魯曦 李王平 李春夢 孫瑞琳 房延鳳 金發(fā)光

軍團(tuán)菌(Legionella)在1976年被首次報道，當(dāng)時在美國費城參加退伍軍人聚會的老兵中有182人出現(xiàn)了嚴(yán)重的肺炎癥狀，147人住院，29人死亡[1]。經(jīng)過密切的調(diào)查之后，發(fā)現(xiàn)致病菌是一種革蘭氏陰性桿菌，命名為嗜肺軍團(tuán)菌(Legionellapneumophila)[2]。自軍團(tuán)菌首次報道之后很短的時間內(nèi)，共發(fā)現(xiàn)了50余種軍團(tuán)菌，其中至少24種與人類疾病相關(guān)。90%以上的軍團(tuán)病是由嗜肺軍團(tuán)菌導(dǎo)致[3]，但在某些特定條件下，免疫缺陷患者可能對任何軍團(tuán)菌種普遍易感。嗜肺軍團(tuán)菌共有15種血清型，在全世界范圍內(nèi)有84%的軍團(tuán)菌感染是由血清1型引起。一項在法國的環(huán)境與臨床對比研究中發(fā)現(xiàn)，嗜肺軍團(tuán)菌血清1型占環(huán)境中軍團(tuán)菌的28%，但卻占患者體內(nèi)分離到軍團(tuán)菌的95%[4]。其余人類易感軍團(tuán)菌包括：波茲曼軍團(tuán)菌(Legionellamicdadei)、米克達(dá)德軍團(tuán)菌(Legionellamicdadei)和長灘軍團(tuán)菌(Legionellalongbeachae)共占人類軍團(tuán)菌感染的2%～7%[4]。

軍團(tuán)病于1982年在我國南京首次報道[5]以來，在我國成散發(fā)和小規(guī)模局部暴發(fā)，受到了我國政府和衛(wèi)生部門的高度重視。因此，了解軍團(tuán)菌感染機(jī)制、熟悉軍團(tuán)菌最新的檢測技術(shù)是控制軍團(tuán)病的關(guān)鍵所在。本文對該領(lǐng)域最新研究成果進(jìn)行簡要綜述。

一、 嗜肺軍團(tuán)菌的致病機(jī)制

1. 嗜肺軍團(tuán)菌在真核細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的機(jī)制研究進(jìn)展： 嗜肺軍團(tuán)菌與真核細(xì)胞的相互作用，是理解該菌致病機(jī)制的關(guān)鍵。一般而言，吞噬體利用細(xì)胞內(nèi)吞作用形成可以被消化的囊泡，隨后與溶酶體融合后通過酸化和蛋白酶的作用將大多數(shù)微生物降解消化[6]。然而，含有軍團(tuán)菌的囊泡(Legionellacontaining vesicles, LCV)卻能夠推遲與溶酶體的融合[7]。首先，通過PI-3激酶依賴(或非依賴)的方式發(fā)生軍團(tuán)菌內(nèi)吞，形成LCV[8]，初級LCV能夠推遲溶酶體融合與酸化，在內(nèi)吞作用發(fā)生的5 min內(nèi)，LCV開始募集內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分泌的囊泡，這些囊泡原先是用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體之間物質(zhì)交換的，在內(nèi)吞作用之后的4～10 h，LCV就利用了這些囊泡中的蛋白質(zhì)在pH中性的LCV中，以二分裂的方式開始復(fù)制，并突破宿主細(xì)胞[9]。在LCV形成之后的18～24 h之后才開始出現(xiàn)內(nèi)吞作用的標(biāo)志物(包括LAMP-1、組織蛋白酶D和Rab5)，而這些標(biāo)志物在內(nèi)吞大多數(shù)微生物之后的早期就會出現(xiàn)[10]。

最近研究發(fā)現(xiàn)，LCV能夠特異的招募Rab1分子，而非Rab2和Rab6。實驗發(fā)現(xiàn)抑制Rab1活性，能夠抑制嗜肺軍團(tuán)菌在胞內(nèi)的復(fù)制[11]；利用RNA干擾技術(shù)發(fā)現(xiàn)Sar1和Arf1分子敲減，也能夠抑制嗜肺軍團(tuán)菌在胞內(nèi)的復(fù)制[12]。此外某些證據(jù)表明，嗜肺軍團(tuán)菌對宿主細(xì)胞自噬的調(diào)控作用對其在胞內(nèi)復(fù)制也十分重要，例如，與自噬有關(guān)的Atg7和Agt8表現(xiàn)出能夠與LCV短暫的交聯(lián)，這種相互作用可能是利用自噬為嗜肺軍團(tuán)菌的胞內(nèi)復(fù)制提供營養(yǎng)[13]。但也存在一些相反的證據(jù)，例如自噬缺陷的宿主細(xì)胞并不影響嗜肺軍團(tuán)菌的復(fù)制[14]。因此，自噬對嗜肺軍團(tuán)菌復(fù)制的影響仍需進(jìn)一步研究。

