胡剛，王旭，李揚(yáng)秋

（1.廣東省惠東縣人民醫(yī)院內(nèi)六科，廣東 惠東 516300；2.暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院血液病研究所；3.暨南大學(xué)再生醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實驗室）

聯(lián)合化療和誘導(dǎo)分化治療已經(jīng)顯著改善了急性早幼粒細(xì)胞白血病患者的預(yù)后，但微小殘留病變的存在，成為患者日后復(fù)發(fā)的根源。在患者處于疾病緩解期，利用白血病疫苗誘導(dǎo)患者產(chǎn)生抗白血病的特異免疫反應(yīng)，是一種理想的預(yù)防白血病復(fù)發(fā)的方式。前期研究表明利用PML-RARα基因片段與白細(xì)胞介素2（IL-2）、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）等構(gòu)建的重組表達(dá)載體能夠誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答［1-3］。本研究旨在檢測我們前期構(gòu)建的pIRES-PML-RARα-IFN-γ重組質(zhì)粒在真核細(xì)胞中的表達(dá)情況，為急性早幼粒細(xì)胞白血病DNA疫苗的研發(fā)提供資料。

1 材料與方法

1.1 材料 p IRES-PML-RARα-IFN-γ重組質(zhì)粒由暨南大學(xué)血液病研究所實驗室構(gòu)建并保存，A549細(xì)胞株購自北京天為時代公司。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞 取適量A549細(xì)胞（約6×105個）平鋪在不含抗生素的培養(yǎng)基上。用IMDM培養(yǎng)基（北京天為時代公司）將待轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞稀釋20倍后，將這些細(xì)胞置于顯微鏡下進(jìn)行計數(shù)。取出適量的細(xì)胞液用離心機(jī)以600 r/min的轉(zhuǎn)速離心5min后，用IMDM培養(yǎng)基對離心后的細(xì)胞進(jìn)行重懸處理，經(jīng)過處理后的細(xì)胞濃度為1.2×106/ml。取一個做好標(biāo)記的24孔板，板上的每個孔中加入500μl經(jīng)過重懸處理的細(xì)胞液，加入細(xì)胞液后板上每個孔的細(xì)胞數(shù)目約為6×105個。（2）將重組載體質(zhì)粒加入到適量Opti-MEM?I培養(yǎng)基中（北京天為時代公司，該培養(yǎng)基不含血清），在室溫下輕輕搖動混合均勻，然后在室溫下孵育5min。（3）向裝有待轉(zhuǎn)染細(xì)胞液的培養(yǎng)板中分別加入適量DNA-Lipofectamine?2000復(fù)合物，然后輕微晃動培養(yǎng)板使細(xì)胞液與復(fù)合物混合均勻。（4）將含有細(xì)胞液和復(fù)合物的培養(yǎng)板放入二氧化碳培養(yǎng)箱中在37℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)4～6 h，然后取出培養(yǎng)板，更換其中的培養(yǎng)基，更換后的培養(yǎng)基含有胎牛血清和抗生素，將該培養(yǎng)板置于二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞和上清液。

1.2.2 RT-PCR法檢測外源質(zhì)粒在真核細(xì)胞中的表達(dá) 收集轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h的A549細(xì)胞提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA作為模板，分別用引物P1、P2（用于擴(kuò)增PML-RARα基因，384 bp）和引物P3、P4（用于擴(kuò)增IFN-γ基因，553 bp）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠在100 V電壓下電泳。P1、P2引物序列：P1：5'-CAAGCTAGCA GCATGGTCTCCAATACAACGA-3'，P2：5'-GCGAC GCGTTCAGTCCTGACAGACAAA G-3'；P3、P4引物序 列 ：P3：5'-GCTCTAGAGATTTCA ACTTCTTT GGCTTA-3'，P4：5'-TTGTCGACGCAGG CAGGAC AACCATTACT-3'。

1.2.3 ELISA法檢測IFN-γ蛋白的表達(dá) 將ELISA試劑盒（杭州聯(lián)科生物技術(shù)公司）中的各種試劑按照操作要求配制成標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)品濃度如下：2.05、5.12、12.8、32、80、200、500 pg/m l。向反應(yīng)板各加樣孔中加入不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本，每個加樣孔中的加樣量為100μl，封閉加樣孔，將反應(yīng)板置于37℃溫箱中孵育90min。按照操作常規(guī)進(jìn)行洗板（共計4次），向每一個加樣孔中加入經(jīng)過生物素標(biāo)記的抗體，封閉加樣孔，置于37℃溫箱中孵育60min。按照操作常規(guī)洗板（共4次），向各加樣孔中加入酶結(jié)合物，封閉反應(yīng)孔，將反應(yīng)板置于37℃溫箱中孵育30min。洗板4次，向各加樣孔中加入顯色劑，避光條件下孵育20 min（37℃）。向各加樣孔中加入反應(yīng)終止液。以含有終止液和顯色劑的孔作為空白孔，分別在酶標(biāo)儀上將各加樣孔中的液體混合均勻后即刻測量OD450值。

