曹廣超 劉春雨 劉 穎 劉玉慧 李梓欣 王集會(huì) 史 磊

(山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355；*山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，山東 濟(jì)南 250355)

蜣螂是鞘翅目金龜子科昆蟲屎殼螂CatharsiusmolssusLinnaeus的干燥全蟲，在全世界范圍分布十分廣泛。蜣螂性味咸寒，有毒，歸肝、胃、大腸經(jīng)，被列為活血、散瘀、通腸化結(jié)、消腫解毒之品，具有定驚、破淤、通便、攻毒之功效,常用于驚癇癲狂、大便秘結(jié)、淋病、各種癌癥、肝脾腫大等病癥治療[1，2]。蜣螂作為藥用最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，而后在歷代本草中多有記載。現(xiàn)代藥理研究表明：蜣螂具有抗癌的功效[3，4]，蜣螂的醇提取物對(duì)人體肝癌細(xì)胞有抑制作用，其有效成份主要分布在腿部[5]。為深入研究蜣螂粉不同酶提取物在抗腫瘤方面的抑制效果。本文以蜣螂凍干粉為底物，采用4種蛋白酶進(jìn)行水解，以蜣螂粉水提取物作為對(duì)照組，采用茚三酮法測(cè)定蛋白質(zhì)的水解度并利用MTT法研究水提物對(duì)肺腺癌細(xì)胞A549的抑制效果，評(píng)價(jià)4種蛋白酶對(duì)蜣螂粉的水解效果，研究蜣螂粉水提物的抗腫瘤方面的藥效。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器

半微量凱式定氮儀；UV9100B分光光度計(jì)(北京萊伯泰科儀器有限公司)；Memmert CO2培養(yǎng)箱(北京五洲東方科技發(fā)展有限公司)。

1.2 試劑

胰蛋白酶(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；彈性蛋白酶(上海源葉生物科技有限公司)；磷酸氫二鈉，磷酸二氫鉀(分析純，國(guó)藥集團(tuán)試劑有限公司)；RPMI-1640培養(yǎng)基、無水乙醇(AR)、胎牛血清(賽默飛世爾生物制品北京有限公司)；注射用順鉑(齊魯制藥有限公司)；MTT(武漢市蓋云天生物技術(shù)有限公司)；茚三酮(上海源聚生物科技有限公司)；磷酸氫二鈉，磷酸二氫鉀(分析純，國(guó)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑有限公司)。

1.3 藥材

本實(shí)驗(yàn)所使用的蜣螂粉，購(gòu)自山東臨沂市。(批號(hào)：20160701)

1.4 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

肺腺癌A549細(xì)胞株由山東省立醫(yī)院提供。

2 方 法

2.1 蜣螂粉的酶解工藝

精密稱取蜣螂粉5份，每份1.000 0 g，分別置100 mL具塞錐形瓶中，按料液比1∶40加入定量蒸餾水，超聲提取20 min，按表1進(jìn)行處理。抽濾后以3000 r/min離心10 min，定容至100 mL容量瓶得蜣螂酶解液。將酶解液平均分成兩份，一份用于蛋白質(zhì)水解度的測(cè)定，另一份經(jīng)干燥冷凍得凍干粉,用于做抗腫瘤藥理性試驗(yàn)。

表1 四種蛋白酶的水解條件Table 1 Hydrolysis conditions of four kinds of protease

2.2 氨基肽氮含量的測(cè)定

2.2.1茚三酮顯色劑的配制

精密稱取茚三酮0.5 g、果糖0.3 g、磷酸二氫鉀6 g、磷酸氫二鈉10 g，加入適量的蒸餾水溶解，定容至100 mL容量瓶中，以做備用。

2.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取0.100 0 g干燥失重過的甘氨酸為標(biāo)準(zhǔn)品，加適量蒸餾水溶解后定容至100 mL容量瓶中，然后取2 ml定容到100 mL容量瓶中，得到20 μg/mL的溶液。分別取1、2、3、4、5 mL加適量蒸餾水定容至10 mL容量瓶中，配制濃度分別為2,4,6,8,10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別從中取2 mL標(biāo)準(zhǔn)液于具塞試管中，加入1.00 mL新配制的顯色劑，同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn)，混合均勻后用沸水浴加熱15 min，冷水冷卻后加入5mL 40%的乙醇溶液，混合均勻后放置15 min，在570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A，繪制其標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2.3樣品含量測(cè)定