2. 嗜肺軍團(tuán)菌進(jìn)出真核細(xì)胞的分子機(jī)制研究進(jìn)展： 人們對于嗜肺軍團(tuán)菌如何進(jìn)入真核細(xì)胞并最終釋放和感染其他細(xì)胞的過程知之甚少。目前在該領(lǐng)域存在兩種假說，其一為利用宿主傳統(tǒng)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞的假說：例如研究人員發(fā)現(xiàn)了某些哺乳動物細(xì)胞和阿米巴蟲，能夠通過卷吞噬作用(coiling phagocytosis)使嗜肺軍團(tuán)菌進(jìn)入宿主，但這種機(jī)制(卷吞噬作用)發(fā)生頻率很低[15]；再比如骨髓來源的巨噬細(xì)胞通過大胞飲(macropinocytosis)作用使軍團(tuán)菌進(jìn)入宿主[16]；此外還有經(jīng)典的拉鏈樣機(jī)制和調(diào)理素依賴的吞噬機(jī)制[17]，都屬于支持嗜肺軍團(tuán)菌利用宿主內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞的證據(jù)。此外，即使像PI-3激酶介導(dǎo)內(nèi)吞這種有較多證據(jù)、且相對成熟的機(jī)制也同樣存在爭議：例如最近的一項研究，利用PI-3激酶抑制劑(wortmannin)并沒有顯著影響巨噬細(xì)胞對嗜肺軍團(tuán)菌的內(nèi)吞作用[18]。

第二種假說是毒力因子介導(dǎo)的侵襲作用：其證據(jù)包括非吞噬細(xì)胞中的實驗，例如A549， CHO-K1和HeLa細(xì)胞實驗均支持這一假說[19-21]。目前已發(fā)現(xiàn)有5種蛋白與嗜肺軍團(tuán)菌侵襲相關(guān)，他們分別是EnhC、LpnE、RtxA、LvhB2和HtpB，其中研究得相對透徹的是HtpB蛋白，當(dāng)嗜肺軍團(tuán)菌進(jìn)入宿主細(xì)胞形成LCV之后，HtpB蛋白在宿主細(xì)胞和LCV中表達(dá)上調(diào)[22]。最新研究結(jié)果表明HtpB對于募集線粒體至初始LCV的過程中起到了關(guān)鍵作用[23]。

3. 嗜肺軍團(tuán)菌基因組： 截至作者發(fā)稿(2017年12月)，已有67株嗜肺軍團(tuán)菌基因組被完整測序， GC%介于38.1%～38.6%，基因組大小介于2.68M～3.78M、預(yù)測基因數(shù)量介于2 945～3 512個。根據(jù)生物信息學(xué)比對分析，發(fā)現(xiàn)不同嗜肺軍團(tuán)菌基因組中有80%左右的基因同源，只有10%左右的基因為菌株特異性。研究發(fā)現(xiàn)，這些菌株特異性基因組區(qū)域的GC含量與全基因組平均GC含量存在較大差異，例如費城1型株特異性基因組到包含一個trb/tra區(qū)域和若干外排泵基因[24]。推測這些區(qū)域可能是通過種間的基因水平傳播獲得[25]。而對于嗜肺軍團(tuán)菌的核心區(qū)域編碼，基本與感染宿主、復(fù)制等過程相關(guān)，這些核心區(qū)域高度保守[26]。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，嗜肺軍團(tuán)菌共有四大譜系，但各種譜系與菌株分離的地理位置以及流行性并不相關(guān)[26-27]。以上實驗說明嗜肺軍團(tuán)菌具有高度多樣性，目前難以從基因組水平判斷某種嗜肺軍團(tuán)菌的感染能力。

