的降血糖研究多有報道，為有效評價復(fù)方石斛飲品的降血糖作用，探討其降糖機制，本研究建立了體外α-葡萄糖苷酶抑制活性評價體系，并對復(fù)方石斛飲品、鐵皮石斛、桑葉、桑椹抑制α-葡萄糖苷酶活性的作用進行了比較，為復(fù)方石斛飲品及鐵皮石斛等原料的開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器：UV 2000紫外可見分光光度計（尤尼柯儀器有限公司）；TDL-5M臺式大型冷凍離心機（湖南湘儀儀器有限公司）；DK-98-ⅡA恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 試藥：復(fù)方石斛飲品（學院自制）；鐵皮石斛（由福建省武平縣梁野山種植基地提供）；桑葉、桑椹（陜西聚善堂中藥材實業(yè)有限公司）；α-葡萄糖苷酶、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG）（美國Sigma公司）；阿卡波糖（BJ35878，中國北京拜耳醫(yī)藥保健有限公司）；其他試驗試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 反應(yīng)溶液制備

2.1.1 磷酸鹽緩沖液（pH 6.8）：取K2HPO415.292 g、KH2PO49.118 g，加超純水溶解，定容至1000 m L容量瓶，混勻，即得（0.067 mol/L）。

2.1.2 α-葡萄糖苷酶溶液：精密稱取α-葡萄糖苷酶0.02 g，用磷酸鹽緩沖液定容至10 m L容量瓶中，混勻，即得（2 mg/m L）。

2.1.3 pNPG溶液：精密稱取pNPG 0.0274 g，用磷酸鹽緩沖液定容至10 m L容量瓶，混勻，即得（2.74 mg/mL）。

2.1.4 Na2CO3終止劑：取Na2CO310.6 g，加磷酸鹽緩沖液溶解，定容至500 mL容量瓶中,混勻，即得（0.2 mol/L）。

2.2 抑制劑貯備溶液制備

2.2.1 復(fù)方石斛飲品：量取復(fù)方石斛飲品適量，濃縮至100 m L，低溫（4 ℃）冷凍離心10 min（5000 r/min），上清液活性炭脫色，即得（250 mg/m L）。

2.2.2 鐵皮石斛藥材：稱取新鮮鐵皮石斛（含水率為67.5%）25 g，切段，加入20倍量水榨汁提取10 m in，200目濾布擠壓過濾，濾渣加入5倍量水煎煮提取2次，每次1 h，合并榨汁液和兩次煎煮液，600目濾布擠壓過濾，濾液濃縮至100 m L，低溫（4 ℃）冷凍離心10 m in（5000 r/min），上清液活性炭脫色，即得（250 mg/mL）。

2.2.3 桑葉、桑椹：分別稱取桑葉、桑椹各25 g，加入多倍量水（桑葉40倍量、桑椹20倍量），浸漬0.5 h，煮沸提取2次，每次1 h，合并提取液，600目濾布過濾，濾液濃縮至100 m L，低溫（4 ℃）冷凍離心10 min（5000 r/min），上清液活性炭脫色，即得（250 mg/m L）。

2.3 抑制劑對α-葡萄糖苷酶抑制活性的測定：利用α-葡萄糖苷酶抑制劑能抑制α-葡萄糖苷酶催化pNPG水解產(chǎn)生pNP的性質(zhì)，以PNPG為底物，以一定時間內(nèi)反應(yīng)體系釋放出來的pNP的量來計算抑制劑對α-葡萄糖苷酶抑制活性。反應(yīng)體系（總體積5 m L）：準確移取磷酸鹽緩沖液600 μL至試管中，加待測抑制劑樣品溶液、α-葡萄糖苷酶溶液各100 μL，混勻，37 ℃溫孵15 min，加入底物pNPG溶液100 μL啟動反應(yīng)，37 ℃催化水解20 min，加入Na2CO3終止劑4 m L終止反應(yīng)，振蕩混勻，于400 nm處測定在抑制劑作用下水解產(chǎn)物pNP的吸光度值，每個樣品同時做3個平行樣，取平均值。同時設(shè)立陰性對照（不加抑制劑，補充緩沖液），背景對照 （不加α-葡萄糖苷酶溶液，補充緩沖液），空白對照（不加底物和抑制劑，補充緩沖液），計算抑制率。

