李鰲 閆洪鋒 孫宏偉 崔彥,

環(huán)狀RNA或稱環(huán)形RNA(circular RNA,circRNA)是存在于生物體內(nèi)的一類特殊非編碼RNA(non-coding RNA,ncRNA)分子,該分子最早由Sanger等[1]于1976年發(fā)現(xiàn)。最初被認(rèn)是錯(cuò)誤剪接、遺傳意外、甚或?qū)嶒?yàn)人為因素等所致的一種副產(chǎn)品,并未引起學(xué)術(shù)界關(guān)注[2-3]。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn),circRNA相對(duì)穩(wěn)定,廣泛存在于真核細(xì)胞生物中,推測(cè)其極有可能屬于轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,相關(guān)研究遂逐漸興起,成為繼微小RNA(microRNA,miRNA)和長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lncRNA)之后的又一研究焦點(diǎn)[4-5]。隨著RNA測(cè)序(RNA sequencing,RNA-seq)等生物信息學(xué)技術(shù)的廣泛發(fā)展和應(yīng)用,遍布生物體內(nèi)且功能多樣的circRNA被發(fā)現(xiàn),引起學(xué)術(shù)界的廣泛興趣[5-6]。筆者對(duì)circRNA的生成、生物學(xué)功能、作用機(jī)理及其與疾病關(guān)系的研究進(jìn)展作一綜述。

一、circRNA的生成及種類

通常情況下,生命信息通過DNA將遺傳信息轉(zhuǎn)錄給前體mRNA,后者通過剪除非編碼信息內(nèi)含子序列,將有編碼功能的外顯子序列剪輯形成線性RNA分子,經(jīng)轉(zhuǎn)錄后翻譯,生成功能蛋白質(zhì)而參與生命過程。真核生物通常經(jīng)過調(diào)控可變剪接,由一個(gè)基因編碼形成多種功能各異的RNA從而生成不同的蛋白產(chǎn)物;另外還可通過反向可變剪接途徑使基因外顯子序列反向首尾連接而生成circRNA。circRNA的環(huán)化機(jī)制包括外顯子環(huán)化和內(nèi)含子環(huán)化,通常由可變剪接產(chǎn)生的前體mRNA(pre-mRNA)通過核酸分子間的閉合鍵構(gòu)成單鏈環(huán)形結(jié)構(gòu),形成包含1～5個(gè)外顯子或1～2個(gè)內(nèi)含子的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物[5-8]。

circRNA的外顯子環(huán)化包括套索驅(qū)動(dòng)環(huán)化(lariat-driven circularization)和內(nèi)含子配對(duì)驅(qū)動(dòng)環(huán)化(intron-pairing-driven circularization)兩種模式。前者與線性pre-mRNA正向剪接相反,即在可變剪切過程中,外顯子跳躍(exon skipping),pre-mRNA的下游外顯子SD的3’剪接供體(spice donor)共價(jià)結(jié)合到上游外顯子SA的5’剪接受體(spice acceptor),形成套索結(jié)構(gòu)。隨后切除內(nèi)含子,促進(jìn)了序列成環(huán),形成具有兩外顯子的circRNA。在后一種模式中,由兩個(gè)內(nèi)含子依照堿基互補(bǔ)配對(duì)規(guī)則形成環(huán)狀結(jié)構(gòu),然后切除內(nèi)含子,形成circRNA[9]。僅由外顯子構(gòu)成的circRNA稱為exonic circRNA,主要定位于細(xì)胞質(zhì)中,而由內(nèi)含子構(gòu)成的circRNA稱為intronic circRNA。內(nèi)含子環(huán)化過程主要發(fā)生在細(xì)胞核中,有賴于含有鄰近5’剪接位點(diǎn)7個(gè)核苷酸GU富集元件和分支點(diǎn)11個(gè)核苷酸C富集元件而形成[10-11]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)環(huán)化外顯子之間有保留內(nèi)含子的現(xiàn)象,即外顯子-內(nèi)含子circRNA(exon-intron circRNA or EIciRNA)[12],其機(jī)制尚未明確。