4. 嗜肺軍團(tuán)菌毒力因子研究進(jìn)展： 嗜肺軍團(tuán)菌不僅具有多種傳統(tǒng)的細(xì)菌毒力因子，例如脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)、鞭毛(flagellum)、Ⅱ型分泌系統(tǒng)和外膜蛋白等，還能夠利用Dot/Icm Ⅳ型分泌系統(tǒng)向真核宿主細(xì)胞內(nèi)傳遞將近300種效應(yīng)蛋白，并影響宿主生理活動。下面對這種嗜肺軍團(tuán)菌特有且具有十分重要的分泌系統(tǒng)的研究進(jìn)展進(jìn)行簡要概述。

目前研究發(fā)現(xiàn)，Dot/Icm Ⅳ型分泌系統(tǒng)組分幾乎參與了胞內(nèi)生存嗜肺軍團(tuán)菌的各種生理活動，例如嗜肺軍團(tuán)菌進(jìn)出宿主細(xì)胞、胞內(nèi)復(fù)制、LCV形成、甚至能夠抑制宿主細(xì)胞凋亡。該系統(tǒng)分為兩個致病域，其中Ⅰ區(qū)由dotDCB和dotA-icmVWX基因編碼[28]，Ⅱ區(qū)由18個不同型的dot和icm基因編碼[29]。Dot/Icm Ⅳ型分泌系統(tǒng)組成的跨膜蛋白在嗜肺軍團(tuán)菌表面形成一種類似菌毛的結(jié)構(gòu)，能夠插入宿主細(xì)胞質(zhì)膜和LCV膜進(jìn)而傳送多種效應(yīng)蛋白。例如LidA，作為該分泌系統(tǒng)最早鑒定的效應(yīng)分子，與Rab的捕獲識別相關(guān)，能夠識別包括Rab1、Rab6和Rab8在內(nèi)的多種Rabs[30-31]。SidM分子能夠?qū)Ｒ恍宰R別Rab1分子，具有3個結(jié)構(gòu)域，其中N端結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)修飾Rab1，C端參與該分子與LCV膜的錨定作用[32-33]?？傊?，Dot/Icm Ⅳ型分泌系統(tǒng)在利用宿主細(xì)胞調(diào)控囊泡轉(zhuǎn)運、形成LCV，進(jìn)而逃避降解、抑制宿主細(xì)胞凋亡并參與復(fù)制中均起到了關(guān)鍵性作用。

5. 嗜肺軍團(tuán)菌感染的免疫應(yīng)答

(1) 嗜肺軍團(tuán)菌感染的固有免疫應(yīng)答： 軍團(tuán)菌感染的各種動物模型中發(fā)現(xiàn)豚鼠對嗜肺軍團(tuán)菌易感，氣溶膠暴露3 d即可出現(xiàn)軍團(tuán)菌感染的癥狀[34]，但是絕大多數(shù)小鼠卻對除長灘軍團(tuán)菌(L.longbeachae)之外的軍團(tuán)菌產(chǎn)生天然抵抗，而這為研究對軍團(tuán)菌的免疫應(yīng)答提供了有利條件。研究發(fā)現(xiàn)對軍團(tuán)菌高度抵抗的C57BL6小鼠13號染色體中l(wèi)gn1位點存在一系列高度多態(tài)性的重復(fù)序列，其中包括神經(jīng)元細(xì)胞凋亡蛋白(Naip)，和棒狀病毒IPA(Birc1)都與嗜肺軍團(tuán)菌易感性相關(guān)[35-37]。Naip5是一種細(xì)胞內(nèi)鞭毛蛋白識別分子,一旦巨噬細(xì)胞吞嗜肺軍團(tuán)菌，Naip5會立刻激活caspase-1，進(jìn)而導(dǎo)致IL-1β產(chǎn)生，并促進(jìn)LCV與溶酶體融合，最終將嗜肺軍團(tuán)菌降解[37]。同時發(fā)現(xiàn)Naip5的敲除能夠逆轉(zhuǎn)對嗜肺軍團(tuán)菌在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的限制作用[38-39]。一項最新的研究發(fā)現(xiàn)，MyD88，一種Toll樣受體的配體分子的敲除，能夠增加小鼠肺內(nèi)嗜肺軍團(tuán)菌載量，降低嗜肺軍團(tuán)菌感染小鼠的生存率[40]。