抑制率（%）＝{[（A陰性－A空白）－（A試樣-A背景）]/（A陰性-A空白）}×100%。

2.4 抑制劑及其質(zhì)量濃度對α-葡萄糖苷酶活性的抑制影響：取250 mg/mL的各抑制劑貯備溶液，加水稀釋成濃度分別為2.5 mg/m L、10 mg/mL、25 mg/mL、50 mg/mL、100 mg/mL、150 mg/mL的系列樣品溶液，同時取阿卡波糖適量，制成相應(yīng)濃度系列的阿卡波糖陽性對照液，按照上述“2.3”方法進行α-葡萄糖苷酶抑制活性的測定，繪制抑制率曲線，計算IC50。結(jié)果見表1、圖1，顯示，各抑制劑均有α-葡萄糖苷酶抑制活性，抑制活性作用強弱順序為：桑葉＞桑椹＞復(fù)方石斛飲品＞鐵皮石斛。質(zhì)量濃度50 mg/L時，桑葉、桑椹水提液抑制率分別為88.2%、80.6%，均高于陽性對照阿卡波糖69.3%的抑制率，復(fù)方石斛飲品抑制率為56.4%，鐵皮石斛水提液抑制率最低，為38.2%。高質(zhì)量濃度150 mg/L時，桑葉、桑椹水提液抑制率分別為91.5%、90.3%，阿卡波糖抑制率為85.1%，復(fù)方石斛飲品抑制率為83.3%，鐵皮石斛水提液抑制率為58.4%。

表1 不同抑制劑對α-葡萄糖苷酶的半數(shù)抑制濃度

圖1 不同抑制劑質(zhì)量濃度/抑制率曲線

3 討 論

3.1 α-葡萄糖苷酶抑制劑通過可逆性抑制小腸刷狀緣的α-葡萄糖苷酶的活性，有效調(diào)節(jié)餐后血糖水平[1]，有助于控制糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展。4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG）法[2]為是α-葡萄糖苷酶抑制劑有效體外篩選方法，被廣泛用于降糖中藥的篩選評價。本試驗參照朱文佳[3]等所建立方法，對反應(yīng)體系中溫孵時間、水解時間、酶濃度、底物濃度、終止劑濃度等因素進行了考察，確定溫孵時間為15 m in、酶催化水解反應(yīng)時間為20 m in、α-葡萄糖苷酶濃度為2 mg/m L、底物pNPG濃度2.74 mg/m L、Na2CO3終止劑濃度為0.2 mol/L。

3.2 鐵皮石斛為蘭科石斛屬植物，以新鮮或干燥莖入藥，為常用珍貴藥材。具有益胃生津，滋陰清熱等功效，藥理研究表明其有增強免疫力、抗氧化、降血糖等作用。復(fù)方石斛飲品是根據(jù)中醫(yī)藥組方原則，結(jié)合現(xiàn)代藥理研究，將鐵皮石斛與桑葉、桑椹等降糖中藥的有機配伍，生產(chǎn)加工而成。本試驗對不同質(zhì)量濃度的復(fù)方石斛飲品及其主要原料鐵皮石斛、桑葉、桑椹水提液進行了對α-葡萄糖苷酶的抑制活性測定，結(jié)果表明，各抑制劑均有較強的α-葡萄糖苷酶抑制活性，且抑制活性強度隨著樣品質(zhì)量濃度的升高而增大，在高濃度時，抑制率曲線趨于平緩。鐵皮石斛對對α-葡萄糖苷酶抑制活性表現(xiàn)較弱，有關(guān)研究表明鐵皮石斛主要降糖機制可能是促進胰島β細胞分泌胰島素，抑制胰島α-細胞分泌胰高血糖素，抑制肝糖原分解和促進肝糖原合成[4]。復(fù)方石斛飲品半數(shù)抑制濃度為41.5 mg/L，當質(zhì)量濃度達150 mg/L時，復(fù)方石斛飲品抑制率為83.3%，其對α-葡萄糖苷酶抑制活性效果接近阿卡波糖，提示復(fù)方石斛飲品在高濃度時能明顯抑制α-葡萄糖苷酶活性，達到降血糖作用。因此，鐵皮石斛及其制劑降血糖效果可采用體外α-葡萄糖苷酶抑制活性評價體系進行初步評價后，可進一步采用動物試驗等進行綜合評價。

[1]顧覺奮,陳紫娟.α-葡萄糖苷酶抑制的研究及應(yīng)用[J].藥學進展,2009,33(2):62-67.

[2]Chapdelaine P,Tremblay RR,Dube JY.P-n-itophenol-α-D-glucopyranoside as substate for measurement of maltase activity in human semen[J].Chinical chemistry,1978,24(2):208-211.

[3]朱文佳,寇自農(nóng),張曦,等.α-葡萄糖苷酶抑制劑體外篩選方法的研究[J].食品研究與開發(fā),2012,33(8):171-175.

[4]湯志遠,周曉宇,馮健,等.鐵皮石斛多糖降血糖作用研究.南京中醫(yī)藥大學學報,2016,32(6):566-570.