1.2.4 Western blot法檢測PML-RARα蛋白的表達(dá) 應(yīng)用Western blot試劑盒（杭州聯(lián)科生物技術(shù)公司）進(jìn)行檢測，收集轉(zhuǎn)染后的A549細(xì)胞上清液，用考馬斯亮藍(lán)試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。樣品與等體積的2×上樣buffer混勻，煮沸5 min用7.5%SDS-聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）首先100 V/70 V電泳30min，然后換120 V/110 V電泳50min，分離后的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，用現(xiàn)配的Blocking buffer室溫孵育2 h。孵育一抗，4℃過夜。用PBST洗滌3次后孵育二抗1 h。將1：1配置的顯色液加到膜上，可立即顯色，然后進(jìn)行照相。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR結(jié)果 RT-PCR產(chǎn)物檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)第2、3泳道均出現(xiàn)大小為384 bp的條帶，這說明含有目的基因的重組質(zhì)粒都已經(jīng)成功地轉(zhuǎn)染到了A549細(xì)胞中，并且這些重組質(zhì)粒能夠在A549細(xì)胞中進(jìn)行正常轉(zhuǎn)錄。見圖1。

圖1 轉(zhuǎn)染后的A549細(xì)胞cDNA RT-PCR產(chǎn)物電泳圖

2.2 ELISA檢測結(jié)果 各標(biāo)本的OD450值檢測結(jié)果見表1。利用標(biāo)準(zhǔn)品OD450值制作的IFN-γ標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。

表1 標(biāo)準(zhǔn)品的OD450值檢測結(jié)果

標(biāo)本樣品檢測的OD450值結(jié)果見表2。由該曲線可以查出標(biāo)本4、標(biāo)本5和標(biāo)本6中IFN-γ的濃度分別約為5.66、8.52和10.5 pg/ml，根據(jù)ELISA實驗結(jié)果繪制的標(biāo)本樣品中IFN-γ濃度條形圖見圖3。

圖2 IFN-γ標(biāo)準(zhǔn)曲線

表2 標(biāo)本樣品檢測的OD450值結(jié)果

圖3 ELISA檢測IFN-γ濃度條形圖

2.3 Western blot檢測結(jié)果 Western blot檢測獲得的PML蛋白表達(dá)情況見圖4。

圖4 Western blot檢測PML蛋白表達(dá)

3 討論

伴隨著生物科技的進(jìn)步，白血病的治療手段也有了日新月異的變化，但是各種治療手段都面臨著一個問題，那就是如何根除患者體內(nèi)的微小殘留病變。免疫治療是有可能根除微小殘留病變的方法之一。許多白血病患者體內(nèi)都存在由于染色體易位導(dǎo)致的融合基因，這種融合基因既是致病的根源，也是免疫治療的重要靶點(diǎn)。將白血病患者體內(nèi)特定的融合基因插入到相應(yīng)的載體中構(gòu)建DNA疫苗，將該疫苗注射到患者體內(nèi)有可能誘發(fā)患者產(chǎn)生針對含有該融合基因的白血病細(xì)胞的免疫效應(yīng)，這一構(gòu)思在體外和動物試驗中得到了初步證實［4］。對BCR-ABL和PML-RARα融合基因的研究比較充分［4-6］，許多研究都采用這兩種融合基因用于構(gòu)建DNA疫苗，但是這些DNA疫苗的免疫原性卻不盡人意。如何提高疫苗的免疫原性，是DNA疫苗研發(fā)時所面臨的一個關(guān)鍵問題。

IFN-γ主要由活化的T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）產(chǎn)生，IFN-γ能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞等細(xì)胞MHC-Ⅱ分子表達(dá)，從而提高抗原提呈能力，因此可以作為佐劑用于增強(qiáng)DNA疫苗的免疫原性。本研究率先成功構(gòu)建了pIRESPML-RARα-IFN-γ雙表達(dá)載體，并且該載體能夠在真核細(xì)胞中進(jìn)行正常轉(zhuǎn)錄和翻譯。下一步我們將利用構(gòu)建的p IRES-PML-RARα-IFN-γ雙表達(dá)載體進(jìn)行動物實驗，爭取為利用DNA疫苗治療急性早幼粒細(xì)胞白血病提供更多資料。

［1］ Lin C，Li Y.The role of peptide and DNA vaccines in myeloid leukemia immunotherapy［J］.Cancer Cell Int，2013，13 （1）：13.

［2］ Li Y，Lin C，Schmidt CA.New insights into antigen specific immunotherapy for chronic myeloid leukemia［J］.Cancer Cell Int，2012，12（1）：52.

［3］胡剛，周羽竝，岑東芝，等.PML-RARα245與hGM-CSF雙基因DNA疫苗的構(gòu)建與表達(dá)［J］.江蘇醫(yī)藥，2013，39（8）：878-881.

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［5］Osman Y，TakahashiM，Zheng Z，et al.Dendritic cells stimulate the expansion of PML-RAR alpha specific cytotoxic T-lymphocytes：its applicability for antileukemia immunotherapy［J］.JExp Clin Cancer Res，1999，18（4）：485-492.

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