雖然小鼠感染模型研究已比較透徹，但是對人感染嗜肺軍團(tuán)菌的固有免疫應(yīng)答仍知之甚少。在一項回顧性分析研究中發(fā)現(xiàn)，嗜肺軍團(tuán)菌感染患者的IFN-γ水平比非軍團(tuán)菌感染患者低[41]，提示IFN-γ產(chǎn)生能力降低，與嗜肺軍團(tuán)菌的易感性相關(guān)。軍團(tuán)菌感染后宿主細(xì)胞以釋放Th1型細(xì)胞因子以限制軍團(tuán)菌的復(fù)制[42]。此外對于軍團(tuán)菌易感人群的研究中發(fā)現(xiàn)，TLR多態(tài)性是軍團(tuán)菌感染的獨立風(fēng)險因素，TLR5在392位為終止密碼子的TLR5392STOP型在人群中的比例大約為10%，但軍團(tuán)菌易感性卻顯著高于其他類型TLR5的人群[43]。

(2)嗜肺軍團(tuán)菌感染的適應(yīng)性免疫： 盡管多種炎癥反應(yīng)對于機(jī)體控制軍團(tuán)病的進(jìn)展十分重要，但是T細(xì)胞和B細(xì)胞對于清除感染依然不可或缺。例如：在小鼠體內(nèi)的研究發(fā)現(xiàn)，利用CD5或CD8 T細(xì)胞的單克隆抗體處理小鼠，能夠降低嗜肺軍團(tuán)菌感染小鼠的生存率，并且會極大的加速感染模型中軍團(tuán)菌的清除時間[44]，然而，對于上述免疫細(xì)胞如何被激活并產(chǎn)生保護(hù)作用的具體機(jī)制仍然知之甚少。小鼠骨髓來源的樹突細(xì)胞或巨噬細(xì)胞被嗜肺軍團(tuán)菌感染后能夠刺激CD4 T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ，同時發(fā)現(xiàn) CD4 T細(xì)胞的激活有賴于LCV的形成并且抑制與溶酶體的融合作用[45]。以上結(jié)果提示，雖然宿主內(nèi)的嗜肺軍團(tuán)菌存在于LCV中，但依然能夠為CD4 T細(xì)胞提成抗原。例如，感染嗜肺軍團(tuán)菌的小鼠，DC細(xì)胞能夠上調(diào)CX3CL1趨化因子，進(jìn)而誘導(dǎo)T細(xì)胞激活[46]。

在人類嗜肺軍團(tuán)菌感染的研究中已證實存在細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，但成果有限。根據(jù)臨床觀察發(fā)現(xiàn)，接受激素治療和艾滋病，以及某些類型的血液疾病是罹患軍團(tuán)菌病的風(fēng)險因素[47]。

二、 嗜肺軍團(tuán)菌檢測技術(shù)進(jìn)展

1. 傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)法： 軍團(tuán)菌的分離培養(yǎng)是軍團(tuán)病確診以及流行病學(xué)研究的金標(biāo)準(zhǔn)，該方法是利用了嗜肺軍團(tuán)菌在GVPC和BCYE瓊脂平板上生長，但在L-半胱氨酸缺失的BCYE瓊脂平板上不生長這一特點，再經(jīng)進(jìn)一步生化試驗和血清學(xué)實驗進(jìn)行確認(rèn)的技術(shù)。菌落一般呈灰白色，偶見紫色或藍(lán)綠色。雖然該方法檢測周期長，不利于現(xiàn)場快速診斷，但該技術(shù)結(jié)果可靠，而且對于獲得軍團(tuán)菌完整信息，例如研究其基因背景、耐藥性或分子分型依然十分必要。

2. 免疫學(xué)檢測技術(shù)： 抗體檢測：患者體內(nèi)特異性IgM能夠作為軍團(tuán)菌感染的早期診斷依據(jù)，常用的檢測方法包括間接凝血實驗(indirect hemagglutination, IHA)、酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)、微量凝集實驗(micro agglutination experiment, MAT)等，其中IHA可以診斷嗜肺軍團(tuán)菌1-4型血清型的抗體；ELISA用于檢測軍團(tuán)病疑似患者體內(nèi)特異性IgG水平，常用于流行病學(xué)回顧性分析[48]。雖然免疫學(xué)檢測受限于患者免疫狀態(tài)，并且存在與其他病原體交叉的情況，尤其是難以對急性感染和既往感染進(jìn)行鑒別，不過，抗體檢測技術(shù)操作簡便，目前仍在使用。