二、circRNA的特征

circRNA廣泛存在于自然界生物體內(nèi),人類及其他多種原核及真核生物體內(nèi)均含有豐富而種類眾多的circRNA。研究發(fā)現(xiàn),在母基因轉(zhuǎn)錄本中circRNA約占5%～10%,與線性RNA相比,circRNA在體內(nèi)的含量可達(dá)前者的20倍。有學(xué)者指出,circRNA是比mRNA豐度更高、更為主要的轉(zhuǎn)錄本[10,13-14]。

circRNA大部分來(lái)源于外顯子,少部分來(lái)源于內(nèi)含子,具有高度穩(wěn)定性,不易被核酸外切酶RNase R(Ribonuclease R,RNase R)降解,卻可以被小型干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)降解[9]。

circRNA具有高度的組織時(shí)序特異性。研究證實(shí),在乳腺癌細(xì)胞系MCF-7中DOCK1基因circRNA高度表達(dá),而在肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549中則幾乎不表達(dá)[15]。Li等[16]研究證實(shí),在線蟲胚胎細(xì)胞發(fā)育的不同時(shí)期,環(huán)狀RNA種類完全不同[15]。另有學(xué)者使用原位熒光雜交技術(shù)觀察到在細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)中circRNA的高度聚集性,如ciRS-7聚集在細(xì)胞質(zhì)中,而circEIF4J和ci-ankrd52則聚集于細(xì)胞核內(nèi)[17-18]。

circRNAs具有很強(qiáng)的保守性。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),在人體成纖維細(xì)胞中有2000余種circRNAs可與小鼠基因組匹配,其中近1/3的小鼠基因能產(chǎn)生相同的circRNAs[9]。

三、circRNA的功能

1.circRNA具有mRNA分子海綿作用:circRNA與microRNA、lncRNA均含有大量的mRNA應(yīng)答元件,均屬于競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)。

circRNA作為一種ceRNA,充當(dāng)miRNA“海綿”,抑制microRNA的負(fù)性調(diào)控作用,提高靶基因功能活性[18]。研究發(fā)現(xiàn),在人和鼠腦組織中,有一種circRNA稱之為小腦變性相關(guān)蛋白1反義轉(zhuǎn)錄物(antisense tothe cerebellar degeneration- related protein 1 transcript,CDR1as),包含74個(gè)miR-7結(jié)合位點(diǎn),充當(dāng)miR-7a/b的海綿樣作用,對(duì)miR-7起負(fù)調(diào)控作用。若CDR1as過表達(dá),則與miR-7結(jié)合,提升miR-7靶基因表達(dá)水平;如CDR1as表達(dá)受到抑制,則miR-7靶基因表達(dá)水平下降[20-21]。Ashwal-Fluss等[22]通過熒光素酶篩選試驗(yàn)插入miR-7靶點(diǎn)或整個(gè)ciRS-7序列到海腎熒光素酶的3’非翻譯區(qū)(UTR)監(jiān)測(cè)miR-7活性,發(fā)現(xiàn)miR-7和ciRS-7表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染熒光素酶報(bào)告基因的擊倒?jié)摿︼@著降低,而非circRNA產(chǎn)生載體ciRS-7-ir對(duì)敲擊作用不大。Zheng等[23]研究證實(shí),當(dāng)熒光素酶報(bào)告基因發(fā)生突變時(shí),microRNA轉(zhuǎn)染對(duì)熒光素酶活性無(wú)明顯影響,同時(shí)發(fā)現(xiàn),circHIPK3直接結(jié)合并抑制microRNA-124活性,對(duì)9個(gè)microRNAs和18個(gè)潛在microRNA結(jié)合位點(diǎn)具有海綿調(diào)節(jié)作用。Xue等[24]研究HaCaT細(xì)胞中circRNA表達(dá)及作用,發(fā)現(xiàn)circ100284通過miR-217海綿作用,調(diào)控亞砷酸鹽對(duì)HaCaT細(xì)胞的增生周期和惡性轉(zhuǎn)化過程。

2.circRNA調(diào)控可變剪切:circRNA通過特殊可變剪切而生成,其生物發(fā)生和規(guī)范剪接之間存在著激烈的競(jìng)爭(zhēng)。攜帶circRNA外顯子和側(cè)翼內(nèi)含子的小基因能有效生成circRNA,而引入攜帶強(qiáng)50和30個(gè)拼接位點(diǎn)的側(cè)翼外顯子則顯著降低果蠅Luna小基因的環(huán)化效率,顯示了外顯子環(huán)化和剪接之間的激烈競(jìng)爭(zhēng)[17,22,25]。研究發(fā)現(xiàn),提升果蠅和人細(xì)胞內(nèi)的有效線性剪接會(huì)導(dǎo)致circRNA生成減少,說(shuō)明外顯子環(huán)化與經(jīng)典pre-mRNA線性剪接之間存在一種競(jìng)爭(zhēng)及平衡關(guān)系[22]。一系列研究結(jié)果表明,circRNA具有調(diào)節(jié)pre-mRNA剪接進(jìn)而影響蛋白質(zhì)生成的作用。