從“2.1”步驟中的5份蜣螂粉酶解液的容量瓶中，取適量定量地稀釋到適宜的濃度，按照“2.2.2”步驟中的方法測(cè)定樣品的吸光度A及繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算-NH2的含量，然后再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)，可以得水解液中總-NH2肽氮的含量。

2.3 水解度的測(cè)定

水解度[6](Degree of Hydrolysis，簡(jiǎn)稱DH)是指蛋白質(zhì)水解過程中被裂解的肽鍵數(shù)與給定蛋白質(zhì)總肽鍵數(shù)的比值。用茚三酮法按照2.2項(xiàng)下測(cè)定水解液中的游離氨基肽鍵含量和用半微量凱氏定氮法[7]測(cè)定原料中總氮量，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組，再按下式計(jì)算水解度。

水解度(DH) % =已水解的肽鍵數(shù)/原料中總肽鍵數(shù)×100%=[( B-C) / ( A-C)]×100%

A：原料中的總氮數(shù) B：水解液中的氨基氮數(shù) C：原料中游離的氨基氮數(shù)

2.4 MTT法測(cè)定水解物對(duì)的抑制率

2.4.1提取物溶液的配制

精密稱取原藥材2%的蜣螂凍干粉，溶解于10 mL 1640培養(yǎng)液，配成含有效成分2 mg/mL的初始濃度，在無菌條件下用0.22 μm的濾膜進(jìn)行過濾，然后用已濾菌的1640培養(yǎng)基依次進(jìn)行稀釋，配成2、1、0.5、0.25、0.125 mg/mL的藥物濃度梯度。

2.4.2細(xì)胞培養(yǎng)

①細(xì)胞復(fù)蘇[8]：從超低溫冰箱中取出凍存的肺腺癌細(xì)胞，迅速投入到預(yù)先加熱到37 ℃的滅菌水中，等待凍存液溶化，離心，收集細(xì)胞，然后用含10%胎牛血清的1640新鮮培養(yǎng)基在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。②接種：待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，以0.25%的胰酶細(xì)胞消化液(含0.02%EDTA)進(jìn)行消化，以每孔100 μL接種于96孔培養(yǎng)板，預(yù)留三個(gè)調(diào)零孔，調(diào)零孔只加不含血清的1640培養(yǎng)基，不加細(xì)胞，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.4.3MTT法測(cè)定細(xì)胞抑制率

待96孔板中的細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后，棄掉培養(yǎng)基，調(diào)零組、空白對(duì)照組分別加入100 μl不含血清的1640培養(yǎng)基，陽(yáng)性對(duì)照組加入100 μg/mL的順鉑100 μL，其他給藥組每孔分別加入不同濃度的藥物100 μL，每個(gè)濃度的藥物重復(fù)5個(gè)孔，其中以蜣螂水提液作為對(duì)照組。然后細(xì)胞在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后，每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL于培養(yǎng)箱內(nèi)避光反應(yīng)4 h。吸去上清液，加入100 μl DMSO，用酶標(biāo)儀在490 nm處測(cè)定OD值，按照下式計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞的抑制率。

細(xì)胞抑制率(%)=[1-(加藥組OD-調(diào)零組)/(空白組OD-調(diào)零組)]×100%

3 結(jié) 果

3.1 氨基肽氮含量的測(cè)定

3.1.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

在測(cè)定氨基酸肽氮的含量時(shí)，茚三酮法是一種非常靈敏的常用方法，用此方法與甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液顯色后，用紫外分光光度計(jì)在570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定一定濃度梯度的甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度A，然后以吸光度A為橫坐標(biāo)，甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量M1(μg)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為M1=22.017A+0.0452,r2=0.9993，又因甘氨酸的相對(duì)分子質(zhì)量為75.07，所以以吸光度為橫坐標(biāo)，以-NH2的質(zhì)量M2(μg)為縱坐標(biāo)，其回歸方程為M2=46.925A+0.0964,r2=0.9993。