抗原檢測：通過對疑似患者呼吸道分泌物進(jìn)行直接免疫熒光檢測，能夠快速特異的檢測，但該技術(shù)靈敏度低，與某些致病菌(例如銅綠假單胞菌)存在交叉反應(yīng)。此外，尿抗原是臨床上常用的軍團(tuán)菌檢測方法，該方法檢測靶點為軍團(tuán)菌細(xì)胞壁的熱穩(wěn)定性LPS。由于軍團(tuán)菌尿抗原會在感染后1 d即可檢出并持續(xù)若干天，目前已有多種尿抗原檢測產(chǎn)品評價的論文發(fā)表[49]。該技術(shù)操作簡單，樣本易獲取，可用于早期診斷，但該技術(shù)目前只能對嗜肺軍團(tuán)菌1型血清型進(jìn)行檢測，且成本較高。

3. 基于脂肪酸檢測技術(shù)進(jìn)展： 脂肪酸分型技術(shù)是根據(jù)微生物短鏈脂肪酸(C9-C10)種類和含量的特異性與多樣性，利用氣相色譜儀對微生物短鏈脂肪酸進(jìn)行鑒定，并與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，從而快速準(zhǔn)確的對微生物進(jìn)行鑒定和分型的新技術(shù)[50]。目前該技術(shù)獲得美國CDC和FDA認(rèn)證，具有較高的應(yīng)用價值。但該方法只能對分離得到的菌株進(jìn)行檢測，而無法對環(huán)境或臨床樣本直接檢測。

4. 核酸水平檢測技術(shù)進(jìn)展

(1)基于PCR的檢測技術(shù)： PCR是一種可靠的核酸擴(kuò)增技術(shù)，對于嗜肺軍團(tuán)菌，常利用mip基因和16S rRNA作為靶基因進(jìn)行檢測，mip基因具有嗜肺軍團(tuán)菌種特異性；而16S rRNA基因不僅可以用于嗜肺軍團(tuán)菌的特異性檢測，而且能夠?qū)妶F(tuán)屬進(jìn)行鑒別[51]。目前常用熒光定量PCR對臨床及環(huán)境樣本直接檢測，具有快速靈敏的特點，而且是目前除分離培養(yǎng)技術(shù)之外唯一被寫入標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)規(guī)范的檢測方法。

(2) 基于等溫擴(kuò)增的檢測技術(shù)： 等溫擴(kuò)增技術(shù)也屬于核酸擴(kuò)增技術(shù)，種類較多、發(fā)展迅速。由于擴(kuò)增溫度恒定而不需要依賴PCR儀，具有簡便、快速、靈敏的特點更加適用于現(xiàn)場快速檢測，目前主流技術(shù)包括NASBA、HAD、RCA和LAMP技術(shù)。由于LAMP技術(shù)成本較低，目前國內(nèi)外多家體外診斷試劑公司已成功開發(fā)除軍團(tuán)菌檢測試劑盒并上市。雖然等溫擴(kuò)增技術(shù)原理復(fù)雜，但是操作簡單，有利于推廣應(yīng)用[52]。

(3)基于探針雜交的檢測技術(shù)進(jìn)展： 利用探針雜交技術(shù)應(yīng)用于軍團(tuán)菌的檢測，具有一定前景，由于可將探針連接在芯片上從而實現(xiàn)高通量檢測，同時不僅能夠?qū)妶F(tuán)菌的屬、種進(jìn)行鑒定和鑒別，同時還能夠了解軍團(tuán)菌的毒力基因和耐藥基因等遺傳背景信息。該技術(shù)的高通量特點極大節(jié)省了人力，但由于操作復(fù)雜，依賴復(fù)雜的儀器設(shè)備和人員數(shù)據(jù)處理能力，目前尚未普及。

(4)基于二代測序的檢測技術(shù)進(jìn)展: 二代測序是相對于焦磷酸法測序(一代)而言的高通量測序技術(shù)，目前市場上主流使用的是Illumina公司生產(chǎn)的各型號測序平臺以，而羅氏公司的454測序儀已經(jīng)退出市場。二代測序平均讀長約為幾百bp，可以通過提高測序深度達(dá)到提高分辨率和靈敏度的目的。二代測序的問世極大降低了每個堿基測序成本，為深入進(jìn)行軍團(tuán)菌的基因組、轉(zhuǎn)錄水平研究提供了有力工具[53]。此外基于16S的測序也為嗜肺軍團(tuán)菌所處環(huán)境的菌群研究提供了技術(shù)保證。