3.circRNA與蛋白質(zhì)有特殊關(guān)聯(lián)作用:研究證實(shí),circRNA可與相關(guān)蛋白結(jié)合形成復(fù)合體,抑制相應(yīng)功能蛋白的活性,如此而發(fā)揮生物調(diào)控功能[21-22]。Du等[26]研究發(fā)現(xiàn),CDK2和p21可能與circ-Foxo3結(jié)合,形成circ-Foxo3-p21-CDK2三元復(fù)合物與p2一起劫持CDK2,避免形成細(xì)胞周期蛋白E/CDK2復(fù)合物,因此阻斷了S期細(xì)胞周期,并通過與應(yīng)激和衰老相關(guān)蛋白結(jié)合而促進(jìn)細(xì)胞衰老。Yang等[27]研究證明,circRNA circotin1通過circ-Amotl1增強(qiáng)Stat3的核易位發(fā)生細(xì)胞活性增加,Nu3明確Stat3可以綁定到Dnmt3a啟動(dòng)子,促進(jìn)轉(zhuǎn)錄和翻譯Dnmt3a,進(jìn)而影響相關(guān)靶標(biāo)的蛋白質(zhì)表達(dá),這些蛋白質(zhì)的表達(dá)增加促進(jìn)了細(xì)胞增殖、存活、粘附和遷移,具有加速創(chuàng)面修復(fù)的作用。

4.circRNA調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄:circRNA有別于傳統(tǒng)線性RNA,具有閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu),大量存在于真核轉(zhuǎn)錄組中。一系列研究結(jié)果表明,細(xì)胞核中含有豐富的circRNA分子,可與 RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄復(fù)合體結(jié)合,對(duì)RNA包括其母系基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)控,進(jìn)而影響母系基因及其靶基因的表達(dá)[16-17,28]。

5.circRNA具有潛在翻譯功能:研究發(fā)現(xiàn),circRNA在人骨肉瘤細(xì)胞中發(fā)揮一定的翻譯功能[29];circRNA在大腸桿菌和人類細(xì)胞中能夠通過滾圓擴(kuò)增(rolling circle amplification,RCA)機(jī)理進(jìn)行有效翻譯,產(chǎn)生大量蛋白產(chǎn)物[30]。從目前情況看,有關(guān)circRNA的翻譯功能尚未完全清楚,有待進(jìn)一步研究。

四、circRNA與疾病

近年來(lái)的研究表明,circRNA與動(dòng)脈粥樣硬化[31]、糖尿病[32]、神經(jīng)系統(tǒng)疾病[33]、血管生成[34]等密切相關(guān),參與疾病與生理過程的調(diào)控。盡管對(duì)于這些生物分子的表達(dá)機(jī)制認(rèn)識(shí)有限,但研究發(fā)現(xiàn)數(shù)百種circRNA與人類多種腫瘤有關(guān),包括肺癌、肝癌、胃癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、卵巢癌、腎癌和血液惡性腫瘤以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤[35]。這方面的研究方興未艾,有可能對(duì)揭示疾病機(jī)制和發(fā)現(xiàn)診療靶標(biāo)具有重要意義。

五、展望

與lnRNA和miRNA相比,circRNA作為RNA家族升起的一顆新星,關(guān)于其功能機(jī)制的探索尚待深入研究。相關(guān)研究已顯示出circRNA在應(yīng)用方面的潛能,譬如,有研究發(fā)現(xiàn)癌癥細(xì)胞外泌體中含有豐富的能在體液中檢測(cè)到的circRNAs[36];circRNA表達(dá)譜綜合分析顯示hsa-circ-0005075作為環(huán)狀RNA 生物標(biāo)記物,參與肝癌的發(fā)生發(fā)展,具有潛在的肝癌標(biāo)志物價(jià)值[37]。一系列研究表明,circRNA在遺傳、腫瘤等多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用,籍此認(rèn)為其有望成為新的診斷標(biāo)志物和治療靶標(biāo)[38-39]。這方面的研究方興未艾,有待深入探討。