3.1.2樣品含量測(cè)定結(jié)果見表2

表2 水解液中氨基肽氮的含量Table 2 Content of amino nitrogen in Hydrolysate

由表2的數(shù)據(jù)可知胰蛋白酶對(duì)蜣螂粉酶解水提液中-NH2的含量最高，其次是彈性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶，胃蛋白酶水提液-NH2的含量最少。

3.2 樣品水解度的測(cè)定

采用半微量凱氏定氮法測(cè)定1.000 0 g蜣螂粉中總氮量為29.57 mg。根據(jù)2.3下的水解度測(cè)定公式計(jì)算得出四種蛋白酶的水解度如圖1所示。

如圖1可知胰蛋白酶的水解度最大，DH=24.98%，其次是彈性蛋白酶DH=24.03%，胰凝乳蛋白酶DH=22.16%，胃蛋白酶的水解度最小，DH=13.95%。

圖1 四種蛋白丁敏的水解度Fig 1 Hydrolysis degree of four kinds of proteases

3.3 MTT法測(cè)定樣品對(duì)肺腺癌細(xì)胞A549的抑制率

不同濃度梯度下5種蜣螂粉水提液對(duì)肺腺癌細(xì)胞A549的抑制率曲線如圖2所示。橫坐標(biāo)為不同藥物的濃度(mg/ml)，縱坐標(biāo)為水解液對(duì)A549的抑制率(%)。由圖可知彈性蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶水解液對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞有明顯的抑制作用，且抑制率曲線呈上升趨勢(shì)，即抑制率隨濃度的增大而增大，而且抑制率顯著低于蜣螂粉水解液對(duì)照組。胃蛋白酶水提液對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞幾乎沒有抑制作用。

圖2 5種蜣螂水解液對(duì)乳腺癌MFC-7細(xì)胞的抑制曲線Fig 2 Inhibition curves of 5 kinds of Catharsius hydrolysate on on lung adenocarcinoma A549

4 討 論

經(jīng)研究表明，酶解提取工藝在中藥領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用，具有提取效果較好，周期短，反應(yīng)溫和等優(yōu)點(diǎn)。本次實(shí)驗(yàn)利用四種不同的酶將蜣螂粉酶解，在測(cè)定水解度的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用MTT法來檢測(cè)抗腫瘤活性。結(jié)果表明，胰蛋白酶、彈性蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的水解度分別為26.62%、24.99%、21.76%，在較低藥物濃度下，酶解蜣螂粉對(duì)肺腺癌A549無明顯抑制作用，而在較高濃度下，酶解蜣螂粉對(duì)肺腺癌A549的抑制率大小中，胰凝乳蛋白酶>彈性蛋白酶>胰蛋白酶。其次在用MTT法測(cè)定5種蜣螂提取物對(duì)肺腺癌細(xì)胞A549的抑制率試驗(yàn)中，酶解液對(duì)肺腺癌A549的抑制效果均低于未酶解的水提液，酶解蜣螂的藥理性活性顯著降低的原因可能是：發(fā)生藥理活性的物質(zhì)不同。與酶解其他中藥蟲類藥物不同的是在酶解中藥蜣螂時(shí)，使蜣螂的大分子蛋白降解為小分子的多肽、寡肽，使能發(fā)揮藥理活性的大分子蛋白遭到破壞，進(jìn)而藥理活性降低。

本研究表明，水解度與抗腫瘤活性無直接相關(guān)性，因?yàn)槊附庀喈?dāng)于在體外模仿人體胃腸道對(duì)藥物的作用效果因此說明以中藥蜣螂粉為有效成分的藥物，經(jīng)口服后在對(duì)肺腺癌A549的治療上無顯著的作用。為下一步蜣螂抗腫瘤活性成分及蜣螂加工方法的改進(jìn)提供新思路，為臨床用藥提供新途徑。

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