雖然嗜肺軍團(tuán)菌屬于環(huán)境微生物，但它能夠在真核細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，并且逃避宿主免疫系統(tǒng)攻擊而導(dǎo)致嚴(yán)重的肺炎。隨著高通量測序技術(shù)的推廣，越來越多軍團(tuán)菌菌種以及它們的毒力因子和效應(yīng)蛋白被發(fā)現(xiàn)，極大地加深了人們對該物種的了解，提高了對嗜肺軍團(tuán)菌胞內(nèi)復(fù)制、毒力分泌和侵襲的認(rèn)識。這必將有助于人們理解嗜肺軍團(tuán)菌的進(jìn)化方式和流行病學(xué)特征，也必將有助于開發(fā)新型軍團(tuán)菌檢測技術(shù)和軍團(tuán)病的治療方法，對于控制嗜肺軍團(tuán)菌在人群中的爆發(fā)和傳播提供有力保障！

1 Fraser DW, Tsai TR, Orenstein W, et al.Legionnaires′ disease: description of an epidemic of pneumonia[J]. N Engl J Med, 1977, 297(22): 1189-197.

2 Brenner DJ, Steigerwalt AG, McDade JE. Classification of theLegionnaires′disease bacterium:Legionellapneumophila, genus novum, species nova, of the familyLegionellaceae, familia nova[J]. Ann Intern Med, 1979, 90(4): 656-658.

3 Yu VL, Plouffe JF, Pastoris MC, et al. Distribution ofLegionellaspecies and serogroups isolated by culture in patients with sporadic community-acquired legionellosis: an international collaborative survey[J]. J Infect Dis, 2002, 186(1): 127-128.

4 Muder RR, Yu VL. Infection due to Legionella species other than L. pneumophila[J]. Clin Infect Dis, 2002, 35(8): 990-998.

5 康曉明, 湯忠群, 夏錫榮. 嗜肺軍團(tuán)菌感染1例報告[J]. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志, 1982, 7(4): 240.

6 Garin J, Diez R, Kieffer S, et al.The phagosome proteome: insight into phagosome functions[J]. J Cell Biol, 2001, 152(1): 165-180.

7 Kagan JC, Roy CR.Legionellaphagosomesintercept vesicular traffic from endoplasmic reticulum exit sites[J]. Nat Cell Biol, 2002, 4(12): 945-954.

8 Horwitz MA. TheLegionnaires′ disease bacterium (Legionellapneumophila)inhibits phagosome-lysosome fusion in human monocytes[J]. J Exp Med, 1983, 158(6): 2108-2126.

9 Abu Kwaik Y, Gao LY, Harb OS, et al. Transcriptional regulation of the macrophage-induced gene (gspA) ofLegionellapneumophilaand phenotypic characterization of a null mutant[J]. Mol Microbiol, 1997, 24(3): 629-642.

10 Sturgill-Koszycki S, Swanson MS.Legionellapneumophilareplication vacuoles mature into acidic, endocytic organelles[J]. J Exp Med, 2000, 192(9): 1261-1272.

11 Kagan JC, Stein MP, Pypaert M, et al.Legionellasubvertthe functions of Rab1 and Sec22b to create a replicative organelle[J]. J Exp Med, 2004, 199(9): 1201-1211.

12 Dorer MS, Kirton D, Bader JS, et al. RNA interference analysis ofLegionellain Drosophila cells: exploitation of early secretory apparatus dynamics[J]. PLoS Pathog, 2006, 2(4): e34.

13 Amer AO, Swanson MS. Autophagy is an immediate macrophage response toLegionellapneumophila[J]. Cell Microbiol, 2005, 7(6): 765-778.

14 Otto GP, Wu MY, Clarke M, et al. Macroautophagy is dispensable for intracellular replication ofLegionellapneumophilain Dictyostelium discoideum[J]. Mol Microbiol, 2004, 51(1): 63-72.

15 Bozue JA, Johnson W. Interaction ofLegionellapneumophilawithAcanthamoebacastellanii: uptake by coiling phagocytosis and inhibition of phagosome-lysosome fusion[J]. Infect Immun, 1996, 64(2): 668-673.

16 Watarai M, Derre I, Kirby J, et al.Legionellapneumophilais internalized by a macropinocytotic uptake pathway controlled by the Dot/Icm system and the mouse Lgn1 locus[J]. J Exp Med, 2001, 194(8): 1081-1096.

17 Weinbaum DL, Benner RR, Dowling JN, et al. Interaction ofLegionellamicdadeiwith human monocytes [J]. Infect Immun, 1984, 46(1): 68-73.

18 Khelef N, Shuman HA, Maxfield FR. Phagocytosis of wild-typeLegionellapneumophilaoccurs through a wortmannin-insensitive pathway[J]. Infect Immun, 2001, 69(8): 5157-5161.

19 Garduno RA, Garduno E, Hiltz M, et al. Intracellular growth ofLegionellapneumophilagives rise to a differentiated form dissimilar to stationary-phase forms[J]. Infect Immun, 2002, 70(11): 6273-6283.

20 Newton HJ, Sansom FM, Dao J, et al. Significant role for ladC in initiation ofLegionellapneumophilainfection[J]. Infect Immun, 2008, 76(7): 3075-3085.

21 McCusker KT, Braaten BA, Cho MW, et al.Legionellapneumophilainhibits protein synthesis in Chinese hamster ovary cells[J]. Infect Immun, 1991, 59(1): 240-246.

22 Liu M, Conover GM, Isberg RR.LegionellapneumophilaEnhC is required for efficient replication in tumour necrosis factor alpha-stimulated macrophages[J]. Cell Microbiol, 2008, 10(9): 1906-1923.

23 Chong A, Lima CA, Allan DS, et al. The purified and recombinantLegionellapneumophilachaperonin alters mitochondrial trafficking and microfilament organization[J]. Infect Immun, 2009, 77(11): 4724-4739.

24 Brassinga AK, Hiltz MF, Sisson GR, et al. A 65-kilobase pathogenicity island is unique to Philadelphia-1 strains ofLegionellapneumophila[J]. J Bacteriol, 2003, 185(15): 4630-4637.

25 Cazalet C, Rusniok C, Bruggemann H, et al. Evidence in theLegionellapneumophilagenome for exploitation of host cell functions and high genome plasticity[J]. Nat Genet, 2004, 36(11): 1165-1173.

26 Cazalet C, Jarraud S, Ghavi-Helm Y, et al. Multigenome analysis identifies a worldwide distributed epidemicLegionellapneumophilaclone that emerged within a highly diverse species[J]. Genome Res, 2008, 18(3): 431-441.

27 Gomez-Valero L, Rusniok C, Buchrieser C.Legionellapneumophila:population genetics, phylogeny and genomics[J]. Infect Genet Evol, 2009, 9(5): 727-739.

28 Matthews M, Roy CR. Identification and subcellular localization of theLegionellapneumophilaIcmX protein: a factor essential for establishment of a replicative organelle in eukaryotic host cells[J]. Infect Immun, 2000, 68(7): 3971-3982.

29 Vogel JP, Andrews HL, Wong SK, et al. Conjugative transfer by the virulence system ofLegionellapneumophila[J]. Science, 1998, 279(5352): 873-876.

30 Brombacher E, Urwyler S, Ragaz C, et al. Rab1 guanine nucleotide exchange factor SidM is a major phosphatidylinositol 4-phosphate-binding effector protein ofLegionellapneumophila[J]. J Biol Chem, 2009, 284(8): 4846-4856.

31 Derre I, Isberg RR. LidA, a translocated substrate of theLegionellapneumophilatype IV secretion system, interferes with the early secretory pathway[J]. Infect Immun, 2005, 73(7): 4370-4380.

32 Akhter A, Gavrilin MA, Frantz L, et al. Caspase-7 activation by the Nlrc4/Ipaf inflammasome restrictsLegionellapneumophilainfection[J]. PLoS Pathog, 2009, 5(4): e1000361.

33 Brombacher E, Urwyler S, Ragaz C, et al. Rab1 guanine nucleotide exchange factor SidM is a major phosphatidylinositol 4-phosphate-binding effector protein ofLegionellapneumophila[J]. J Biol Chem, 2009, 284(8): 4846-4856.

34 Baskerville A, Fitzgeorge RB, Broster M, et al. Experimental transmission of legionnaires′disease by exposure to aerosols ofLegionellapneumophila[J]. Lancet, 1981, 2(8260-61): 1389-1390.

35 Growney JD, Dietrich WF. High-resolution genetic and physical map of the Lgn1 interval in C57BL/6J implicates Naip2 or Naip5 inLegionellapneumophilapathogenesis[J]. Genome Res, 2000, 10(8): 1158-1171.

36 Dietrich WF, Damron DM, Isberg RR, et al. Lgn1, a gene that determines susceptibility toLegionellapneumophila, maps to mouse chromosome 13[J]. Genomics, 1995, 26(3): 443-450.

37 Zamboni DS, Kobayashi KS, Kohlsdorf T, et al. The Birc1e cytosolic pattern-recognition receptor contributes to the detection and control ofLegionellapneumophilainfection[J]. Nat Immunol, 2006, 7(3): 318-325.

38 Amer A, Franchi L, Kanneganti TD, et al. Regulation ofLegionellaphagosomematuration and infection through flagellin and host Ipaf[J]. J Biol Chem, 2006, 281(46): 35217-35223.

39 Molofsky AB, Byrne BG, Whitfield NN, et al. Cytosolic recognition of flagellin by mouse macrophages restrictsLegionellapneumophilainfection[J]. J Exp Med, 2006, 203(4): 1093-1104.

40 Archer KA, Alexopoulou L, Flavell RA, et al. Multiple MyD88-dependent responses contribute to pulmonary clearance ofLegionellapneumophila[J]. Cell Microbiol, 2009, 11(1): 21-36.

41 Lettinga KD, Weijer S, Speelman P, et al. Reduced interferon-gamma release in patients recovered fromLegionnaires′ disease[J]. Thorax, 2003, 58(1): 63-67.

42 Watanabe M, Shimamoto Y, Yoshida S, et al. Intracellular multiplication ofLegionellapneumophilain HL-60 cells differentiated by 1,25-dihydroxyvitamin D3 and the effect of interferon gamma[J]. J Leukoc Biol, 1993, 54(1): 40-46.

43 Hawn TR, Verbon A, Lettinga KD, et al. A common dominant TLR5 stop codon polymorphism abolishes flagellin signaling and is associated with susceptibility toLegionnaires′ disease[J]. J Exp Med, 2003, 198: 1563-1572.

44 Susa M, Ticac B, Rukavina T, et al.Legionellapneumophilainfection in intratracheally inoculated T cell-depleted or-nondepleted A/J mice[J]. J Immunol, 1998, 160(10): 316-321.

45 Neild AL, Shin S, Roy CR. Activated macrophages infected withLegionellainhibit T cells by means of MyD88-dependent production of prostaglandins[J]. J Immunol, 2005, 175(12): 8181-8190.

46 Kikuchi T, Andarini S, Xin H, et al. Involvement of fractalkine/CX3CL1 expression by dendritic cells in the enhancement of host immunity againstLegionellapneumophila[J]. Infect Immun, 2005, 73(9): 5350-5357.

47 Higa F, Fujita J, Koide M, et al. Clinical features of two cases ofLegionnaires′ disease with persistence of Legionella urinary antigen excretion[J]. Intern Med, 2008, 47(3): 173-178.

48 Malan AK, Martins TB, Jaskowski TD, et al. Comparison of two commercial enzyme-linked immunosorbent assays with an immunofluorescence assay for detection ofLegionellapneumophilatypes 1 to 6[J]. J Clin Microbiol, 2003, 41(7): 3060-3063.

49 Bruin JP, Diederen BM. Evaluation of Meridian TRU Legionella(R),a new rapid test for detection ofLegionellapneumophilaserogroup 1 antigen in urine samples[J]. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2013, 32(3): 333-334.

50 王崢, 陳經(jīng)雕, 宋曼丹, 等. 廣東地區(qū)空調(diào)冷卻塔水嗜肺軍團(tuán)菌分離株脂肪酸分型研究[J]. 中國病原生物學(xué)雜志, 2011, 6(6): 424-427.

51 Fard SY, Nomanpour B, Fatolahzadeh B, et al. Hospital acquired pneumonia: comparison of culture and real-time PCR assays for detection ofLegionellapneumophilafrom respiratory specimens at Tehran hospitals[J]. Acta Microbiol Immunol Hung, 2012, 59(3): 355-365.

52 Lu X, Mo ZY, Zhao HB, et al. LAMP-based method for a rapid identification ofLegionellaspp. andLegionellapneumophila[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2011, 92(1): 179-187.

53 Graham RM, Doyle CJ, Jennison AV. Real-time investigation of aLegionellapneumophilaoutbreak using whole genome sequencing[J]. Epidemiol Infect, 2014, 142(11): 2347-2351.